ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة RO1 (NINDS).

1. التحضير للحقن الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم شراؤها من بائع rAAVs التجارية الموصى بها ، ولكن يمكن أيضا أنها لن تنتج في معمل المرء (انظر المناقشة أدناه). وينتج عادة الفيروس في حل من عيار 1x10 ~ 12 نسخ الجينوم في الملليمتر الواحد (GC / مل) ، ويمكن استخدامه في عيار الكامل لمعالجة عدد كبير من الخلايا. بدلا من ذلك ، قد تكون مخففة عليهم تنتج المستوى المطلوب لوضع العلامات متفرق. يجب أن يتحدد في تخفيف مناسبة من قبل المستخدم ، ولكن ينصح المخفف 01:10 لبدء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد وجود فيروسات على الفور قبل استخدامه. نقل المطلوب قبل تخفيف حجم الفيروس إلى حل صغيرة (~ 250μl) أنبوب PCR. تمييع الحل الفيروس باستخدام حجم مناسب لDPBS العقيمة في نسيج الثقافة هود. مخزن المخفف حل فيروس على الجليد حتى الحاجة إليه. </li></ol> ملاحظة : يجب أن تتم معالجة جميع الفيروسات وفقا لبروتوكول السلامة الأحيائية التي وافقت عليها مؤسستكم 2. تحميل المحاقن ومعدات التجميع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال الإبرة التحميل لالمحقنة الزجاج ، ووضع حل الفيروس من أنبوب PCR عن طريق سحب المكبس برفق. سحب المكبس حتى يمكن رؤية فقاعة صغيرة جدا من الهواء في الحقنة ، وهذا يدل على أن جميع من الحل هو في المحاقن وليس اليسار في الإبرة التحميل. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة كمية صغيرة من الصبغة الخاملة إلى حل لجعله مرئيا. ملاحظة : يجب استخدام أنبوب PCR صغيرة مثل الإبرة التحميل هو عادة ليست طويلة بما يكفي للوصول إلى الجزء السفلي من الأنابيب معظم الدول الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة التحميل ومكان الحقنة على كتلة حقنة من مضخة الحقن ، وتأمين فإنه مع التجنيب المحاقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بلطف واحدة من نهاية الأنبوب الضام في المحقنة ؛ إدراج الطرف الآخر في ماسك الإبرة. إدراج إبرة الحقن في ماسك الإبرة. وينبغي في نهاية إبرة الحقن الاتصال مباشرة نهاية داخل أنابيب يربط بين حامل الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض ببطء المكبس يدويا لدفع حل عن طريق الأنبوب الضام. دفع حتى قطرة صغيرة جدا من الحل واضح في رأس الإبرة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموقف بعناية الغطاس بجانب كتلة انتهازي وضمان الحصول عليها في مكان مع انتهازي قوس كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات حقن : معدل الحقن ينبغي 8μl/min حوالي (~ 130nl / ث) ؛ حجم الحقن هو عادة 1 - 2ul ، واختيار القطر المناسب للحقنة حقنة حجم تستخدمه (راجع دليل ضخ حقنة لمبادئ توجيهية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين موقد إلى ~ 38 درجة مئوية ، وتغطي مع منشفة ورقية أو حاجز رقيق أخرى لحماية الصغار في مرحلة الانتعاش. </li></ol> 3. الحقن الداخلي والانتعاش الجرو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجراء أو الماوس P0 P1 للحقن عن طريق إخضاعهم لتخدير الباردة بعد بروتوكول IACUC المعتمدة. بلل قطعة مناشف ورقية قليلة من الماء وتوضع على الجليد. ضع العدد المرغوب فيه من الجراء (4-5) على منشفة ورقية (ابقائهم يفصل جيدا) وأضعاف بلطف المناشف الورقية أكثر من الجراء حتى يتم تغطيتها بواسطة منشفة ورقية مبللة. المكان برفق على كمية صغيرة من الثلج المجروش على رأس المناشف الورقية واحتضان الجراء لنحو 5 دقائق. يمكن أن تبقى الجراء على الجليد لمدة تصل إلى 15 دقيقة وبعد ذلك استرداد غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجرو هو تخدير بما فيه الكفاية ، ووضعه على كتلة تركيب (نستخدم كتلة الستايروفوم الذي يحمل عادة 15ml أنابيب) وضعه للحصول على أفضل الوصول إلى موقع الحقن. لأنها أسهل القشرة لوضع مسطح على بطن الحيوان ، في حين لالمخيخ فإنه مفيد لوضع رأس الجرو على مدى حافة كتلة لتوفير وصول أفضل إلى الجزء الخلفي من الجمجمة. قد يكون حصل على الجرو في مكان مع المعونة الفرقة ، اذا شئت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد رئيس والجرو في مكان واحد بينما يتم إدخال اليد يدويا الإبرة من خلال الجمجمة في الموقع المطلوب مع جهة أخرى. ومن المفيد لسحب الجلد مشددة لمنعها من التحرك خلال الحقن. لقشرة من المفيد لجعل حقن نسبة إلى المعالم التشريحية واضحة المعالم ، مثل خياطة امدا من الجمجمة ، وهذا سيساعد في المستقبل الحقن. ويمكن أن ينظر إليه من خلال الجمجمة المخيخ كما الشريط رقيقة من نسيج الكذب الذيلية مباشرة إلى الأكيمة. العمق الذي ينبغي أن تدرج الإبرة يختلف قليلا بين الفرد وسلالات الحيوانات ، ويمكن قياسه من خلال مؤشرات محددة سلفا على الإبرة ، ولكن لقشرة المخيخ ونجد أن عمق ~ 0.5 -- 1MM من على سطح الأرض هو مناسبة عادة. وينبغي أن تحدد عمق الإدراج لمواقع أخرى تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. ملاحظة : يجب أن تخترق بسهولة إبرة الجمجمة ، وإذا لم يحدث ذلك ، لا يدفع من الصعب جدا لأن هذا يمكن أن تصيب الحيوان. إعادة الإبرة وحاول مرة أخرى برفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول الفيروس. الحقن هو بدايةاد عن طريق الضغط على زر ابدأ على المضخة أو الاكتئاب دواسة القدم ، واعتمادا على نموذج من الضغط محقن مستخدمة. في حالة عدم وجود دواسة القدم فمن المستحسن أن يكون له زميل مساعدة في الضغط على الزر لتقليل حركات اليد غير الضرورية التي قد تؤثر على الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم حقنها وحدة التخزين المحددة ، والحفاظ على الإبرة في المكان لبضع ثوان ثم قم بإزالة الإبرة برفق عن طريق تحريك بها بسلاسة. لا شك أن تعقد رأس الجرو في المكان المناسب للحد من تحركات غريبة. منذ يتم تنظيف معدات الحقن المعقمة وبين التجارب مع الإيثانول وجرح صغير ، واستخدام مطهر غير ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الجرو على موقد مغطاة مجموعة درجة الحرارة في ~ 38 درجة مئوية لتدفئتها للانتعاش ، 5-10 دقائق عادة. خلال هذا الوقت قد يستمر ضخ الجراء الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل من الجراء قد تعافى (ينبغي أن تكون وردية والانتقال) يأخذ جزء من منزل الأسرة وفرك بلطف الجراء معها. عودة إلى الأم الجراء كمجموعة. </li></ol> ملاحظة : من المهم جدا للتأكد من الجراء الحارة وتتعرض لمنزل الأسرة قبل إعادتها إلى الأم وإعادتهم كمجموعة. قد فشل في القيام بذلك يؤدي إلى إصابة الأم أو قتل الجراء. 4. معدات التنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن كاملة وأعيد الجراء إلى أمهم ، وتنظيف حقن الإعداد عن طريق تحميل كاملا المحاقن مع الأسيتون أو الايثانول 70 ٪. تدفق حل من خلال الحقن عدة مرات الإعداد ، وذلك باستخدام حلول جديدة في كل مرة. سيؤدي هذا إلى إزالة أي حل الفيروس المتبقية والرواسب. سوف الاسيتون ثم تتبخر أو الايثانول. ملاحظة : يفضل الأسيتون لتنظيف ، ولكن إذا كان الإعداد الخاص بك يستخدم أية مكونات الأسيتون حساسة ، مثل مواد لاصقة cyanoacrylate ، ثم استخدام الإيثانول بنسبة 70 ٪ لهذه الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير منطقة عمل مع النفايات والتخلص التبييض في حاوية an اقية مناسبة. </li></ol> 5. تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانات في سن المطلوب باستخدام أسلوب القتل الرحيم IACUC المعتمدة. فمن المستحسن تثبيت نضح للمساعدة في التصور في وقت لاحق من الخلايا العصبية المصابة ، وخاصة في الحيوانات البالغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام إجراءات immunostaining القياسية لتضخيم إشارة الفلورسنت. باختصار ، هي permeabilized 100 ميكرون العائمة المقاطع vibratome مع PBS +1 ٪ تريتون X - 100 وسدت في برنامج تلفزيوني +1 ٪ تريتون X - 100 +10 ٪ مصل الماعز العادية. يتم تحضين المقاطع في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ، تليها إضافية الغسيل والحجب. ثم يتم تحضين المقاطع في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وغسلها جيدا ، التي شنت على الشرائح وcoverslipped تتلاشى مع وسائل الإعلام المعادية للتصاعد. يمكن أن تستخدم أيضا لCryosections تصور الخلايا العصبية المسمى ، ولكن قد تكون فقدت مضان الذاتية. </li></ol> 6. ممثل النتائج : وإجراء الحقن ناجحة تنتج العدوى قوية من الخلايا العصبية في منطقة في موقع الحقن مع عدم وجود تلف الأنسجة يمكن ملاحظتها أو غيرها من الآثار السيئة على الحيوان. كما هو موضح في الشكل 1 ، يمكن ملاحظة انتشار العدوى في لجنة المساواة العرقية ، مراسل الفئران (ROSA26R) 12 حقنوا لجنة المساواة العرقية ، rAAV8 في مواقع التشريحية المختلفة. الحقن في مناطق معينة ، مثل القشرة وأكيمة متفوقة ، وتولد عادة مع انتشار العدوى المحلية إلى الحد الأدنى من المناطق المجاورة (الشكل 1A - B). استخدام عالية عيار حل الفيروس يجعل إصابة المناطق المتاخمة لها ، مثل الحصين ، على الأرجح (الشكل 1A). الحقن مع انخفاض النتائج عيار حل عدوى الفيروس في متفرق ، التي لا تزال عادة قرب موقع الحقن ، كما هو موضح في حقن مخيخي من لجنة المساواة العرقية ، rAAV8 في خط الوسط من الفئران مراسل ROSA26R (الشكل 1C - D). وقد لاحظنا في الفئران تأشب مراسل ROSA26R داخل 2 يوما بعد الحقن من لجنة المساواة العرقية ، rAAV8 ، مما يوحي بأن العدوى ، وإعادة التركيب ، والتعبير عن الجينات يمكن أن تحدث المراسل عن بسرعة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن قد استخدمت هذه التقنية بنجاح لدراسة الآثار المترتبة على حذف الجينات في مكان غير ROSA باستخدام أليل floxed المشروطة ، وسوف تنشر نتائجها في أماكن أخرى. يجب أن يكون عدد الخلايا المصابة ترتبط من عيار الحل حقن الفيروسية. على سبيل المثال ، عن طريق الحقن مزيج من الحلول عالية من عيار الفيروسات rAAV8 two معربا عن البروتينات الفلورية مختلفة في العديد من خلايا المخيخ يصيب بركينيي التي وصفت تفاضلي (الشكل 2A). على العكس ، يمكن حقن الفيروس عيار منخفض حل يؤدي إلى الإصابة متفرق للمساعدة في وضع تصور لخلايا واحد (الشكل 2B). ويمكن ملاحظة الخلايا العصبية fluorescently المسمى مباشرة في المقطوفة ، والأنسجة الحية (الشكل 2B) أو يمكن أن يتعرضوا لimmunostaining لتعزيز الإشارات الذاتية الفلورسنت لالتقاط صور في وقت لاحق في الميدان واسعة أو تشاركفلوري nfocal المجهري (الشكل 2A ، الشكل 3A - C). أخيرا ، rAAV8 قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في القشرة مع وضع العلامات قوية من العمليات الدقيقة (الشكل 3A - C). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> الشكل 1 : LacZ تلطيخ في دماغ الفئران مراسل ROSA26R أن حقنوا لجنة المساواة العرقية في P0 - rAAV8 يوضح نشاط لجنة المساواة العرقية ومكان الإصابة. <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقل واسع من الرأي السهمي في الدماغ يظهر P14 عيار عالية (1x10 12 GC / مل) والحقن في القشرة أكيمة متفوقة. استخدام فيروس عيار عالية يجعل من المحتمل أن تكون أيضا المناطق المجاورة المصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم السهمي من القشرة حقن P14 مع انخفاض عيار (1x10 11 GC / مل) يدل على عدوى فيروس المحلية مع أقل الانتشار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رأي wholemount من المخيخ P28 حقنه في خط الوسط مع عيار منخفض (1x10 9 GC / مل) يدل على أن حل فيروس العدوى متناثر ويبقى عادة بالقرب من موقع الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السهمي نظرا خط الوسط من المخيخ في C). علما بأن عدد المصابين بهذا المرض خلايا بركينيي فقط rAAV8 عموما. </li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> الشكل 2 : العلامات مخيخي عن طريق الحقن مع التتر العالية والمنخفضة من rAAV8 معربا عن البروتينات الفلورية. <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك قسم من سهمي P21cerebellum المصابة مع مزيج من اثنين من الفيروسات معربا عن EGFP (الخضراء) وDsRed (الحمراء). تم استخدام مزيج من عيار عالية الفيروسات تصيب عددا كبيرا من خلايا بركينيي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصوير خلية بركينيي في المخيخ P14 يعيش من العدوى الفيروسية عيار منخفض جدا مباشرة بعد تشريح. </li></ol><img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> الشكل 3 : وضع العلامات القشرية التي DsRed - rAAV8. أمثلة على أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في الأجزاء القشرية الاكليلية لحاء P21 أن المصابين DsRed - rAAV8 في P0.

<ol>
	<li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism+spectrum+disorders:+developmental+disconnection+syndromes.">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li><li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+MRI+of+pediatric+brain+development:+what+have+we+learned+and+where+are+we+going?.">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?.</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li><li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+the+brain:+the+biology+of+neuronal+guidance.">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity.">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li><li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation.">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li><li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts.">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li><li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system.">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li><li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA.">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li><li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li><li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

والولدان طريقة الحقن الفيروسية المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لتوليد الفسيفساء في الجسم الحي لدراسة تطور الدماغ بعد الولادة. الأسلوب يستفيد من الأليلات floxed المتوفرة حاليا فضلا عن تلك التي تبذل من خلال الجينات إنتاجية عالية استهداف المشروع 6. بالمقا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> rAAV8 - لجنة المساواة العرقية ، GFP - ، - DsRed ، </td><td> ناقلات Biolabs </td><td> # 7060 ، # 7061 ، والنظام مخصص </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> جامعة هارفارد 11 مضخة بلس </td><td> جهاز هارفارد </td><td> # 702208 </td><td> (لا يوجد منفذ دواسة القدم) </td></tr><tr><td> الشبكية حقن صبغات الطلائية كيت </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> RPE - KIT </td><td> يحتوي الضام الإبر أنابيب الحقن ، (36G) ، وحامل إبرة </td></tr><tr><td> NanoFil الحقنة ، 100μl </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> NANOFIL - 100 </td><td> وتشمل إعادة الاستخدام إبرة التحميل </td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP الأضداد </td><td> أفيس </td><td> GFP - 1020 </td><td></td></tr><tr><td> DsRed الأضداد </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> بلوك التدفئة </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R الماوس </td><td> مختبر جاكسون </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

وظيفة الدماغ طبيعي يعتمد ليس فقط على التطور الجنيني عندما يتم تأسيس المسارات العصبية الرئيسية ، ولكن أيضا على التنمية ما بعد الولادة عندما نضجت الدوائر العصبية وصقلها. قد Misregulation في هذه المرحلة يؤدي إلى اضطرابات عصبية ونفسية مثل التوحد وانفصام الشخصية 1،2. وقد تم دراسة العديد من الجينات في الدماغ قبل الولادة وجدت حاسمة لكثير من العمليات التنموية 3-5. ومع ذلك ، فإن وظيفتها في الدماغ بعد الولادة غير معروف إلى حد كبير ، ويرجع ذلك جزئيا الحذف في الفئران غالبا ما يؤدي إلى الفتك التنمية خلال حديثي الولادة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ما يتطلبه المبكر يعيق التنمية في تحليل ما بعد الولادة. للتغلب على هذه العقبات ، ويتم حاليا الأليلات floxed من هذه الجينات في الفئران التي يتم توليدها 6. عندما يقترن الأليلات المعدلة وراثيا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase في أنواع معينة من الخلايا ، ويمكن تحقيق الحذف مشروط لدراسة وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة. ومع ذلك ، يتطلب هذا الأسلوب الأليلات إضافية والوقت الاضافي (3-6 أشهر) لتوليد الفئران مع المورثات المناسبة ، مما يحد من التوسع في التحليل الوراثي على نطاق واسع في مخ الفأر. نحن هنا يبرهن على وجود نهج متكامل يستخدم لجنة المساواة العرقية فيروسي ، وأعرب لدراسة هذه الأليلات floxed بسرعة وبشكل منهجي في تطور الدماغ بعد الولادة. عن طريق حقن الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسات (rAAVs) 7،8 الترميز لجنة المساواة العرقية في الدماغ حديثي الولادة ، ونحن قادرون على حذف هذا الجين من الاهتمام في مناطق مختلفة من الدماغ. من خلال التحكم في عيار الفيروسية وcoexpressing علامة بروتين فلوري ، في وقت واحد يمكن أن نحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متفرق. هذا الأسلوب يتجاوز متطلبات التنمية في العديد من الجينات في وقت مبكر ، ويسمح لنا لدراسة الخلايا وظيفتها الحكم الذاتي في العديد من العمليات الحرجة في نمو المخ بعد الولادة ، بما في ذلك النمو محواري والجذعية ، والمتفرعة ، والتبليط ، وكذلك تشكيل المشبك والصقل. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في المختبر منطقتنا (نتائج غير منشورة) وغيرهم 8،9 ، ويمكن أن تمتد إلى غيرها من الفيروسات ، مثل الفيروسة البطيئة 9 ، فضلا عن التعبير عن shRNA أو البروتينات النشطة المهيمن 10. علاوة على ذلك ، من خلال الجمع بين هذه التقنية مع الكهربية وكذلك في الآونة الأخيرة نموا أدوات التصوير الضوئي 11 ، هذا الأسلوب يقدم استراتيجية جديدة لدراسة كيفية تأثير العصبية الوراثية مسارات التنمية الدوائر وظيفة في الفئران والجرذان.

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination at JoVE.com

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

و<em&gt; في الجسم الحي</emيوصف&gt; طريقة لاختبار وظيفة الجين في الدماغ بعد الولادة. يتم حقن AAVs المؤتلف معربا عن لجنة المساواة العرقية و / أو بروتين فلوري في مخ الفأر الولدان. وتتحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متناثر ، مما يسمح التحليل السريع وظيفة الجين في العمليات الحرجة للتنمية الدوائر العصبية.

تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California. و في الجسم الحي طريقة لاختبار وظيفة الجين في الدماغ بعد الولادة. يتم حقن AAVs المؤتلف معربا عن لجنة المساواة العرقية و / أو بروتين فلوري في مخ الفأر الولدان. وتتحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متناثر ، مما يسمح التحليل السريع وظيفة ال...

Video: Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

تسليم الجينات إلى الدماغ الجرذ بعد الولادة من غير البطين حقن البلازميد وElectroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

حمل جزئ لوكس Cre في قشرة الدماغ الماوس عن طريق انهانسر في الرحم

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

دراسة وظيفة المخ في الأطفال باستخدام ماجنيتونسيفالوجرافي

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

إنتاج وتنقية ومراقبة الجودة لناقلات القائم على الفيروسات المرتبطة بالغدة

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

غرس المزمن من الصفيف اليكتروكورتيكوجرافيك الجامعة القشرية في مرموز المشتركة

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...