これらのプロトコルは、2色ddPCRシステムを使用してSARS-CoV-2を検出するための社内マルチプレックスddPCRアッセイを開発するために使用できます。これは、SARS-CoV-2やその他の病原体を検出するための独自のキットを開発したい人に役立ちます。ゴールドスタンダードのRT-qPCRと比較して、RT-ddPCRは、標準曲線を必要とせずに複数のSARS-CoV-2遺伝子を定量するために使用できます。
ddPCRは新しい技術であるため、現在および将来のユーザーがSARS-CoV-2検出やその他の病原体のマルチプレックスアッセイを理解し、簡単に開発できるようにするには、視覚的なデモンストレーションが重要です。cDNA合成の場合は、2マイクロリットルの5X逆転写マスターミックス、5マイクロリットルの目的のRNAサンプル、および3マイクロリットルのRNaseフリー二重蒸留水を100または200マイクロリットルのPCRチューブに加え、溶液として最終容量10マイクロリットルにし、チューブを氷上に置きます。試薬がオフになったら、サンプルをサーマルサイクラーにロードし、摂氏37度で15分間逆転写を実行し、摂氏85度で5秒間逆転写を熱失活させ、摂氏4度で最終的な無限ホールドを実行するように装置を設定します。
液滴デジタルPCRを実行する前に、19.8マイクロリットルの新たに調製したマスターミックスを、ヌクレアーゼフリーの96ウェル液滴デジタルPCRプレートの適切な数のウェルに追加します。マスターミックスの各ウェルに2.2マイクロリットルのcDNAを加え、ウェルあたり22マイクロリットルの反応ミックスの最終容量にし、使い捨てPCRプレートシーラーでプレートを密封します。次に、プレートを遠心分離機で15〜30秒間ボルテックスし、プレートの底部にあるウェル内容物を回収する。
自動液滴発生器のタッチスクリーンで液滴を自動生成するには、サンプルプレートの設定をクリックし、サンプルプレート上のサンプルが配置されているカラムを選択します。[OK]をクリックして、自動液滴発生器ドアを開きます。実験に必要なサンプルや液滴生成プレートなど、装置内の各場所にセットし、ドアを閉めます。
タッチスクリーンが緑色に変わり、すべての材料が正しい位置にロードされたことを示したら、プローブ用のオイルを選択し、液滴の生成を開始します。画面に表示されている時間に従って、液滴の生成が完了するのを待ちます。画面に「液滴の準備ができました」と表示されたら、ドアを開けて液滴を含むプレートを取り出し、プレートシーラーを摂氏180度で5秒間使用して、穴の開いたホイルシールでプレートをシールします。
液滴生成から30分以内に、密封された液滴プレートを96ディープウェルサーマルサイクラーに入れます。サンプル量を40マイクロリットルに設定し、蓋の温度を摂氏105度に設定します。次に、PCRは液滴を増幅します。
液滴読み取りの場合、増幅後、サーマルサイクルされた96ウェルプレートを液滴リーダーに移し、液滴リーダーに接続されたコンピューターで付属のソフトウェアを開きます。セットアップ モードから [新規] を選択し、任意のウェルをダブルクリックして [ウェル エディタ] ダイアログ ボックスを開きます。読み取るウェルを選択し、実験を絶対定量、スーパーミックスから液滴デジタルPCRスーパーミックス用プローブに設定します。
1 つのタイプをチャネル 1 不明にターゲットにし、2 つのタイプをチャネル 2 不明にターゲットにします。プレートレイアウトに基づいてサンプル名を割り当て、[適用]と[OK]をクリックします。テンプレートを保存したら、[実行] をクリックします。
ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、FAM / HEXカラーを選択します。データ収集の最後に、リーダーからプレートを取り外します。データを解析する前に、すべてのウェルのデータをチェックして、液滴の総数を取得します。
そして、陽性または陰性の結果としてカウントされる液滴の最小数を受け入れるようにカットオフを設定します。シンプレックスおよびデュプレックスアッセイ解析の場合は、解析するQLPファイルをダブルクリックし、解析を選択します。1D振幅および2D振幅閾値ツールを使用して、ノードテンプレートコントロールとポジティブコントロールサンプルをガイドとして使用して、正しいチャネル内の各ウェルの正液滴と負液滴を区別します。
次に、追加の分析のために結果を CSV ファイルとしてエクスポートします。トリプレックスプローブミックスアッセイの場合は、QLPファイルを開き、プレートエディタータブで分析するウェルを選択します。実験タイプをダイレクト定量に設定し、アッセイをプローブミックストリプレックスに設定し、ターゲット名を入力します。
次に、[適用] をクリックします。グラフツールを使用して、クラスターウィンドウの選択ポップアップの提案の指示に従って、異なるターゲットクラスターに特定の色を割り当てます。すべてのターゲットカラーが割り当てられると、定量データがウェルデータウィンドウに表示されます。
ダウンストリーム分析用にデータを CSV ファイルとしてエクスポートします。四重鎖アッセイの場合は、実験タイプを直接定量に設定し、アッセイを振幅マルチプレックスに設定します。ターゲット名を入力し、[適用] をクリックします。
グラフツールを使用して、クラスターウィンドウの選択ポップアップの提案の指示に従って、異なるターゲットクラスターに特定の色を割り当てます。すべてのターゲットカラーが割り当てられると、定量データがウェルデータウィンドウに表示されます。追加の分析のために、データを CSV ファイルとしてエクスポートします。
この代表的な温度勾配分析で観察されたように、デュプレックスアッセイを実行したときに、より高いニーリング温度は正の液滴と負の液滴を明確に区別することができませんでした。しかしながら、ひざまずく温度の低下と共に、正および負の液滴の間の最適な分離が達成された。2色のRT液滴デジタルPCR検出システムを使用すると、1つのサンプル内で1つ、2つ、3つ、および4つのSARS-CoV-2ターゲットを検出することができます。
テンプレートなしの対照サンプルを使用して陰性の液滴を見つけ、シンプレックスアッセイで負の閾値を設定するのに役立ちます。二重鎖アッセイでは、分析は個々のチャンネルまたは2D振幅で実行できます。高次マルチプレックスアッセイのデータ解析は簡単ではありませんが、トリプレックスプローブミックスアッセイでは最大8つの液滴クラスターを、四重振幅ベースのアッセイでは最大16の液滴クラスターを評価できるため、これらのアッセイは有用です。
開発するアッセイに応じて、正しいターゲットプライマーとプローブの濃度がマスターミックスに追加されていることを確認してください。この手順を使用して、新しいRT-ddPCRアッセイを開発するためにターゲットを交互にすることができます。このアッセイは、さまざまな研究目的や新興感染症の診断に使用できます。
開発以来、この技術は、さまざまな標準、人体、および環境サンプル中のウイルス核酸コピーの正確な測定に使用されてきました。
