この作品は、NIH（NINDS）からRO1助成金によってサポートされています。

1。注射の準備ウィルス<ol><li> rAAVsは推奨商用ベンダーから購入したが、彼らはまた、（下の説明を参照）自分の研究室で製造することができる。ウイルス溶液は、typicallyミリリットル当たり〜1 × 10 12ゲノムコピー（GC / ml）の力価で産生され、多数のセルを操作する完全な力価で使用することができる。また、彼らは疎ラベリングの必要なレベルを生成するために希釈することができる。適切な希釈は、ユーザによって決定される必要がありますが、1:10希釈液を開始することをお勧めします。 </li><li>使用直前に氷の上でウイルスを解凍。小（〜250μlの）のPCRチューブにウイルス液を所望の予備希釈量を転送する。組織培養フードに滅菌DPBSの適切な量を使用してウイルス溶液を希釈する。それが必要になるまで氷上に希釈したウイルス溶液を保管してください。 </li></ol>注記：すべてのウイルスの処理は、あなたの機関によって承認されたバイオ安全議定書に従って実施されるべきである 2。注射器の負荷と機器の組立<ol><li>静かにプランジャーを引いて、ガラスの注射器に装填針を接続し、PCRチューブからウイルスソリューションを策定する。空気の非常に小さな気泡が注射器で見ることができるまで、プランジャーを引いて、これは、ソリューションのすべてが注射器になっているとローディング針に残されていないことを示します。また、不活性少量の染料は、それが表示されるように溶液に添加することができます。 注：負荷の針は、通常、他のほとんどのチューブの底に到達する十分な長さではないとして、小さなPCRチューブを使用する必要があります。 </li><li>ローディング針を外し、シリンジの保持とそれを固定して、シリンジポンプのシリンジブロックに注射器を置きます。 </li><li>ゆっくりとシリンジに結合チューブの一端を挿入し、ニードルホルダーにもう一方の端を差し込みます。ニードルホルダに注射針を挿入します。注射針の端が直接ニードルホルダーの結合チューブの内側の端にお問い合わせください。 </li><li>徐々に結合チューブを介してソリューションをプッシュするために手動でプランジャーを押し下げる。ソリューションの小さな滴が注射針の先端に表示されるまで押し込みます。 </li><li>慎重にプッシャーブロックの隣にあるプランジャーを配置し、プッシャーブロックのブラケットで固定します。 </li><li>注入パラメータを設定します。注入速度は、約8μl/min（〜130nl /秒）でなければなりません;注入量は、通常、1 2ulであり、使用するシリンジのサイズに適したシリンジの直径を（ガイドラインについては、シリンジポンプの取扱説明書を参照してください）​​]を選択します。 </li><li> 〜38 ° Cにホットプレートを設定し、回復期に子犬を保護するためにペーパータオルなどの薄いバリアでカバー。 </li></ol> 3。注射の手順と子犬の回復<ol><li> IACUC承認されたプロトコールに従って、寒冷麻酔にそれらを施すことにより注射用P0またはP1仔マウスを準備します。氷の上で水と場所でいくつかのペーパータオルを湿らせます。子犬の希望数（4-5）ペーパータオルの上を（それらをうまく避けて保管すること）に置き、軽くそれらは湿らせたペーパータオルでカバーされるように子犬を介して、紙タオルを折りなさい。ゆっくりと紙タオルの上に砕いた氷を少量置き、約5分間子犬をインキュベートする。子犬は、最大15分間氷上に置き、その後、細かい回復することができます。 </li><li>子犬が十分に麻酔した後に、取り付けブロックの上に置いてください（私たちは通常は15ミリリットルチューブを保持している発泡スチロールのブロックを使用）し、注射部位への最適なアクセスのためにそれを配置します。皮質のためにそれは小脳のためにそれが頭蓋骨の後部へのよりよいアクセスを提供するために、ブロックの端の上の子犬の頭を配置するために有用である一方、その腹に動物のフラットをレイアウトするのが最も簡単です。必要に応じて子犬は、バンドエイドと所定の場所に固定されることがあります。 </li><li>針を手動でもう一方の手で、目的のサイトで頭蓋骨を介して挿入されている間片手での子犬の頭をホールド。注入時に動かないようにしっかり肌を引っ張っておくと便利です。皮質の場合、これは将来の注射に役立つので、このような頭蓋骨のラムダ縫合と同様に定義された解剖学的ランドマークの相対的な注射を、作るのに便利です。小脳は上丘へ直接尾横たわって組織の薄いストリップとして頭蓋骨を通して見ることができます。針を挿入するための深さは、個々の動物と系統間で若干異なりますし、針上の所定のマーカーによって測られることができる、しかし、皮質と小脳のために我々は、〜0.5の深さがわかります - 表面から1ミリメートルが通常適している。他のサイトのための挿入深さは、エンドユーザーが実験的に決定されるべきである。 注意：針は簡単に頭蓋骨を貫通してください。そうでない場合、これは動物を傷つけることができるようにむちゃするなよ。針の位置を変え、静かに再試行してください。 </li><li>ウイルス溶液を注入する。注入は開始です。ポンプのSTARTボタンを押すか、または使用される圧力インジェクタのモデルに応じて、フットペダルを押すことによってED。フットペダルのない状態で、それは注射に影響を与える可能性のある不必要な手の動きを最小限に抑えるためにボタンを押すと同僚を支援していることをお勧めします。 </li><li>選択したボリュームが注入された後、数秒間の場所に針を保持し、軽くスムーズにスライドさせて針を取り除く。余分な動きを最小限にする場所での子犬の頭を持つようにしてください。注入装置は、エタノールと傷と実験の間に洗浄し、滅菌されているので小さい場合、防腐剤の使用は不要です。 </li><li> ° Cの回復、通常、5〜10分間ウォームアップ〜38で設定された温度で覆われたホットプレート上で子犬を置きます。この期間中に、他の子犬を注入し続けることができます。 </li><li>子犬のすべてが回復した後に（彼らはピンクと動くはずです）自宅のベッドの部分を取り、そっとして子犬をこする。グループとして母親に子犬を返します。 </li></ol>注意：これは子犬が母にそれらを戻すために、グループとしてそれらを返す前に、暖かみのある家庭の寝具にさらされていることを確認する非常に重要です。これを怠ると、仔事故または殺害の母親になることがあります。 4。洗浄装置<ol><li>注入が完了し、子犬が自分の母親に返された後は、完全にアセトンまたは70％エタノールで注射器をロードすることによって、注射のセットアップを清掃してください。新鮮な溶液を毎回使用して、注射のセットアップを数回通過ソリューションをフラッシュします。これは、残りのウイルス液を除去し、沈殿になります。アセトンやエタノールは、蒸発する。 注意：アセトンを洗浄には望ましい、しかし、セットアップが等シアノアクリレート接着のようなあらゆるアセトンに敏感なコンポーネントを、使用している場合は、これらステップについては、70％エタノールを使用している。 </li><li>適切なバイオハザード容器に漂白剤と廃棄物と作業エリアを消毒する。 </li></ol> 5。分析<ol><li> IACUC承認された安楽死の方法を用いて所望の年齢で動物を生け贄に捧げる。灌流固定は、特に成人の動物で、感染した神経細胞の後の可視化を支援するために推奨されます。 </li><li>標準的な免疫染色​​の手順は、蛍光シグナルを増幅するために使用することができます。簡単に言えば、ビブラトームセクションをフローティングさ100μmのPBS +1％トリトンX - 100で透過処理し、PBS +1％トリトンX - 100を10パーセント正常ヤギ血清でブロックされます。セクションは4℃で一晩一次抗体℃で、洗濯、ブロッキングの追加が続くとのブロッキング溶液中でインキュベートする。セクションは、その後、室温で2時間二次抗体でブロッキング溶液中でインキュベートし徹底的に洗浄し、スライド上にマウントし、耐フェードマウントメディアで封入されています。凍結切片にもラベルが付いたニューロンを可視化するために使用することができます、しかし、内因性の蛍光が失われる可能性があります。 </li></ol> 6。代表的な結果： 成功した注射の手順では、観察可能な組織の損傷や動物の他の悪影響と、注射部位の領域の神経細胞の堅牢な感染を生成します。図1に示すように、感染の広がりは、様々な解剖学的部位にrAAV8 - Creリコンビナーゼを注射のCre -レポーターマウス（ROSA26R）12で観察することができます。このような皮質と上丘のような特定の地域、への注射は、一般的に隣接する領域（図1A - B）に最小限の拡散と局所感染を生成する。高力価のウイルス液を使用すると、この海馬のような隣接領域の感染症、、可能性が高い（図1A）を発行します。 ROSA26Rのレポーターマウス（図1C - D）の正中線でrAAV8 - Creの小脳注射に示すように典型的に、注射部位の近くに残っているまばらな感染症の低力価のウイルス液の結果、と注射。我々は、その感染を示唆し、rAAV8 - Creの注入後2日以内にROSA26Rレポーターマウスに組換えを再結合を観察している、とレポーター遺伝子の発現は、すべて比較的急速に発生する可能性があります。さらに、我々は正常にfloxed条件対立遺伝子を用いて非ROSA遺伝子座に遺伝子の欠失の効果を研究するためにこのテクニックを使用している、の結果が他の場所で公開されます。 感染した細胞の数は、注入されたウイルス液の力価と相関するはずである。例えば、小脳に異なる蛍光タンパク質を発現two rAAV8ウイルスの高力価のソリューションの組み合わせを注入すると、差動（図2A）ラベルが付いている多くのプルキンエ細胞に感染する。逆に、低力価のウイルス液を注入すると、単一の細胞（図2B）の可視化を支援するために疎な感染症になる可能性があります。蛍光標識されたニューロンは、新鮮なカット、生きている組織（図2B）で直接観察することができますまたはワイドフィールドまたは共同して、後で画像取得のための内因性蛍光シグナルを強化するために免疫染色を行うことができるnfocal蛍光顕微鏡（図2A、図3A - C）。最後に、rAAV8は細かいプロセスの強いラベル（図3A - C）と皮質でのニューロンの様々なタイプのに感染する能力です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> 図1：P0でrAAV8 - Creを注入したROSA26Rのレポーターマウスの脳におけるLacZ染色は、Creの活性と感染の場所を示しています。 <ol type="A"><li>高力価（1 × 10 12 GC / ml）を大脳皮質と上丘への注射を示すP14脳の広い分野矢ビュー。高力価のウイルスを使用すると、隣接する領域にも感染する可能性が高くなります。 </li><li> P14皮質の矢状断面では、ウイルスが拡散少ないとローカル感染を示して低力価（1 × 10 11 GC / ml）で注入。 </li><li>低力価との正中線（1 × 10 9 GC / ml）のウイルス液に注入P28の小脳のwholemountビューには、感染がスパースであると一般的に注射部位の近くに残っていることを示しています。 </li><li> C言語における小脳の正中矢状図）。一般的にプルキンエ細胞がrAAV8に感染していることに注意してください。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> 図2：蛍光タンパク質を発現rAAV8の高と低力価で注入によって小脳ラベリング。 <ol type="A"><li> EGFP（緑）とDsRed（赤色）を発現する2つのウイルスの混合感染したP21cerebellumの矢状断面。ウイルスの高力価のミックスは、プルキンエ細胞の多数に感染させた。 </li><li>非常に低力価のウイルス感染からのライブP14小脳のプルキンエ細胞は、解剖直後に撮像。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> 図3：rAAV8 - DsRedタンパク質によって皮質ラベリング。 rAAV8 - DsRedのP0に感染していたP21皮質の冠状セクションで皮質ニューロンの様々な型の例。

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L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介する新生児のウイルスの注射法では、生後脳の発達の研究のための生体モザイクで生成するための簡単かつ迅速な方法を提供します。方法は、プロジェクト6をターゲットに高スループットの遺伝子を介して行われているものとしてだけでなく、現在利用可能なfloxed対立遺伝子を利用しています。のCreのトランスジェニック発現の使用に比べて、この?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> rAAV8 - Creを、- GFP、- DsRedを、 </td><td>ベクトルバイオラボ</td><td> ＃7060、＃7061、カスタムオーダー</td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td>ハーバードポンプ11プラス</td><td>ハーバード装置</td><td> ＃702208 </td><td> （なしフットペダルのポート） </td></tr><tr><td>網膜色素上皮インジェクションキット</td><td>世界の精密機器</td><td> RPE - KIT </td><td>結合チューブ、注射針（36G）、及びニードルホルダーが含まれています</td></tr><tr><td> NanoFilシリンジ、100μlの</td><td>世界の精密機器</td><td> NANOFIL - 100 </td><td>再利用可能なローディング針を含んで</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP抗体</td><td>鳥綱</td><td> GFP - 1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRedタンパク質抗体</td><td>クロンテック</td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td>加熱ブロック</td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26Rマ​​ウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

神経回路が成熟し、洗練されているときに正常な脳の機能は、生後発達にだけでなく、主要な神経経路が確立されている胚発生に依存していますが、。この段階での制御ミスは、自閉症や統合失調症の1,2などの神経および精神疾患につながる可能性があります。多くの遺伝子は出生前の脳で勉強し、多くの発達過程3-5重要な発見されている。しかし、出生後の脳におけるそれらの機能は、マウスでそれらの欠失はしばしば新生児の開発中に致死性につながることもあり、あまり知られていない、と開発の初期段階でそれらの要件は、出生後の分析を阻害する一因。これらの障害を克服するために、これらの遺伝子のfloxed対立遺伝子は、現在マウス6で生成されています。するときは、特定の細胞型で発現するCreリコンビナーゼ、条件付きの削除は生後脳における遺伝子機能を研究するために達成することができることをトランスジェニック対立遺伝子と組み合わせる。しかし、この方法では、それによってマウスの脳内で大規模に遺伝子解析の拡大を制限し、追加の対立遺伝子と適切な遺伝子型を有するマウスを作製するために余分な時間（3〜6ヵ月）が必要です。 ここでは、生後脳の発達で急速にかつ体系的にこれらのfloxed対立遺伝子を研究するためにウイルスにより発現するCreを使用して補完的なアプローチを示しています。新生児の脳の中に組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）7,8エンコーディングCreを注入することにより、我々は脳の異なる領域に目的の遺伝子を削除することができます。ウイルス力価を制御し、蛍光タンパク質マーカーを共発現することにより、我々は同時にモザイクの遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングを実現することができます。このメソッドは、分岐、およびタイルだけでなく、シナプス形成と洗練された、開発の初期段階で多くの遺伝子の要件をバイパスし、私たちは軸索と樹状突起の成長を含む生後脳の発達の多くの重要なプロセスでそれらの細胞自律的な機能を、勉強することができます。このメソッドは、我々自身の研究室（未発表の結果）など8,9で正常に使用されており、このようなレンチウイルス9など他のウイルス、、するだけでなく、shRNAまたは支配的に活性なタンパク質10の表現に拡張することができます。さらに、電気生理学でこのテクニックを組み合わせるだけでなく、最近開発した光イメージングツール11で、この方法では、遺伝的経路はマウスとラットにおける神経回路の発達と機能にどのように影響するかを研究する新たな戦略を提供します。

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

アン<em&gt; in vivoで</em出生後の脳における遺伝子機能をテストする&gt;方法が記載されている。 CREおよび/または蛍光タンパク質を発現する組換えAAVsは、新生児マウスの脳に注入されています。モザイク遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングは神経回路の発達に重要なプロセスで遺伝子機能の迅速な分析を可能にする、達成されています。

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K ビュー.  Keck School of Medicine, University of Southern California. アン in vivoで方法が記載されている。 CREおよび/または蛍光タンパク質を発現する組換えAAVsは、新生児マウスの脳に注入されています。モザイク遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングは神経回路の発達に重要なプロセスで遺伝子機能の迅速な分析を可能にする、達成されています。

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Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

神経科学

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

子供の脳磁図を用いた脳機能の研究

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

要約

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この動画の章

非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

子宮内エレクトロポレーションマウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウムイメージング

子供の脳磁図を用いた脳機能の研究

生産・精製・アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

ウイルスベースのCre組換えによる出生後のマウスの脳の発達における遺伝子機能のモザイク解析

要約

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非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

CLARITY / CUBIC技術を用いたマウスの脊髄にセロトニン繊維のイメージング

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

子供の脳磁図を用いた脳機能の研究

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

子宮内エレクトロポレーションマウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウムイメージング

生産・精製・アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理