当社のプロトコルは、他の分子分析方法と互換性があり、薬物がタクト組織スライスの生存率と中スループットスクリーニングのパフォーマンスにどのような影響を与えるかの評価を可能にします。この技術の主な利点は、非常に少ない前処理または後処理で、組織全体のスライスの生存率をリアルタイムで測定できることです。この技術は、患者の腫瘍組織サンプルから直接取得した薬剤候補または組織スライスを試験することによって、前臨床薬の開発および腫瘍学を加速する。
当社のリアルタイム組織生存率評価法は非常に汎用性が高く、がん生物学、神経科学、発生生物学の研究に応用できます。タクト内の実行可能な組織スライスを準備することは、手順の成功の鍵です。中組成のビブラートーム設定は、組織の種類とハリに応じて調整する必要があります。
腫瘍組織スライス取得の日に、アリコート250マイクロリットルの組織スライス培養培地をウェル当たり24ウェルプレートに入れ、各ウェルに1つの組織培養液を挿入する。その後、使用するまで5%の二酸化炭素を加湿した37°Cの加湿インキュベーターにプレートを置きます。腫瘍組織断片を取得するには、10センチメートル培養プレートに氷冷HBSSに腫瘍組織を沈め、メスを使用して組織を半分に切断する。
6ミリメートルの生検パンチを使用して腫瘍組織のシリンダーを取得し、各シリンダーの一端をトリミングして平らな表面を作ります。新鮮な氷冷HBSSにティッシュピースを置き、ビブラートメをオンにします。すべての装置を70%エタノールで消毒し、アクリルガラスの蓋で覆われたビブラートメバッファートレイをビブラートメ氷浴の中央に置きます。
お風呂に氷を加え、バッファトレイに冷たいHBSSを充填します。刃ホルダーにカミソリの刃をロードし、慎重に生検パンチ腫瘍サンプルを選択するために歯付き鉗子を使用します。標本の版に医学等級のシアノアクリル酸接着剤の滴を加える。
余分なバッファーを取り除き、直立した安定した位置のドロップにティッシュのシリンダーを取り付けるために、糸くずのないペーパータオルの上にティッシュをダブ。空気乾燥の2〜3分後、プレートをバッファトレイに入れ、組織がバッファに完全に浸されるまで、さらにHBSSをトレイに追加します。その後、バイブロックにアイストレイとバッファートレイアセンブリを配置し、腕をロックすることにより、ビブラートメを組み立てます。
ビブラートメ切断の厚さを250マイクロメートル、振幅を3ミリメートル、スライス速度を0.01~0.25ミリメートル/秒、ブレード角度を15~21度に設定します。ブレードの開始位置と終了位置を設定し、ステージの高さを調整します。ティッシュが均一に切断されるまで、数サイクルのスライスをカットするために連続モードで機器を実行します。
広い先端移動Bipedを使用して、スライスと少量のHBSSを、以前に調製した24ウェルプレートの各ウェル内の個々の細胞培養インサートに移し、細かい先端転送Bipedを使用してウェルから余分なバッファーを除去します。サンプルの終わりに達したら、新しい組織を取り付け、十分なサンプルが得られるまで追加のスライスを得る。その後、細胞培養インキュベーターで組織スライスを24〜48時間培養する。
組織スライスの生存率を測定するには、ルシメラーゼとプロ基板の両方を含む発光ベースの生存率測定試薬を製造者の指示に従って新鮮な組織スライス培地中の1〜1000希釈で調製し、24ウェルプレートの各ウェル内の培地を混合物に交換する。各組織スライスに50マイクロリットルの酵素基質混合物を加え、加湿されたインキュベーターの中の軌道シェーカーにプレートを置き、摂氏37度で穏やかな攪拌を行い、一晩で5%の二酸化炭素を混ぜます。翌朝、適切な設定を使用してマイクロプレートリーダーの各ウェルの発光信号を測定します。
組織スライスのベースライン生存率を決定した後、目的の薬物を組織スライス培養培地に溶解し、10倍のストック溶液を得て、各組織スライスの底部の培養液に各10倍の薬物溶液を添加する。各ウェルの底から各組織スライスに薬物補充培地の50マイクロリットルを移し、一晩軌道シェーカーにスライスを返します。翌朝、培養プレートを振盪せずにサブカルチャーインキュベーターに移し、適切な実験時点でマイクロプレートリーダー上の各組織サンプルの発光強度を測定する。
各時点での処置された腫瘍組織の生存率は、示された式を用いて計算することができる。マウス乳癌腫瘍サンプルから調製された組織スライスの生存率は、時折中期的な交換で少なくとも21日間維持することができる。マルチキナーゼ阻害剤による4日間の治療は、ジメチルスルホキシドで治療した腫瘍組織の制御と比較して、発光シグナル強度を100倍に減少させる。
同じ阻害剤の半分の濃度での治療は、早ければ1日目に発光を低下させ、4日目に最低レベルに達し、その後の測定された時点ごとに低いままである。対照的に、制御された腫瘍組織群の発光強度は、6日間培養を通じて安定したままである。さらに、4日間の阻害剤の連続投与によるマウス乳癌腫瘍スライスの治療は、薬物の半分最大有効濃度におけるスライス生存率の用量依存的変化を示す。
標準的な化学療法薬であるドキソルビシンで治療された患者由来の異種移植片も、生存率の用量依存性の変化を示す。さらに、単一バルク患者由来異種移植片から調製された組織スライス上の三重での17の前臨床および臨床的に承認された薬物の試験は、ネイティブの腫瘍微小環境を有する腫瘍スライスに対して中スループット薬物スクリーニングを行うことができるという概念の証明を提供する。腫瘍組織サンプルを調製する際には、組織の損傷を避けるために、組織スライスとの接触を最小限に抑えるように注意してください。
この方法は、IHC、フローサイトメトリー、単一細胞シーケンシングなどの他のアプローチと結合して、組織から空間的および単一細胞情報を取得することができます。我々の技術は、時間の経過とともに生理学的条件下で様々な用量で関心のある複数の薬物の効果のテストを可能にする。未知の病原体状態の腫瘍から組織スライスを調製する場合は、バイオセーフティキャビネットですべての手順を実行してください。
