Este trabalho é apoiado por uma bolsa de RO1 NIH (NINDS).

1. Vírus Preparação para a injecção <ol><li> rAAVs foram comprados do fornecedor recomendado comercial, mas também podem ser produzidos em um laboratório do próprio (ver discussão abaixo). A solução vírus normalmente é produzido em um título de ~ 1x10 12 cópias do genoma por mililitro (GC / ml) e pode ser usado na titulação completa para manipular um grande número de células. Alternativamente, eles podem ser diluídas para produzir o nível desejado de rotulagem esparsas. Uma diluição adequada deve ser determinada pelo usuário, mas uma diluição de 1:10 é recomendado para começar. </li><li> Descongelar vírus no gelo imediatamente antes da utilização. Transferir o desejado volume pré-diluição da solução de vírus em uma pequena (~ 250μl) Tubo de PCR. Diluir a solução de vírus usando um volume adequado de DPBS estéril em uma capa de cultura de tecidos. Loja vírus solução diluída no gelo até que seja necessário. </li></ol> NOTA: manipulação de todos os vírus devem ser conduzidos de acordo com um protocolo de biossegurança aprovada pela sua instituição 2. Carregamento da seringa e montagem de equipamentos <ol><li> Conecte a agulha de carregamento para a seringa de vidro e elaborar o vírus solução do tubo PCR puxando o êmbolo. Puxar o êmbolo até uma bolha muito pequena de ar pode ser visto na seringa, o que indica que toda a solução está na seringa e não é deixado na agulha de carga. Alternativamente, uma pequena quantidade de corante inerte pode ser adicionado à solução para torná-lo visível. NOTA: Um tubo de PCR pequenos devem ser utilizados como a agulha de carregamento normalmente não é o suficiente para alcançar o fundo da maioria dos outros tubos. </li><li> Remova a agulha de carga e coloque a seringa no bloco de seringa de uma bomba de seringa, prendendo-o com o retentor seringa. </li><li> Gentilmente insira uma extremidade do tubo conjuntivo para dentro da seringa; insira a outra extremidade no porta-agulha. Inserir a agulha de injeção no suporte da agulha. O fim da agulha da injecção deve contatar diretamente o final do conjuntivo dentro da tubulação do titular da agulha. </li><li> Pressione o êmbolo lentamente manualmente de empurrar a solução através do tubo conectivo. Empurre-a até uma pequena gota de solução é visível na ponta da agulha de injeção. </li><li> Atentamente a posição do êmbolo ao lado do bloco empurrador e segura-lo no lugar com o suporte de bloco empurrador. </li><li> Definir os parâmetros de injeção: taxa de injeção deve ser de aproximadamente 8μl/min (~ 130nl / s), volume de injeção é normalmente 1-2ul, selecionar o diâmetro da seringa apropriada para o tamanho da seringa você está usando (consulte o manual de bomba de seringa para orientações). </li><li> Definir a chapa para ~ 38 ° C e cubra com uma toalha de papel ou outras fina barreira para proteger os filhotes durante a fase de recuperação. </li></ol> 3. Procedimento de injeção e recuperação filhote <ol><li> Prepare P0 ou P1 filhotes de rato para injeção submetendo-os à anestesia fria seguir um protocolo IACUC aprovado. Umedeça um papel toalha poucos com a água e colocar no gelo. Coloque o número desejado de filhotes (4-5) sobre a toalha de papel (mantê-los bem separados) e gentilmente dobre as toalhas de papel sobre os filhotes assim que são cobertos por uma toalha de papel úmido. Delicadamente, coloque uma pequena quantidade de gelo picado por cima das toalhas de papel e incubar os filhotes por cerca de 5 minutos. Os filhotes podem ser mantidos em gelo por até 15 minutos e recuperar bem depois. </li><li> Após o filhote está suficientemente anestesiado, colocá-lo em um bloco de montagem (usamos um bloco de isopor, que normalmente mantém tubos 15ml) e posicioná-lo para melhor acesso ao local da injeção. Para o córtex é mais fácil colocar o apartamento animal à sua barriga, enquanto que para o cerebelo é útil para posicionar o filhote de cachorro da cabeça sobre a borda do bloco para melhorar o acesso à parte traseira do crânio. O filhote pode ser fixado no local com um band-aid, se desejar. </li><li> Segure o filhote a cabeça no lugar com uma mão enquanto a agulha é inserida manualmente através do crânio no local desejado com a outra mão. É útil para puxar a pele firmemente para evitar que se mova durante a injeção. Para o córtex é útil para fazer as injecções em relação a uma região anatômica bem definida, como a sutura lambda do crânio, pois isso ajuda em injecções futuro. O cerebelo pode ser visto através do crânio como uma fina tira de tecido que estão diretamente caudal ao colículo. A profundidade a que a agulha deve ser inserida varia ligeiramente entre animais individuais e as tensões e pode ser aferido por meio de marcadores pré-determinado na agulha, no entanto, para o córtex e cerebelo, descobrimos que uma profundidade de ~ 0,5 - 1mm da superfície é normalmente adequada. A profundidade de inserção de outros sites devem ser determinados experimentalmente pelo usuário final. NOTA: A agulha deve penetrar facilmente o crânio; se não, NÃO forçar muito, pois isso pode ferir o animal. Reposicionar a agulha e delicadamente, tente novamente. </li><li> Injetar o vírus solução. A injeção é começared pressionando o botão START na bomba ou deprimente um pedal, dependendo do modelo de pressão injector usado. Na ausência de um pedal é recomendável ter um colega ajudar com pressionando o botão para minimizar os movimentos das mãos desnecessárias que podem afetar a injeção. </li><li> Depois de o volume selecionado foi injetado, manter a agulha no lugar por alguns segundos e depois remova cuidadosamente a agulha, deslizando-o para fora sem problemas. Não esqueça de segurar o filhote a cabeça no lugar para minimizar os movimentos estranhos. Desde o equipamento de injeção é limpo e esterilizado entre experimentos com etanol ea ferida é pequena, o uso de anti-séptico é desnecessário. </li><li> Coloque o filhote no fogão coberto com o ajuste de temperatura a ~ 38 ° C para aquecê-la para a recuperação, minutos tipicamente 5-10. Durante este tempo você pode continuar injetando outros filhotes. </li><li> Depois de todos os filhotes tenham recuperado (eles devem ser rosa e em movimento) tomar uma parte da cama em casa e esfregar suavemente os filhotes com ele. Devolver os filhotes para a mãe como um grupo. </li></ol> NOTA: É muito importante certificar-se os filhotes são quentes e expostos a cama em casa antes de devolvê-los para a mãe e para devolvê-los como um grupo. Não fazer isso pode resultar na mãe ferir ou matar os filhotes. 4. Limpeza de equipamentos <ol><li> Após a injeção é completa e os filhotes foram devolvidos para a mãe, limpa a configuração de injeção a plena carga a seringa com acetona ou etanol 70%. Lavar a solução com os tempos de injeção de configuração várias, utilizando solução nova a cada vez. Isto irá remover qualquer vírus solução restante e precipitados. A acetona ou etanol, então evaporar. NOTA: A acetona é o preferido para a limpeza, mas se a sua instalação usa acetona quaisquer componentes sensíveis, como adesivos de cianoacrilato, em seguida, usar álcool 70% para essas etapas. </li><li> Desinfetar a área de trabalho com os resíduos de lixívia e descarte em um recipiente adequado de risco biológico. </li></ol> 5. Análise <ol><li> Sacrifício dos animais na idade desejada utilizando um método de eutanásia IACUC aprovado. Fixação de perfusão é recomendada para auxiliar na posterior visualização dos neurônios infectados, principalmente em animais adultos. </li><li> Procedimentos de imunomarcação padrão pode ser usado para amplificar o sinal fluorescente. Resumidamente, 100 mm flutuante seções vibratome são permeabilizadas com PBS 1% Triton X-100 e bloqueada em PBS 1% Triton X-100 soro de cabra 10% normal. Seções são incubados em solução de bloqueio com anticorpos primários overnight a 4 ° C, seguido de lavagem e adicionais de bloqueio. As seções são então incubadas em solução de bloqueio com anticorpos secundários por 2 horas em temperatura ambiente, lavados, montados em lâminas e lamínulas com anti-fade meios de montagem. Criosecções também pode ser usado para visualizar os neurônios rotuladas, porém a fluorescência endógena pode ser perdida. </li></ol> 6. Resultados representativos: Um procedimento de injeção de sucesso irá produzir infecção robusta de neurônios na região do local de injecção, sem danos aos tecidos observáveis ​​ou outros efeitos nocivos sobre o animal. Como ilustrado na figura 1, a disseminação da infecção pode ser observado na Cre-repórter camundongos (ROSA26R) 12 injetados com rAAV8-Cre em vários sítios anatômicos. Injeções em regiões específicas, como córtex e colículo superior, normalmente geram infecções locais com spread mínimo para regiões adjacentes (Fig. 1A-B). Uso de solução de alta titulação do vírus torna a infecção de áreas adjacentes, tais como o hipocampo, o mais provável (Fig. 1A). Injeção com baixo título resultados vírus solução em infecção esparsos, que normalmente permanece perto do local da injeção, como mostrado na injeção cerebelar de rAAV8-Cre na linha média de ratos repórter ROSA26R (Figura 1C-D). Temos observado em camundongos recombinação repórter ROSA26R dentro de 2 dias após a injeção de rAAV8-Cre, sugerindo que a infecção, recombinação e expressão de genes repórter podem ocorrer de forma relativamente rápida. Além disso, temos utilizado com sucesso esta técnica para estudar os efeitos da deleção do gene em um locus não-ROSA usando um alelo floxed condicional, cujos resultados serão publicados em outros lugares. O número de células infectadas devem correlacionar com o título da solução injetada viral. Por exemplo, injetando uma mistura de soluções de alto título de dois rAAV8 vírus expressar diferentes proteínas fluorescentes para o cerebelo infecta muitas células de Purkinje que são diferencialmente marcada (Fig. 2A). Por outro lado, a injeção de uma solução de baixo título vírus pode resultar em infecção escassa para ajudar na visualização de uma única célula (Fig. 2B). Neurônios fluorescente etiquetado pode ser observada diretamente no corte fresco, o tecido vivo (Fig. 2B) ou pode ser submetido à imunocoloração para melhorar os sinais endógenos fluorescentes para aquisição de imagem mais tarde por campo-grande ou comicroscopia fluorescente nfocal (Fig. 2A, fig. 3A-C). Por último, rAAV8 é capaz de infectar uma variedade de tipos de neurônios no córtex com forte rotulagem dos processos fina (Fig. 3A-C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> Figura 1: LacZ coloração no cérebro de ratos repórter ROSA26R que foram injetados com rAAV8-Cre Cre em P0 demonstra a atividade eo local de infecção. <ol type="A"><li> Grande campo de visão sagital de um cérebro P14 mostrando alto título (1x10 12 GC / ml) injeções no córtex e colículo superior. O uso de vírus alto título torna mais provável que as áreas adjacentes também serão infectados. </li><li> Corte sagital da P14 córtex injetado com baixo título (1x10 11 GC / ml) de vírus demonstra uma infecção local com menos divulgação. </li><li> Uma visão wholemount de um cerebelo P28 injetado na linha média com título baixo (1x10 9 GC / ml) solução vírus mostra que a infecção é escasso e, normalmente, permanece perto do local da injeção. </li><li> Corte sagital da linha média do cerebelo em C). Note-se que geralmente apenas células de Purkinje são infectadas por rAAV8. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> Figura 2: rotulagem cerebelar por injeção com títulos altos e baixos de rAAV8 expressando proteínas fluorescentes. <ol type="A"><li> Uma seção sagital da P21cerebellum infectado com uma mistura de dois vírus expressando EGFP (verde) e DsRed (vermelho). Uma mistura de vírus de alto título foi usado para infectar um grande número de células Purkinje. </li><li> Uma célula de Purkinje no cerebelo P14 ao vivo de uma infecção viral muito baixa título imaged imediatamente após a dissecção. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> Figura 3: rotulagem Cortical por rAAV8-DsRed. Exemplos da variedade de tipos de neurônios corticais em cortes coronais de um córtex P21 que foi infectado por rAAV8-DsRed em P0.

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L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de injeção neonatal viral apresentado aqui fornece uma maneira simples e rápida de gerar em mosaicos vivo para o estudo do desenvolvimento do cérebro pós-natal. O método aproveita floxed alelos que estão atualmente disponíveis, bem como aqueles que estão sendo feitas através do Gene High Throughput Segmentação do projeto 6. Comparado ao uso da expressão transgênica de Cre, este método fornece uma maneira rápida de testar a função do gene em vários tipos celulares...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre, GFP-,-DsRed, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, ordem personalizada </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard Bomba 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (Nenhuma porta pedal) </td></tr><tr><td> Retinal Pigment Kit Injeção Epitélio </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> RPE-KIT </td><td> Conjuntivo contém tubos agulhas, injeção (36G) e porta-agulha </td></tr><tr><td> NanoFil Seringa, 100μl </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Inclui agulha carregamento reutilizáveis </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo GFP </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpo DsRed </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Bloco de aquecimento </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R do mouse </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Função normal do cérebro depende não só no desenvolvimento embrionário quando principais vias neuronais são estabelecidas, mas também sobre o desenvolvimento pós-natal quando os circuitos neurais são vencidas e refinado. Desregulação nesta fase pode levar a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, como autismo e esquizofrenia 1,2. Muitos genes foram estudados no cérebro pré-natal e encontrou crucial para muitos processos de desenvolvimento 3-5. No entanto, sua função no cérebro pós-natal é em grande parte desconhecida, em parte porque sua eliminação em ratos muitas vezes leva a letalidade durante o desenvolvimento neonatal, e em parte porque sua exigência no início do desenvolvimento dificulta a análise pós-natal. Para superar esses obstáculos, os alelos floxed desses genes estão sendo gerados em camundongos 6. Quando combinado com alelos transgênicos que expressam Cre recombinase em tipos específicos de células, eliminação condicional pode ser alcançado para estudar a função do gene no cérebro pós-natal. No entanto, este método requer alelos adicionais e tempo extra (3-6 meses) para gerar os ratos com genótipos adequados, limitando assim a expansão da análise genética para grande escala no cérebro do rato. Aqui nós demonstramos uma abordagem complementar que usa Cre virally-expresso para o estudo desses alelos floxed rápida e sistematicamente no desenvolvimento do cérebro pós-natal. Injetando recombinante vírus adeno-associado (rAAVs) 7,8 codificação Cre no cérebro neonatal, somos capazes de eliminar o gene de interesse em diferentes regiões do cérebro. Ao controlar o título viral e coexpressing um marcador da proteína fluorescente, que pode assegurar em simultâneo a inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsas. Este método ignora a exigência de muitos genes no início do desenvolvimento, e nos permite estudar a sua função de células autônomas em muitos processos críticos no desenvolvimento do cérebro pós-natal, incluindo o crescimento axonal e dendrítico, ramificação e azulejos, bem como a formação de sinapses e requinte. Este método tem sido utilizado com sucesso em nosso próprio laboratório (dados não publicados) e outros 8,9, e pode ser estendido a outros vírus, como lentivírus 9, bem como a expressão de shRNA ou dominante proteínas ativas 10. Além disso, ao combinar esta técnica com eletrofisiologia, bem como recém-desenvolvidas ferramentas de imagem óptico de 11, este método fornece uma nova estratégia para estudar como as vias genéticas influenciam o desenvolvimento do circuito neural e função em camundongos e ratos.

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Método para testar a função do gene no cérebro pós-natal é descrito. AAVs recombinante expressando Cre e / ou uma proteína fluorescente são injetadas no cérebro de rato neonatal. Inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsos são alcançados, permitindo a análise rápida da função dos genes em processos críticos para o desenvolvimento do circuito neural.

Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K visualizações.  Keck School of Medicine, University of Southern California. Um In vivo Método para testar a função do gene no cérebro pós-natal é descrito. AAVs recombinante expressando Cre e / ou uma proteína fluorescente são injetadas no cérebro de rato neonatal. Inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsos são alcançados, permitindo a análise rápida da função dos genes em processos críticos para o desenvolvimento do circuito neural.

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Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Neurociência

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic transplante de precursores interneurônio nos cérebros de Mouse pós-natal precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Estudando a função cerebral em crianças usando magnetoencefalografia

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Crônica implantação de matriz Electrocorticographic todo-cortical no sagui comum

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...