マシューオサリバンと飛洲は、オーストラリア国立保健医療研究審議会大学院医学研究奨学金の受取人です。

慎重な検討がプライマーとプローブの設計を考慮する必要があります。 、GenBank等のデータベースから目的のターゲットのすべての利用可能な配列は、適切なターゲットとなって保存された領域を識別するために利用されるべきである。膨大な数のターゲットは、単一のmPCRアッセイで増幅されている場所、それぞれ増幅された配列は、同じような長さでなければならない、との競争を避けるために、300塩基対を超えてはいけません。方法の別のアプリケーションが保存された領域に対するプライマーを使用して1つのより長いターゲットを増幅するとアンプリコン内配列変異を識別するために、複数のプローブを使用することです。このインスタンスでは、増幅されたPCR産物は、長くなることがあります。プライマーのアニーリング温度はすべてそれに応じて調整のPCR条件で、同様にする必要があります。強い二次構造やプライマーダイマーを形成するプライマーは避ける必要があります。シグマアルドリッチDNA計算機（ <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.aspは</a> ）確実にこれらの機能を予測するために使用することができます。 DNAプローブは、60に近い温度℃をアニーリングしているように設計する必要があります特異性を最大にするには、関心の各ターゲットの2つのプローブは、アッセイでリバースプライマー結合部位に隣接する前方にDNA鎖にハイブリダイズするものを含まれており、フォワードプライマー結合部位に隣接する逆鎖に他のことができます。この場合、両方のフォワードおよびリバースプライマーは、ビオチン修飾でなければなりません。増幅された標的ごとに1つのプローブが使用されている場合は、その唯一の一方のプライマーは、ビオチンを変更する必要が。 mPCR / RLBアッセイ用のプライマーとプローブを設計するときそれを強くin vitroでの結果と相関することがPCR産物とプローブのハイブリダイゼーションを予測するインシリコメソッドで使用することをお勧めします。理想的には、これは全ゲノム配列が提供されている分離株を用いて行われます。このようなFastPCR（http://primerdigital.com/fastpcr.htmlで入手可能）などのソフトウェアは、この目的のために使用することができます。 インシリコ解析の低いプローブアニーリング温度で生じる塩基対のミスマッチを示してどこが弱いか存在しないプローブの信号を予測することができます。 DNAの抽出技術は、テストされているサンプルに応じて異なり、PCRの条件は、プライマーの設計に依存することになります。読者は、DNA抽出とPCRの試薬 ​​および条件1-19に関する詳細については、個々のアッセイに関する出版物と呼ばれています。 各アッセイは、少なくとも1つの正と負のプローブ膜上の各プローブの信号だけでなく、DNAフリーのコントロールを提供するために、適切なコントロールで実行されます。さらに、それはすべてのサンプル（：微生物の場合には、種や属特異的プローブなど）が陽性になることが予想される膜の上部にあるプローブを含めることが有益です。これは、ポジティブコントロールプローブとして機能するだけでなく、結果の簡単なオリエンテーションを許可します。 1。膜の調製<ol><li>以下のソリューションを準備します。 <ul><li> 100ミリリットル0.5M NaHCO3水溶液（pHは8.4） </li><li> 100ミリリットル0.5M NaHCO 3を </li><li> 20ミリリットル16％EDAC </li><li> 250ミリリットルの0.1 M NaOHを</li><li> 250ミリリットル2xSSPE </li><li> 250ミリリットル2xSSPE/0.1％SDS - 60℃水浴中での場所</li><li> 250ミリリットルの20mM EDTA。 </li></ul></li><li> 60℃に予熱オーブン</li><li> 70％エタノールでMiniblotter Immuneticsを清掃してください。 </li><li> 2 pmolの/μlと200μlのの容積の最終濃度0.5 M 炭酸水素ナトリウムのオリゴヌクレオチドプローブを希釈する。 </li><li> 15x15 cmまでBiodyneCナイロンメンブレンをカット。鉛筆と定規を用いて、膜の上部に0.5センチメートルスペースをオフに支配し、ここに詳細を記述します。 </li><li> 20mlでビニール袋のシール膜は、新鮮な10分間室温で16％のEDACのソリューションと岩を作った。 </li><li> 30秒間脱イオン水でメンブレンを洗浄してください。 </li><li>膜（鉛筆の線に平行）を介して実行されているチャンネルとminiblotterのメンブレン。場所と密接なブロッターにサポートクッションを置く。チャネルから流体を吸引除去する。 </li><li> 150μlの0.5 M NaHCO 3でレーン1と45を埋める。気泡に注意しながら、シーケンスのレーン2-44を埋めるために、各プローブ溶液150μlを使用する。気泡が所定の位置にピペットを維持、チャンネルに表示されない場合は、速やかに空気の泡が再試行して、ピペットの上に浮くようにするソリューションを吸引除去する。室温で5分間インキュベートする。 </li><li>プローブ溶液を吸引、膜を除去し、9分、室温で250 mlの0.1 M NaOH中で洗う。 </li><li> 30秒間の250 mlの2xSSPEで膜を洗浄してください。 </li><li> 60℃のオーブンで250ミリリットル予め温めておいた2xSSPE/0.1％SDS中でメンブレンを洗浄℃で5分間。 </li><li> 20分（残りの10ミリリットルを予約）を、室温で240ミリリットルの20mM EDTAでメンブレンを洗浄、直ちにハイブリダイゼーションに使用されていない場合は、残りの10ミリリットルの20mM EDTAおよびSTORとビニール袋の膜をシール4で冷蔵庫内の電子℃に</li><li>洗剤とブラシをPyronegでminiblotterを洗ってください。すすぎ、乾燥させます。 </li></ol> 2。ハイブリダイゼーションと検出<ol><li>以下のソリューションを準備します。 <ul><li> 250ミリリットル2xSSPE/0.1％SDS - 60水浴で店舗℃に</li><li> 500ミリリットル2xSSPE/0.5％SDS - 60の水浴中で店舗° C </li><li> 500ミリリットル2xSSPE/0.5％SDS - 42℃のオーブンで店舗° C </li><li> 500ミリリットル2xSSPE - 室温に保つ</li><li> 500ミリリットル1％SDS - 60の水浴中でストア° C最初に（ステップ3） </li><li> 250ミリリットルの20mM EDTA - 室温で保管（ステップ3）。 </li></ul></li><li> ° Cと42対1℃のオーブンで60に一つオーブンの電源を入れホットプレート上で大きなビーカーに水を沸騰させる。 </li><li> 70％エタノールでMiniblotter Immuneticsを清掃してください。 </li><li>小さな容器に2xSSPE/0.1％SDSのアリコートを10ミリリットル。番号付きのチューブに150μlの2xSSPE/0.1％SDSに各PCR産物の20μlを添加する。 </li><li> 100 10分間のPCR産物を沸かし° C発泡スチロールホルダーを使用して。少なくとも5分間、直ちに氷上に置きます。 </li><li> 60で240ミリリットル2xSSPE/0.1％SDSを残りで膜を洗う℃で5分間オーブン。 </li><li>バッキングクッション付きminiblotterのメンブレン。親しませるためのチャンネルは（垂直鉛筆の線に）垂直に実行。 </li><li> miniblotterチャネルから吸引過剰の液体。 </li><li>最初と最後のチャンネルに、残りの150μlを2xSSPE/0.1％SDSを追加。気泡に注意しながら、シーケンスの残りのチャンネル（2-44）にゆでPCR産物を追加。 </li><li> 60の平坦な場所のminiblotterハイブリダイゼーションが行われるように1時間℃のオーブン。 </li><li>その後miniblotterから膜を除去する、各チャンネルから液体を吸引除去する。 </li><li> 10分間60℃のオーブンで温めておいた250ミリリットル2xSSPE/0.5％SDSで2回洗浄する。 </li><li> ° C、42で2xSSPE/0.5％SDSとナイロン分離メッシュを湿らせ、膜をロールアップするために使用します。 </li><li>場所は、ローラーのチューブに膜をロールアップ、および膜の内面に当接することを確認するために繰り広げる。 ° Cとローラチューブに追加42で15ミリリットル2xSSPE/0.5％SDSに3μlのストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体（ロシュダイアグノスティックス）を追加します。蓋をきちんと締めると42でローラーのオーブンでインキュベート° Cで60分間。ロールの方向が膜が締めしないようになっていることを確認します。漏れがないか定期的に確認してください。 </li><li>洗剤と水をPyronegでminiblotterを洗い、すすぎ、乾燥させてください。 </li><li>ローラーチューブから膜を取り外します。 42で2xSSPE/0.5％SDSを残り° Cで1​​0分間で2回洗浄する。 </li><li> 5分間室温で2xSSPEで2回洗浄する。 </li><li> 80 ° Cとプリ暖かいのオーブンの場所500ミリリットル1％SDSをオーブン回し。 </li><li> 15ミリリットルアマシャムのECL検出液（溶液の7.5 mlと溶液Bの7.5 ml）を構成しています。 2xSSPEを破棄し、検出ソリューションを追加します。ソリューションと膜の完全なカバレッジを確保する2分間手で軽く揺すり。化学発光液を捨て。 </li><li>露出のカートリッジに合わせてプラスチック製の透明性の二枚をカット。露出のカートリッジに2つのシートと場所の間に膜を置きます。 </li><li>暗室に進んでください。赤色光のもとで、カートリッジにECL検出フィルムを追加し、5分間さらす。表示するときに正しい向きを可能にするために取り外し時にフィルムの犬の耳の右下隅。 </li><li>あたりの製造者の指示のような自動化された開発者や化学風呂付きフィルムを開発する。 </li><li>必要に応じてより長いまたはより短い露光時間で露光を繰り返します。 </li></ol> 3。膜の再生<ol><li> ° Cで30分間二回80で250 mlの1％SDSで洗浄します。 </li><li>室温で15分間240ミリリットルの20mM EDTAで細胞膜を洗浄してください。 </li><li> 10ミリリットルの20mM EDTAとビニール袋の膜をシールし、4℃℃に冷却将来の再利用のためにCを。 </li></ol> 4。代表的な結果： 結果は、最高の印刷されたグリッド上にフィルムを置くこと、または他の画像をスキャンし、そのようなBioNumerics（応用数学、シントマルテン- Latemの、ベルギー）などのソフトウェアにインポートして表示されています。各プローブの結果は、ポジティブとネガティブコントロールプローブを参照して解釈されるべきである。結果は最高の、負の弱いまたは正として評定されます。信号が同じくらい強いまたは陽性対照プローブよりも強いです肯定的な結果は次のとおりです。信号が存在しないか、ネガティブコントロール（バックグラウンド信号の場合）に等しくなる負の結果は次のとおりです。弱い結果は、信号がポジティブコントロールプローブより暗いが、陰性対照よりも強いているところです。弱い結果は弱いプローブの結合、またはプライマーダイマーの形成から、非特異的シグナルのためにつながる点突然変異の結果である可能性があります。興味の対象ごとに2つのプローブを使用すると、単一の弱い結果が安全に非特異的なシグナルとして解釈することができる特異性を、向上させることができます。何か疑問が残っている場合は、シングルプレックスPCRの反応はどんなアンプのゲルベースの​​検出およびシークエンシングを行うことができます。結果は真に正であるかどうかを判断するために製品をlified。代表的な結果は図2に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。mPCR / RLB原則（P1）は、ステップ1.9。アミン修飾されたプローブは、ナイロンメンブレンに共有結合されています。 （P2）ステップ2.10。ビオチン修飾したPCR産物はプローブにハイブリダイズさせる。 （P3）ステップ2.14。パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンは、膜をインキュベートし、ビオチンに結合する。 （P4）2.19から2.21までを繰り返します。ペルオキシダーゼは、光感応膜が露出しているため光を生成する、ECL検出試薬の反応を触媒する。メンブレンを再利用のために洗浄する。 <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。代表mPCR / RLB結果。 〜6サンプル1はポジティブコントロールを表します - それらの間に43のプローブごとに少なくとも1つの正プローブ信号があります。各標的配列は、（U経由で）特異性を最大化するために二つの異なるプローブで検出される。プローブA1とA2は、それぞれのサンプルが陽性になるとフィルムの向きを支援すると予想される種特異的プローブを表しています。プローブA1は、膜の下部に繰り返されます。サンプル7と8はネガティブコントロールです。プローブのQ1は、Q2、T1とT2は、プライマーまたはプライマーダイマーの製品の可能性非特異的結合を示し、ネガティブコントロールのシグナルを持っていることに注意してください。これらのプローブまたはプライマーの再設計が必要になります。プローブC1、D1およびストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体や化学発光基質のいくつかの非特異​​的取り込みに起因する可能性が膜を横切ってストリーキングF1ショーが、しかしこれは容易に真陽性プローブ​​信号と区別される。プローブのD1とD2は、他のプローブに比べて相対的に弱い信号を持っている、これはあまり効率的な増幅につながる大きなアンプリコンが原因である可能性があります。プローブJ2は負であり、プローブJ1が正のいくつかのサンプル（1、3、4、6、39）です。これは、多くの場合、これらのサンプルのJ2結合部位に変異を表します。

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	<li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp.">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li><li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li><li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li><li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+(SCCmec)+typing.">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li><li>O'Sullivan, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia.">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+(mPCR/RLB)+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens.">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li><li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

mPCR / RLB方法は、PCRアンプリコンの多数の同時検出を可能にする。ために化学発光プローブベースの検出の高感度で、プライマーペアの数が多い単一のマルチプレックスPCR反応はDNAテンプレートを増幅するために使用することができます。 は、プローブ信号が一つ以上のサンプルで得れていない場合は、残りのPCR産物をゲル電気泳動を行うと、問題はPCR増幅やプローブのハイブリダイゼーションになっているかどうかを区別することができます。膜上のすべてのプローブ信号が弱いか存在しないが、ゲル電気泳動が成功したPCR増幅を示す場所、可能性は膜の標識の問題、前使用後の膜の不正確な再生、ハイブリダイゼーションまたはストレプトアビジンのインキュベーション時に間違った温度、または不良品が含まれストレプトアビジンをペルオキシダーゼ結合体または検出試薬。 コントロールサンプルは、個々のプローブは偽陰性の信号を生成できることを示している場合は、ゲルベースの​​検出とそれに続くシーケンスを持つ単一のPCRは、PCR産物の増幅を確認するために、プローブ結合部位での配列変化を探すために実行することができます。弱いか存在しないプローブの信号は、大型アンプリコンの大きさに起因する可能性があります：可能であればすべてのアンプリコンは、同様の長さ未満の300bpのはずです。アンプリコンの二次的なDNA構造はまた、貧しい人々のプローブの結合が生じ​​ることがありますし、プライマーの再設計を必要になる場合があります。個々のプライマーまたはプローブ濃度は、信号強度を最適化するために変えることができる。 nonamplifiedプライマーやプライマーダイマーの生成物の結合プローブに起因する偽陽性シグナルは、ゲルベースの​​検出とそれに続くシークエンスで、単一のPCRを行うことにより調べることができます。この問題が発生した場合は、プローブの再設計を余儀なくされることがあります。プローブ結合部位の点変異が弱いか、または存在しない信号につながる可能性があります。各増幅産物のための2つのプローブを許可することで検出するためにこの簡単に行うことができます。この特性は、ターゲットDNAのわずかな配列の変化を検出するために慎重なプライマーとプローブの設計と悪用される可能性があります。 利用可能な製品の検出以下のマルチプレックスPCRの反応の多くのメソッドが存在する間は、要約すると、、mPCR / RLBは、高スループットと低設定、コストと安価であるという利点を持っています。メソッドの柔軟性は、幅広い用途にその使用を許可します。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> 5&#39;アミンC6は、オリゴヌクレオチドプローブを修正</td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S - 8875 </td><td> 0.5M溶液は、pHを8.4にアップしました</td></tr><tr><td> NaOHで</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5881 </td><td> 0.1Mソリューション</td></tr><tr><td> 20xSSPEバッファ</td><td> Amresco </td><td> 0810 - 4L </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L - 4390 </td><td> 10％ストック溶液を構成する、オートクレーブしないで、使用前に1週間の最大のために維持する必要があります</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸（EDTA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E9884 </td><td> pHは8.0とオートクレーブに調整0.5M溶液を作る</td></tr><tr><td> N -（3 - ジメチルアミノプロピル）- N&#39; - エチルカルボジイミド塩酸塩（EDAC） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E7750 </td><td> 3.2グラムのEDACと18ミリリットルミリポア水を使用して、使用直前に20ミリリットル、16％のソリューションを構成する</td></tr><tr><td> BiodyneC0.45μmのナイロンメンブレン20 × 20センチメートル</td><td> PALLライフサイエンス</td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td>脱イオン、精製水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体Pyronegの洗剤</td><td>ジョンソンダイバー</td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体</td><td>ロッシュ</td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td>アマシャムのECL検出試薬</td><td> GEヘルスケア</td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td>アマシャムのECL検出試薬</td><td> GEヘルスケア</td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHPの透明フィルム</td><td>コー​​ポレートエクスプレス</td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td>アマシャムhyperfilm ECL高性能化学発光のフィルム18x24センチ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td>アイス</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1。mPCR / RLBアッセイで使用される消耗品。 <table border="1"><tbody><tr><th>機器</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> Hybaid Shake&#39;n&#39;Stackオーブン（2）圧延ボトルやナイロン分離メッシュ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> HBSNSRS220 </td><td>メソッドは、42でソリューションを維持するための施設がある限り、単一のオーブンで行うことができます° Cと60を使用する° C前</td></tr><tr><td>ベリーダンサーのロッキングプラットフォーム</td><td>ストーバル生命科学</td><td>ユーロBDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100 - 45 </td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸引</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>露出カートリッジ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> Z36 ,009 - 0 </td><td></td></tr><tr><td> X線フィルムの開発</td><td></td><td></td><td>また、暗い部屋ではなく、自動化のトレイに開発、定着液と水を使用することができます開発者。ルミノ-イメージャは、X線フィルムの代わりに使用することができます</td></tr></tbody></table> mPCR / RLBアッセイに必要な、表2。装備。

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

マルチプレックスPCR /リバースラインブロットハイブリダイゼーションアッセイは、再使用可能なナイロンメンブレン上のプローブのハイブリダイゼーションの前に1つのマルチプレックスPCR反応を用いて43試料の43分子標的までの検出を可能にする。プローブは、膜に固定できるように手を加えた5&#39;アミンです。プライマーは、ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼと感光膜を介して化学発光基質を用いてハイブリダイズしたPCR産物の検出を可能にする5&#39;ビオチン変更されている。低設定と消耗品のコストで、この技術は安価です（約2米ドルサンプルあたり）、高スループット（複数の膜を同時に処理することができます）と短いターンアラウンドタイム（約10時間）があります。 手法はいくつかの方法で利用することができる。複数のプローブは、単一の増幅産物の中で配列変異を検出するように設計することができる、または複数の製品は、その後の検出に使用するもの（またはそれ以上）のプローブで、同時に増幅することができる。両方のアプローチの組み合わせは、単一のアッセイ内でも使用することができます。単一の標的配列に対して複数のプローブを含める機能は、アッセイの特異性の高いです。 mPCR / RLBの公開アプリケーションは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 3-5およびサルモネラ SP 6、 肺炎球菌 7,8、 連鎖球菌agalactiae 9およびエンテロウイルス10、11、識別の分子血清型別を入力し、抗生物質耐性遺伝子の1,2の検出を含むマイコバクテリウム属12、性器13-15および気道16と他の17病原体と検出とmollicutes 18の識別の検出。しかし、技術の汎用性は、アプリケーションが事実上無限と微生物の分子解析に限定されるものではないことを意味します。 mPCR / RLBの5つのステップは）プライマーとプローブの設計、b）のDNA抽出とPCR増幅C）膜の調製、d）のハイブリダイゼーションと検出であり、膜のe）の再生。

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Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

43分子標的までの同時検出のための安価な、高スループットの方法が記載されている。 mPCR / RLBのアプリケーションでは、微生物のタイピングと臨床検体から複数の病原体の検出を含む。

マルチプレックスPCRおよび逆ラインブロットハイブリダイゼーションアッセイ（mPCR / RLB）

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K ビュー.  University of Sydney. 43分子標的までの同時検出のための安価な、高スループットの方法が記載されている。 mPCR / RLBのアプリケーションでは、微生物のタイピングと臨床検体から複数の病原体の検出を含む。

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Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

MCF - 7細胞株におけるNanogenomedicineの細胞毒性：MTTアッセイ

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

生物学

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

サーモサイエンティフィックのSolaris定量PCRアッセイを用いて定量的リアルタイムPCR

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.