米国癌協会（MRSG - 08 - 108 - 01）、ビンセントJ. Sgro /アメリカ脳腫瘍協会、と私は中野カーンファミリー財団。

1。メディアの準備<ol><li> （1.01614.1000 - EMD粒状、0.6％寒天溶液を精製 - 液体1:1（Invitrogen社製10565から042）、DMEM/F-12（1X）に - メディアは、10％FBSを（GIBCO 16140から071）を用いて調製した）。滅菌条件は、実験を通して維持された。 </li><li> FBSのメディア5mLの（16140から071 - GIBCO）の準備のために - 50mLに対しての最終的なボリュームを作るDMEM/F-12（1X）の45mL、液体1:1（Invitrogen社製10565から042）に登録されました。準備メディアを37 ° Cの温度の水浴中で保たれた。 </li><li>寒天溶液は、熱波法を用いて調製した。 0.3グラムグラニュー寒天は、マイクロ波を用いて50mLの蒸留水に溶解した。寒天液は水浴にそれを維持することによって37℃の温度までクールだった。 </li><li>我々は、ステップ1.2および1.3と準備ストック溶液からのメディアの等量を使用。 0.6％寒天（0.5mLを）および10％FBS-D-MEM/F-12メディア（0.5mLを）の比率は6ウェルプレートの各ウェルに1mLずつの合計量を作る、1:1であった。 </li></ol> 2。組織の処理<ol><li>神経膠芽腫多形（GBM）の組織は直ちに病理部から手術後に受信された。組織は、病理部からGBMに分類された。 </li><li>組織は、3回のために慎重に、氷冷5mLの1XPBSで洗浄鉗子を使用して、父プレートに移した。 </li><li>標本の連続切片は、手術のブレード（羽根- 2976＃10）とforcep（フィッシャーサイエンティフィック）と腫瘍のブロック（直径約10 mm）を作成するために解剖試料から切り出した。 </li><li>ブロックは、6ウェルプレートに移した。メディアの各ウェルを含むれた1mLのは、ステップ1.4で言及。組織は、組織が実行可能で維持するために空気に十分な露出を持っていた。 </li><li>腫瘍のブロックが次にDMSO（5％）またはTMZ（2.5 nM）のどちらかを注射し、37℃で16時間インキュベートした℃、5％CO2を含む加湿空気インチDMSOの0.1mlを（5％）またはTMZは、一貫性のある治療のためのさまざまな場所での腫瘍のブロックに3回注射した。薬剤は、28G1 / 2 0.37X12.7mmインスリンシリンジ1mLの（コンフォートポイント- 26027）を用いて注入した。 </li><li> 16時間後のブロックは3回、5 mLの1XPBSで洗浄した。ブロックを洗浄した後、50mLのチューブ（Basix - 5539802）で24時間V / V、10％ホルマリン10mlの（リッカ化学会社）で固定し、4μmのセクションをパラフィン包埋のために処理。 </li><li>ホルマリン固定されたセクションは、&quot;NO HEAT&quot;で撹拌プレート上ビーカーに入れ、各溶液中で30分間、次のソリューションを介して処理されました。 30％エタノール、50％エタノール、75％エタノール、80％エタノール、95％エタノール、100％エタノール、キシレン。 </li><li>組織は、ペーパータオルにブロットし、30分間溶融パラフィン（58〜60℃、フィッシャーParaplastのパラフィン）に置かれた。 </li><li>組織がSurgipathブルーリボンのパラフィンを使用して金型に埋め込まれ、埋め込まれた組織を室温まで冷却した。 </li><li>パラフィン包埋4μm組織切片を採取し、フィッシャープラスのスライド上に置いた。 </li></ol> 3。免疫組織化学前述のように免疫組織化学を行った。1 <ol><li>脱パラフィンし、水分補給は、ラックにスライドを配置し、次の手順を実行します。 3X5分（5分間3回）、3X5分間100％エタノール、1 × 5分間、95％エタノール、1 × 5分間、70％エタノールキシレンは、3分間水道水を流しで洗う。 </li><li>ガラスビーカーに蒸留水で希釈した1 ×クエン酸緩衝液（サーモ科学- AP9003 - 500）の熱誘導エピトープ検索浸漬のスライドと抗原の検索。ホットプレート（必ずセクションドン&quot;tはスライドを落下させる）上で15分間煮る。室温で30分間冷却ソリューションは、。3X5分間1X PBSでスライドを洗浄します。 </li><li>内部過酸化の阻害は、15分間のガラスビーカーに0.3％過酸化水素（フィッシャーサイエンティフィック- BP2633 - 500 -希釈蒸留水で）とメタノールのスライド（フィッシャーサイエンティフィック- 452 - 4）を浸します。 3X5分間1X PBSでリンス。 </li><li>ブロッキングは10％正常ヤギ血清と組織をカバー。湿度の高いボックスにスライドを移し、室温で1時間インキュベートします。 3X5分間1X PBSでスライドを洗浄します。 </li><li>ヒト特異的カスパーゼ3（1:1,000、R＆Dシステム、AF835）、Ki67は（1:1、Dako社、15626）1X PBSで希釈した：一次抗体のセクションは、° C一次抗体と、以下の濃度で4℃で一晩インキュベートした。翌日の1X PBS 3 × 10分でスライドを洗浄します。 </li><li>二次抗体反応は、HRP標識二次抗体の2〜3滴（思い描くシステム）との組織をカバー。湿度の高いボックスでスライドを入れ、室温で1時間インキュベートします。 3 × 10分間1X PBSで洗浄する。 </li><li>検出は、製造元のプロトコールに従って、一次抗体の検出のための発色DABキット（ベクターラボラトリーズ- SK - 4100）のために開発。 </li><li>対比染色はヘマトキシリン​​（10-15秒でスライドを浸し<html> econdsは、）必ずドン&quot;TランDAB信号を作る。3分間水道流水ですすぎます。 </li><li>脱水浸し、次の順序でスライド、3X5分間キシレン5分、5分間95％エタノール、3X5分間100％エタノール、70％エタノール。 </li><li> permountマウンティング試薬（フィッシャーサイエンティフィック- SP - 15 - 100）を使用してスライドをスリップカバー。 </li><li>画像は、オリンパス蛍光顕微鏡（DP - 72）.3.11）を使用して撮影した。すべての実験では、特定のラベルは、一次抗体なしのネガティブコントロールにより確認された。 </li></ol> 4。代表的な結果： 我々は、多形性膠芽腫（GBM）の手術標本を集めた。患者がテモゾロミド（TMZ）を含む従来の化学療法なしで最初の手術を受けた。図- 1aのガドリニウム増強MRIのT1強調画像は、手術前に右前頭葉に強化された腫瘍を示した。術後の画像（図- 1b）は手術後の病変の小計除去を確認した。外科的組織は、臨床診断の目的のために病理部に送られ、そして残りの標本は、オハイオ州立大学メディカルセンターで承認された治験審査委員会（IRB）プロトコルの下で組織の調達に処理されました。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色では、壊死の存在、pseudopallisading細胞、および微小血管増殖（図1 - c）を示した。従って、これらの腫瘍は病理組織学的にGBMと診断された。注目すべきは、48時間までTMZなくインキュベーションを以下の腫瘍外植片は、GBMの細胞構築を維持した。対照的に、72時間以上のインキュベーションで、我々は腫瘍細胞の一部がに開始を示唆し、標本中の凝縮核数の増加に気づいたアポトーシスを起こす。その結果、より長いインキュベーション後の腫瘍組織では、優先的に壊死領域（データは示さず）で周辺が観察された腫瘍細胞を、失われた斑状の領域が含まれている。 これらの腫瘍外植片のサンプルを確実に薬効試験の目的のために利用できるかどうかを調べるために、我々は、TMZの治療の効果を試験した。図A - 2は、本研究における実験の流れを表しています。最近の研究では、TMZの腫瘍内注入は、この薬2の全身投与に比べて悪性神経膠腫の成長制御に関するより強力な効果を持っていることが示された。 16時間インキュベーション後、これらの外植片はパラフィンと連続切片で埋め込まれていた染色用に調製した。 TMZ処理したGBM組織の免疫組織化学では、対照試料と比較してのKi - 67陽性の腫瘍細胞の大幅な減少を示した。ターン、アポトーシスのマーカーと免疫組織化学、カスパーゼ3、でTMZ処理した神経膠腫の標本と対照サンプル（図A - 3）の間に有意差は得られなかった。 TMZによる治療効果は、さらにin vitroでの培養やフローサイトメトリーのどちらかと一緒にこの外植片アッセイを組み合わせることによって特徴付けられた。具体的には、幹細胞様の腫瘍細胞（SCLTC）への影響を判断するように努めた。したがって、TMZによる腫瘍治療後、我々はこれらの腫瘍外植片の分析とフローサイトメトリーを形成する球体を行った。 TMZ処理した試料は、個々の単一細胞に解離し、これらの単セルは、bFGFおよびEGFを添加した無血清培地で96ウェルプレートに（1リットルあたりのセルまたは低い）低密度で播種した。対照群では、腫瘍外植片からの腫瘍の球の形成は、7日間のインキュベーション後に観察された。球の形成がSCLTC 3 4のプロパティであることを考えると、薬物治療による腫瘍球数の変化はSCLTCへの影響を示している。同様に、細胞表面マーカー、CD133と解離腫瘍外植片のフローサイトメトリーは、SCLTCの効果を検証するために実施した。 GBMの異種腫瘍細胞におけるSCLTCが選択的に薬物治療で根絶されている場合、人はそのフローサイトメトリーは、処理によるCD133陽性割合（データは示さず）の減少を検出する必要が予測するかもしれない。 <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="図1"/> 患者のGBMのFigure.1磁気共鳴画像（MRI）。プレ操作図- 1aと後の操作図- 1bの代表人物。図- 1cは、新鮮なGBMの組織サンプルのH＆E染色である。オリジナルの倍率、40倍。 <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="図2"/> 図。 2ブロックの培養実験の実験的なフロー図 - 2A。新鮮な外科GBMの画像は、病理学の部門から受け取った。図- 2bは、ヘルプ外科ブレードと10ミリメートルの小さな部分に腫瘍ブロックの解剖を示しています。図- 2cは、インスリンの注射器を用いて腫瘍ブロックの薬剤（TMZ）治療です。 E 3&quot;/&gt; 図。活性化カスパーゼ-3とKi67とDMSOまたはTMZを注入GBM組織ブロックの3免疫組織化学。免疫組織化学。ヘマトキシリン​​は核染色のために使用されていました。オリジナルの倍率、40倍。

<ol>
	<li>Hemmati, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancerous+stem+cells+can+arise+from+pediatric+brain+tumors.">Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).</li><li>Heimberger, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+delivered+by+intracerebral+microinfusion+is+safe+and+efficacious+against+malignant+gliomas+in+rats.">Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats.</a> Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).</li><li>Nakano, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+embryonic+leucine+zipper+kinase+is+a+key+regulator+of+the+proliferation+of+malignant+brain+tumors,+including+brain+tumor+stem+cells.">Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells.</a> J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).</li><li>Laks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosphere+formation+is+an+independent+predictor+of+clinical+outcome+in+malignant+glioma.">Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma.</a> Stem Cells. 27, 980-987 (2009).</li><li>Phillips, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+subclasses+of+high-grade+glioma+predict+prognosis,+delineate+a+pattern+of+disease+progression,+and+resemble+stages+in+neurogenesis.">Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis.</a> Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).</li><li>He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+Analysis+of+Glioblastoma+Stem+Cell+Differentiation.">Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation.</a> J Proteome Res. , (2010).</li><li>Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+markers+and+proliferative+labeling+on+glioma+cell+lines].">Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines].</a> Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).</li><li>Vik-Mo, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cells+maintain+overall+phenotype+and+tumorigenicity+after+in+vitro+culturing+in+serum-free+conditions.">Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions.</a> Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).</li><li>Hovinga, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+notch+signaling+in+glioblastoma+targets+cancer+stem+cells+via+an+endothelial+cell+intermediate.+Stem+Cells.">Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells.</a> 28, 1019-1029 (2010).</li><li>de Groot, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+invasion+after+treatment+of+glioblastoma+with+bevacizumab:+radiographic+and+pathologic+correlation+in+humans+and+mice.">Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice.</a> Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

現在前臨床実験モデルにおける薬効および患者における有効性の間にギャップがある。具体的には、脳腫瘍の研究分野、新たな信頼性の高い方法で現行の方法や患者の有効性と薬物評価との間の既存のギャップを埋める手助けすることを要求され​​る。この研究では記載のアッセイは、影響を受けた患者の実験データと結果の不一致を充填容易にするソリューションを、追加の資産であり、そうでない場合。 in vitroの培養細胞に優先的に関係なく、培養条件の特定の腫瘍細胞のタイプを展開し、腫瘍全体の唯一の亜集団を表す。5を加えて、人工的な細胞の増殖の遺伝子と表現型の変換が発生し、長期的な細胞培養では避けられない。悪性神経膠腫を治療するための主要なハードルの1つは、単一の腫瘍内および腫瘍サンプル6,7の間に両方とも、腫瘍細胞の不均一性である。したがって、関係なく、一種類または別の腫瘍細胞の特定の集団の選択的濃縮には、異種腫瘍細胞上の任意の化学療法剤の有効性を判断するために適切な手段ではありません。の亜集団から派生した脳腫瘍の8 9任意の動物モデル腫瘍細胞は小集団での薬効のランプではなく、腫瘍全体を流した。 いくつかの制限が、その一方で、依然としてこの腫瘍外植法に残ります。そのような制限は、治療の比較的短い期間です。悪性腫瘍の細胞が時間をかけて治療、ほとんどに耐性を獲得すると考え、すべてではないされているので、最近で報告されたとして、短期的な腫瘍細胞増殖の初期制御は、長期的な患者の予後に反映されない場合があります抗血管新生阻害剤、ベバシズマブ10。したがって、長時間の組織を維持するために、この植アッセイのためのプロトコルの改善は今後の調査で必要になります。別の質問では、腫瘍のSCLTC上でテストされた薬剤の特定の効果です。 SCLTCは悪性神経膠腫のための現在の治療に比較的耐性のある、強力SCLTCを根絶する新規抗がん剤の同定が正当化されることを考える。この点に関し、我々は現在、ニューロスフェア形成アッセイなどのin vitroの実験、（データは示さず） の後続でこの外植片アッセイを組み合わせることを目指しています。我々は、これらを組み合わせたアッセイを通してSCLTCで薬剤候補の、もしあれば、効果についての詳細を学ぶことを期待しています。最後に、腫瘍サンプルの小さなブロックを使用するなどの手術標本から、従来の腫瘍細胞株や初代培​​養の場合と同様に、腫瘍全体の細胞集団を反映していない場合があります。さておき、これらの問題は、血管ニッチを含む腫瘍間質を、維持し、腫瘍細胞のための環境要因を特徴付けるのに有用です。したがって、このアッセイでは、より生理学的に妥当な条件の下で任意の治療戦略を評価する可能性があります。 ここでは、GBMの手術標本の植付薬効試験のためのアッセイを確立した。実際には、テスト済みの手術標本で、我々は、TMZの直接注入がGBMの試料の増殖を減少させることがわかった。この組織片の方法は、他の固形がんへの理論的に適用でき、うまくいけば私たちはがんの臨床試験で別の障害を回避することに役立つ患者の腫瘍に対する薬物の有効性を、決定するために資産を提供します。

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、修飾、熱不活化</td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12（1X）液体午前1時01分</td><td>インビトロジェン</td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td>粒状化、精製した寒天</td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td>染色のためのDPBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> RichalrdアランSCI </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10パーセントw / vのホルマリンのCaspase - 3 </td><td>リッカの化学会社</td><td> 3810 </td></tr><tr><td>カスパーゼ-3 </td><td> R＆Dシステム</td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td>ダコ</td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマ</td><td> D2650 </td></tr><tr><td>システム-抗マウス想像する</td><td>ダコ</td><td> 2012〜07 </td></tr><tr><td>想像するシステム - 抗ウサギ</td><td>ダコ</td><td> 2011〜12 </td></tr><tr><td> DAB -キット</td><td>ベクトルラボ。 </td><td> SK - 4100 </td></tr></table> 表1。材質。 <table border="1"><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>グライナーバイオone </td><td> 657160 </td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td>血清用ピペット</td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td>フィルタのヒント</td><td>米国科学的</td><td></td></tr><tr><td>が500μmポリエステルメッシュNetwe​​llインサート</td><td>共演スター</td><td> 3480 </td></tr><tr><td>マトリゲルマトリックス</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD 10mLの注射器</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 309604 </td></tr><tr><td>皮下注射針のアルミハブ。 </td><td>タイコヘルスケア</td><td> 2000029 </td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td>薄肉管</td><td>イートン</td><td> 1107A </td></tr><tr><td>外科用ブレードステンレス鋼</td><td>フェザー</td><td> 2976＃10 </td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>コンフォートポイント</td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50mLのフラットトップスクリューキャップチューブ</td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> DP - 72 </td></tr><tr><td> Forcep </td><td>フィッシャー科学</td><td></td></tr></table> 表2。装備。

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

悪性神経膠腫のための現在の治療は姑息的効果を持っている。治療法の開発のために、一つのハードルは、現在の薬効試​​験や患者への有効性によって決定される有効性の不一致です。したがって、薬効を評価するための新規かつ信頼性の高い方法は、前臨床段階では保証されています。細胞株を含む腫瘍組織のin vitro培養 、細胞培養の人工的な環境によって引き起こされる癌細胞の実質的な、表現型の遺伝、およびエピジェネティックな変化を持って、どのその場で元の腫瘍の生物学を反映しない場合があります。免疫不全マウスを用いた異種移植モデルも限界、すなわち、免疫システムの欠如があり、微小環境における遺伝的およびエピジェネティックな矛盾を種間。ここで、我々は、治療効果を評価するために解離していない腫瘍のブロックなどの悪性神経膠腫の手術標本を用いて新規な方法を示しています。この方法を検証するために、現在のファーストラインの化学療法剤、テモゾロミド（TMZ）、とのデータが記載されている。 我々は我々の実験のための悪性グリオーマの新たに除去された手術標本を用い。我々は手術標本でのインキュベーションおよび分析に続いて、TMZまたは他の医薬品候補の腫瘍内注入を行った。ここでは、我々は、少なくとも、現在いくつかの制限を克服し、現在の実験の間に、既存のギャップを埋めることができるかもしれないように、新規抗がん治療の有効性を決定するためのプラットフォームとして腫瘍組織の外植片の方法を確立しようとしたデータと実際の患者の腫瘍に対する有効性。このメソッドは、固形がんの治療のための新規化学療法剤を同定する加速する可能性があるかもしれません。

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

ここで、我々は、&quot;腫瘍外植法&quot;と呼ばれる脳腫瘍の手術標本での薬効試験のための方法を確立した。この方法では、我々は、固形腫瘍の微小環境を壊すことなく、薬効を評価することができます。この方法の信頼性を検証するために、我々は、現在のファーストラインの化学療法剤による治療を受けた私たちの神経膠腫の標本とテモゾロミドの代表的なデータを記述する。

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

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16.5K ビュー.  The Ohio State University Medical Center. ここで、我々は、"腫瘍外植法"と呼ばれる脳腫瘍の手術標本での薬効試験のための方法を確立した。この方法では、我々は、固形腫瘍の微小環境を壊すことなく、薬効を評価することができます。この方法の信頼性を検証するために、我々は、現在のファーストラインの化学療法剤による治療を受けた私たちの神経膠腫の標本とテモゾロミドの代?...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

医学

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

術後免疫抑制のメカニズムを探索し、新しい周術期免疫療法を評価するための手術侵襲のマウス腫瘍モデル

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

動静脈瘻の障害の新規マウスモデル：詳細の外科的手順

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

腫瘍微小環境と標的薬物療法研究のための脳の腫瘍/器官スライス共培養系

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.