עבודה זו נתמכת על ידי מענק RO1 מ-NIH (NINDS).

1. וירוסים הכנה הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> rAAVs נרכשו מהספק מסחרי מומלץ, אבל הם יכולים גם להיות מיוצר במעבדה של עצמו (ראה דיון בהמשך). הפתרון וירוס מופק בדרך כלל כייל של ~ 1x10 12 עותקים בגנום למיליליטר (GC / ml) וניתן להשתמש בו בכל titer מלא לתפעל מספר גדול של תאים. לחלופין, הם יכולים להיות מדולל כדי לייצר את הרמה הרצויה של תיוג דלילה. דילול המתאים צריכה להיקבע על ידי המשתמש, אלא דילול 1:10 מומלץ להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי וירוסים על קרח מיד לפני השימוש. העברת הרצוי מראש דילול נפח פתרון וירוס לתוך קטן (~ 250μl) צינור PCR. לדלל את הפתרון וירוס באמצעות נפח המתאים DPBS סטרילי במנדף בתרבית רקמה. חנות פתרון וירוס בדילול מלא על הקרח עד שהוא צורך. </li></ol> הערה: הטיפול של כל הווירוסים צריכה להתנהל על פי פרוטוקול שאושר על ידי המוסד biosafety שלך 2. מזרק טעינה והרכבה ציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מחט המזרק כדי טעינת זכוכית לגבש את הפתרון וירוס מהצינור PCR על ידי משיכתו בעדינות על הבוכנה. משוך את הבוכנה עד בועה קטנה מאוד של אוויר ניתן לראות את המזרק, זה מצביע על כך כל הפתרון הוא המזרק ולא נשאר מחט הטעינה. לחלופין, כמות קטנה של צבען אינרטי ניתן להוסיף את הפתרון כדי להפוך אותו לגלוי. הערה: שפופרת קטנה PCR צריך לשמש את המחט טוען הוא בדרך כלל לא מספיק זמן כדי להגיע לתחתית של צינורות אחרים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט העמסה מקום את המזרק על לחסום את המזרק של משאבת מזרק, לקבע אותו עם משרת את המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות קצה אחד של צינור החיבור לתוך המזרק, להכניס את הקצה השני לתוך המחזק את המחט. הכנס את מחט הזריקה לתוך המחזק את המחט. סופו של מחט הזריקה צריך לפנות ישירות סוף בתוך צינורות החיבור של בעל מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לוחץ על המתג ידנית לדחוף את הפתרון באמצעות צינור החיבור. Push עד טיפה פתרון נראה לעין בקצה מחט הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למיקום הבוכנה הבא כדי לחסום את דחפן ומאובטח אותו במקום עם סוגר את הבלוק הסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים הזרקה: קצב ההזרקה צריך להיות כ 8μl/min (~ 130nl / s); נפח הזרקה הוא בדרך כלל 1-2ul, בחר את קוטר מזרק מתאים לגודל המזרק אתה משתמש (ראה מזרק משאבה ידנית לקבלת הנחיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פלטה חשמלית ל ~ 38 ° C ו מכסים במגבת נייר או מחסום דק אחרים כדי להגן על הגורים במהלך שלב ההחלמה. </li></ol> 3. הזרקת הליך והתאוששות גור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן P0 או P1 גורים עכבר להזרקה באמצעות חשיפתן הרדמה קר הבאה פרוטוקול שאושר IACUC. לחלח מגבות נייר עם מעט מים ומניחים על קרח. מניחים את המספר הרצוי של הגורים (4-5) על מגבת נייר (להשאיר אותם מופרדים היטב) בעדינות לקפל את מגבות נייר על הגורים אז הם מכוסים על ידי מגבת נייר לחה. בעדינות במקום כמות קטנה של קרח מרוסק על גבי מגבות נייר דגירה את הגורים למשך כ 5 דקות. הגורים יכולים להישמר על הקרח עד 15 דקות להתאושש יפה לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הגור הוא הרדים מספיק, למקם אותו על בלוק הרכבה (אנו משתמשים בלוק קלקר שבדרך כלל מחזיקה 15 מ&quot;ל צינורות) ומקם אותה הגישה הטובה ביותר הזריקה. עבור בקליפת היא הקלה ביותר כדי להניח את שטוח חיה על הבטן שלה, בעוד המוח הקטן כדאי למקם את ראשו של הגור מעבר לקצה הרחוב כדי לספק גישה טובה יותר האחורי של הגולגולת. הגור יכול להיות מאובטחת במקום עם פלסטר, אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את ראשו של הגור במקום ביד אחת בעוד המחט מוחדרת באופן ידני במקום הרצוי ביד השנייה דרך הגולגולת. זה עוזר למשוך את העור חזק כדי למנוע ממנה לזוז במהלך ההזרקה. עבור בקליפת כדאי להפוך את זריקות ביחס ציון דרך מוגדרת היטב אנטומיים, כמו תפר למבדה של הגולגולת, כמו זה יסייע זריקות בעתיד. המוח הקטן ניתן לראות דרך הגולגולת כמו רצועה דקה של רקמה שוכב הזנב ישירות colliculus. העומק שאליו את המחט צריך להיות מוכנס משתנה מעט בין החיות זנים בודדים תעיד על ידי סמנים מראש על המחט, אולם עבור קליפת המוח ואת המוח הקטן אנו מוצאים כי עומק של ~ 0.5 - 1mm מפני השטח מתאים בדרך כלל. עומק הכניסה לאתרים אחרים צריך להיקבע באופן ניסיוני על ידי משתמש הקצה. הערה: המחט צריכה לחדור בקלות את הגולגולת, ואם לא, לא לדחוף יותר מדי קשה כמו זה יכול לפגוע בבעלי חיים. שנה את מיקום המחט בעדינות לנסות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון וירוס. הזריקה היא להתחילעורך ידי לחיצה על כפתור START על המשאבה או מדכא דוושת רגל, בהתאם לדגם של לחץ ההזרקה נעשה שימוש. בהעדר דוושת רגל מומלץ יש עמית לסייע עם לחיצה על כפתור כדי למזער תנועות ידיים מיותרות שעלולות להשפיע על הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שנבחר נפח כבר הזריק, לשמור את המחט במקום במשך כמה שניות ואז בעדינות להסיר את המחט על ידי הזזה זה בצורה חלקה. הקפידו להחזיק את ראשו של הגור במקום כדי למזער תנועות מיותרות. מאחר ציוד הזרקה הוא ניקה מעוקרים בין ניסויים עם אתנול פצע קטן, השימוש חיטוי מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הגור על הכיריים מכוסה להגדיר את הטמפרטורה ~ 38 ° C כדי לחמם אותו להתאוששות, בדרך כלל 50-10 דקות. במהלך תקופה זו תוכל להמשיך הזרקת גורים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל הגורים התאוששו (הם צריכים להיות ורוד ונעים) לקחת חלק תשתית הביתה לשפשף בעדינות את הגורים עם זה. החזר את הגורים לאם כקבוצה. </li></ol> הערה: חשוב מאוד לוודא הגורים חמים חשופים מצעים הביתה לפני החזרת אותם לאם להחזיר אותם כקבוצה. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום אמו ופצע או הרג גורים. 4. ציוד ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזריקה היא להשלים את הגורים הוחזרו אמם, לנקות את ההתקנה על ידי הזרקת מלא טעינת את המזרק עם אצטון או אתנול 70%. פלאש הפתרון דרך ההתקנה מספר פעמים הזרקה, באמצעות פתרון טריים בכל פעם. פעולה זו תסיר כל פתרון וירוס שנותרו משקעים. אצטון או אתנול אז יהיה להתאדות. הערה: אצטון הוא העדיף לניקוי, אבל אם ההגדרה שלך משתמש בכל אצטון רגיש רכיבים, כגון דבקים cyanoacrylate, ולאחר מכן להשתמש באתנול 70% עבור פעולות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את האזור עובד עם אקונומיקה ולסלק פסולת במיכל Biohazard המתאים. </li></ol> 5. אנליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן חיות בגיל הרצוי באמצעות שיטה IACUC אושרה המתת חסד. קיבעון זלוף מומלץ לסייע להדמיה מאוחר יותר של נוירונים נגוע, בעיקר אצל בעלי חיים מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהלים immunostaining רגיל ניתן להשתמש כדי להגביר את האות ניאון. בקצרה, 100 מיקרומטר צף סעיפים vibratome הם permeabilized עם PBS 1% Triton X-100 ו - חסום PBS 1% Triton X-100 10% נסיוב עז נורמלי. מדורים מודגרת בחסימת פתרון עם נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C, ואחריו נוסף כביסה חסימה. מדורים מודגרת אז חסימת פתרון עם נוגדנים משני 2 שעות בטמפרטורת החדר, לשטוף ביסודיות, רכוב על שקופיות coverslipped עם אנטי לדעוך התקשורת גובר. Cryosections ניתן להשתמש גם לדמיין שכותרתו נוירונים, לעומת זאת הקרינה אנדוגני עלול להיות אבוד. </li></ol> 6. נציג תוצאות: הליך זריקה מוצלחת תייצר זיהום החזקה של נוירונים באזור ההזרקה ללא נזק לרקמות הנצפה או השפעות שליליות אחרות על החיה. כמו באיור 1, התפשטות הזיהום ניתן לצפות Cre-כתב עכברים (ROSA26R) 12 מוזרק עם rAAV8-Cre באתרים אנטומיים שונים. זריקות לתוך אזורים ספציפיים, כגון קליפת המוח מעולה colliculus, בדרך כלל ליצור דלקות מקומיות עם התפשטות מינימלי לאזורים סמוכים (איור 1A-B). השימוש בפתרון כייל גבוה וירוס גורם לזיהום של אזורים סמוכים, כמו בהיפוקמפוס, סביר יותר (איור 1A). עם הזרקת וירוס כייל נמוך התוצאות פתרון לזיהום דלילה, אשר בדרך כלל נשארת ליד הזריקה, כפי שמוצג הזריקה cerebellar של rAAV8-Cre ב קו האמצע של עכברים ROSA26R הכתב (תרשים 1C-D). ראינו רקומבינציה בעכברים ROSA26R הכתב בתוך 2 ימים לאחר הזרקת rAAV8-Cre, דבר המצביע על כך, זיהום רקומבינציה, ואת הביטוי של גנים הכתב יכולים להתרחש מהר יחסית. בנוסף, השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לחקור את ההשפעות של מחיקת הגן על מוקד בלתי ROSA באמצעות אלל מותנה floxed, התוצאות אשר יפורסמו במקומות אחרים. מספר תאים נגועים צריך לתאם עם כייל הפתרון ויראלי מוזרק. לדוגמה, הזרקת תערובת של פתרונות כייל גבוה של שני rAAV8 וירוסים להביע חלבוני ניאון שונים לתוך המוח הקטן מדביק תאים רבים פורקינג&#39; המוגדרים דיפרנציאלי (איור 2 א). לעומת זאת, הזרקת פתרון נמוך titer וירוס יכול לגרום זיהום דלילה לסייע חזותי תאים בודדים (איור 2B). נוירונים שכותרתו fluorescently ניתן לצפות ישירות טריים, רקמת חיים (איור 2B) או יכולה להיות נתונה immunostaining כדי לשפר את אותות ניאון אנדוגני לרכישת התמונה מאוחר יותר על ידי שדה רחב או שיתוףמיקרוסקופ פלואורסצנטי nfocal (איור 2A, איור. 3A-C). לבסוף, rAAV8 מסוגל להדביק מגוון של סוגי נוירונים בקליפת המוח עם תיוג חזק של תהליכים קנס (איור 3A-C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> איור 1: מכתים LacZ במוח של עכברים ROSA26R כתב כי הוזרקו rAAV8-Cre ב P0 מדגים פעילות Cre ואת המיקום של זיהום. <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחב בתחום לצפות sagittal של המוח P14 המראה כייל גבוה (1x10 12 GC / מ&quot;ל) זריקות לתוך קליפת מעולה colliculus. השימוש וירוס כייל גבוה עושה את זה סביר יותר להניח כי באזורים הסמוכים יהיה גם נגועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף sagittal של קליפת P14 מוזרק עם כייל נמוך (1x10 11 GC / מ&quot;ל) מדגים וירוס דלקת מקומית עם פחות להתפשט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקפה wholemount של המוח הקטן P28 מוזרק על קו האמצע עם כייל נמוך (1x10 9 GC / מ&quot;ל) פתרון וירוס מראה כי הזיהום הוא דליל ובדרך כלל נשאר ליד הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג sagittal של קו האמצע של המוחון ב-C). שים לב כי תאי פורקינג&#39; רק בדרך כלל נגועים על ידי rAAV8. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> איור 2: תיוג cerebellar בזריקה עם titers גבוה ונמוך של rAAV8 להביע חלבוני ניאון. <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע sagittal של P21cerebellum נגוע עם שילוב של שני הנגיפים להביע EGFP (ירוק) ו DsRed (אדום). לערבב כייל גבוה של וירוסים שימש להדביק מספר גדול של תאים פורקינג&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא פורקינג&#39; במוח הקטן P14 לחיות מזיהום כייל נמוך מאוד ויראלי צילמו מיד לאחר דיסקציה. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> איור 3: תיוג קליפתיים ידי rAAV8-DsRed. דוגמאות של מגוון סוגי נוירונים בקליפת המוח בסעיפים העטרה של קליפת p21 שהיה נגוע rAAV8 DsRed ב-P0.

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה בילוד הזרקת נגיפי המוצג כאן מספק דרך פשוטה ומהירה ליצור בפסיפסים vivo לחקר התפתחות המוח לאחר הלידה. השיטה מנצלת אללים floxed הזמינים כעת וכן אלה הנעשים דרך הגן תפוקה גבוהה מיקוד הפרויקט 6. לעומת השימוש בביטוי מהונדס של Cre, שיטה זו מספקת דרך מהירה לבדוק את ת?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre,-GFP,-DsRed, </td><td> וקטור Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, סדר מותאם אישית </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> הרווארד משאבה 11 פלוס </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (אין יציאת דוושת רגל) </td></tr><tr><td> פיגמנט רשתית אפיתל הזרקת Kit </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> הרשתית-KIT </td><td> מכיל חיבור, צינורות הזרקה ומחטים (36G), וכן בעל מחט </td></tr><tr><td> NanoFil מזרק, 100μl </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> NANOFIL-100 </td><td> כולל מחט טעינת לשימוש חוזר </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP נוגדן </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed נוגדן </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> חימום חסום </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R העכבר </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

תפקוד המוח רגיל נשענת לא רק על ההתפתחות העוברית כאשר מסלולים עצביים העיקריים מבוססים, אלא גם על התפתחות הלידה, כאשר מעגלים עצביים הם הבשילו ומעודן. Misregulation בשלב זה עשויה להוביל להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם 1,2. גנים רבים נחקרו במוח טרום לידתי ומצא חיוני לתהליכים התפתחותיים רבים 3-5. עם זאת, תפקידם במוח לאחר הלידה אינו ידוע ברובו, בין השאר משום המחיקה שלהם בעכברים מובילה לעיתים קרובות הקטלניות במהלך התפתחות הילוד, וגם מפני הדרישה שלהם בהתפתחות המוקדמת מעכבת את הניתוח לאחר הלידה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, floxed האללים של גנים אלה נמצאים בשלבי שנוצר בעכברים 6. בשילוב עם אללים מהונדס המבטאים Cre recombinase ב סוגי תאים מסוימים, המחיקה מותנית יכולה להיות מושגת ללמוד לתפקד גנים במוח לאחר הלידה. עם זאת, שיטה זו דורשת אללים נוספים תוספת זמן (3-6 חודשים) על מנת ליצור את העכברים עם גנוטיפים המתאימים, וכך להגביל את הרחבת הניתוח גנטית בקנה מידה גדול במוח העכבר. כאן אנו משלימים להפגין גישה המשתמשת Cre virally-הביעו ללמוד אלה אללים floxed במהירות ובאופן שיטתי בהתפתחות המוח לאחר הלידה. באמצעות הזרקת רקומביננטי adeno הקשורים וירוסים (rAAVs) 7,8 קידוד Cre לתוך המוח בילוד, אנו מסוגלים למחוק את הגן של עניין באזורים שונים של המוח. על ידי שליטה על כייל ויראלי coexpressing סמן חלבון פלואורסצנטי, אנחנו יכולים להשיג בו זמנית גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה. שיטה זו עוקפת את הדרישה של גנים רבים בפיתוח מוקדם, מאפשר לנו ללמוד תפקוד התא האוטונומי שלהם תהליכים קריטיים רבים בהתפתחות המוח לאחר הלידה, כולל צמיחה axonal ו דנדריטים, מסתעפת, ו ריצוף, וכן היווצרות הסינפסה ועידון. שיטה זו שימש בהצלחה במעבדה שלנו (תוצאות לא פורסם) ואחרים 8,9, ו - ניתן להרחיב וירוסים אחרים, כגון 9 lentivirus, כמו גם לביטוי של חלבונים או shRNA פעיל דומיננטי 10. יתר על כן, על ידי שילוב של טכניקה זו עם electrophysiology וכן לאחרונה פיתחה כלי הדמיה אופטית 11, שיטה זו מספקת אסטרטגיה חדשה ללמוד איך מסלולים גנטיים המשפיעים על התפתחות המעגל העצבי לתפקד וגם עכברים וחולדות.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

<em&gt; In vivo</em&gt; שיטת לבדוק תפקוד הגנים במוח לאחר הלידה מתוארת. AAVs רקומביננטי להביע Cre ו / או חלבון פלואורסצנטי מוזרקים במוח העכבר הילוד. גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה מושגות, דבר המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד הגן בתהליכים קריטיים לפיתוח מעגלים עצביים.

פסיפס ניתוח פונקציה ג&#39;ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California.  In vivo שיטת לבדוק תפקוד הגנים במוח לאחר הלידה מתוארת. AAVs רקומביננטי להביע Cre ו / או חלבון פלואורסצנטי מוזרקים במוח העכבר הילוד. גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה מושגות, דבר המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד הגן בתהליכים קריטיים לפיתוח מעגלים עצביים.

Video: Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

תפקוד המוח לומד אצל ילדים באמצעות מגנטואנצפלוגרפיה

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

השרשה כרונית של מערך שלם-קורטיקליים Electrocorticographic ב המרמוסט נפוצות

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...