Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
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これらの研究は、部分的には、オルタナティブ研究開発財団（107588）、国立衛生研究所（1U54CA136465-04S1）、およびカリフォルニア乳がん研究プログラム（201B-0141）からの補助金により、賄われた。私たちは、博士に感謝。彼らの寛大な寄付のためのアンドリュー·ウィルバーとR.スコット·マッキバー<pkt2 lubig=""> transponsonおよびPK / hUbiC-SB11トランスポザーゼプラスミド。私たちは感謝ジョンTamaresis、博士号を認めるTHR標本の収集を容易にするための統計的手法、移行のアッセイにアドバイスをフローサイトメトリー、ジョーゼットHenrichを実行するためのティモシー·ブラウン、そしてナンシーBellagamba上のアドバイス。 </pkt2>

大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目THR手術を受けている患者から採取した。すべての組織は、スタンフォード大学の研究コンプライアンス室の規則に従って匿名化検体として採取した。 1。乳癌細胞株（複数可）を選択する<ol><li>取得またはルシフェラーゼ-GFPレポーター構築物を有する所望の乳癌細胞株（複数可）をトランスフェクトする。以下の実験は、 スリーピングビューティートランスポゾンプラスミドPKT2 / LuBiGトランスフェクションすることによってMDA-MB-231およびMCF-7乳癌細胞株ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作（Fluc細胞）および高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用いて行った。とトランスポザーゼプラスミドPK / hUbiC-SB11 45,46。 注：トランスフェクトされた細胞株は、MDA-MB-231-Flucを-EGFPおよびMCF-7-Fluc細胞-EGFPと呼ばれている。 </li></ol> 2.組織Fの分離大腿ヘッドからragments <ol><li> THR手術後、生理食塩水で満たされた無菌の容器に廃棄された大腿骨頭を収集する。研究所に検体を移し、手術の1-3時間以内にそれを処理する。注：処理の遅延がある場合には、4℃で試料を置く。 </li><li>実験の各タイプについては、以下に定める滅菌手袋、外科鉗子、ピンセット、器具をすすぐために、70％イソプロパノールでビーカー、および組織培養容器：層流の組織培養フード内で吸収マットの上、以下の項目を配置することによって、作業領域を準備する。 </li><li>無菌手術用手袋を身に着けていることは、片方の手で丸い大腿骨ヘッドを保持する大腿骨の露出した上軸から希望のサイズ（〜2〜5ミリメ​​ートル）の小柱骨片を抽出する一方で骨鉗子を使用する。増殖のタイプに応じて、培養容器（ 例えば、6-、12-、または24ウェル組織培養プレートまたは遊走チャンバー）内に骨片を移し、コルonizationまたは遊走実験手順3、4または5に記載の方法。 注：上記のように骨組織断片は、それぞれ特定の増殖、コロニー化または移行アッセイのための最初のステップを完了した後に収穫する必要があります。 図2に示すように、断片は、サイズの範囲であろう。フラグメントの前または標準化の目的のために実験後に秤量することができる。 </li></ol> BLIを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断片に隣接3.共培養乳癌細胞<ol><li>実験の前に、/50μlの2×10 5乳癌細胞を含有する懸濁液を調製し、培養物中の骨片を固定するための骨ワックスのプラグを用意する。 3ピースにP200のマイクロピペットチップをカットし、骨ワックスの小さい（〜35 mg）の作品をカットする「クッキーカッター」の方法で最大の作品の狭い方の端を使用しています。ペトリ皿に骨ろうプラグを排出する最小単位の広い方の端を使用してくださいストレージ用。 </li><li>各ウェルの12時の位置に骨ろうの部分を置き、静かに滅菌手袋をはめた人差し指で押し下げます。 </li><li>ピペット6ウェルプレートの各ウェルの中央にDMEM-10％FBS +ペニシリン-ストレプトマイシン中で1×10 5乳癌細胞を含む細胞懸濁液50μl。 （あるいは、必要に応じて分散されたパターンでシード細胞が）、細胞付着を促進するために、45分間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。 </li><li>各実験ウェルについての骨のワックスの1枚に1骨片を置き、それを確保するために骨鉗子で穏やかな圧力を適用します。下の3つのウェルのみをコントロールとして、骨のワックスを含有しながら、与えられたTHR標本から3骨片は、トップ3ウェルに入れられるように三連で実験を行う。 </li><li>を5mlピペットを用いて、穏やかにゆっくりと乳房細胞または骨断片を追い出し回避するために、各ウェルの側にDMEM-10％FBSを5ml提供。 37でプレートを置き76; 20〜24時間、C組織培養インキュベーター。 </li><li>生物発光イメージング（BLI）を実行するために、各ウェルに（300μgの/ mlの濃度を達成する）インキュベーターからプレートを除去し、ルシフェリン基質を加える。イメージは、次のパラメータを用いてIVISイメージングプラットフォーム上ですぐにプレート：1のFストップ、小さなビニング、1秒の露光時間は、レベルD.は、信号それぞれの強度だけでなく、平均的な輝き（光子/秒/平方センチメートルを測定/ステラジアン）。 </li><li>すべての実験およびコントロールウェルについての平均輝きを定量するために関心領域（ROI）の領域を定義するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 Excelシートにエクスポート平均放射輝度値は、統計を実行し、グラフを生成する。 </li></ol> 4.共培養コロニー形成を研究する骨の断片上に直接播種乳癌細胞と細胞数<ol><li>直接24ウェル組織培養プレート（1断片/ウェル）の空のウェルに骨片を配置するために鉗子を使用する。 </li><li>ピップ各骨片の上に直接1 X 10 3-6乳がん細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をETTE。細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。静かにフラグメントが完全に培地中に沈められていることを各ウェルなどの側面に1〜2ミリリットルDMEM-10％FBSを追加します。 20-24時間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、各ウェルを1mlのDMEM-10％FBSを含有する新鮮な24ウェルプレートに、各骨組織フラグメントを転送するために鉗子を使用する。 BLIを実行するには、手順上記の3.6から3.7に従ってください。さらに、断片は、蛍光顕微鏡を使用して表示、またはステップ6で説明したように、乳癌細胞数および特性の分析のための骨髄集団を得るためにフラッシュされる。 </li><li> BLI、ピペット蛍光ビスホスホネート標識溶液を5μl（事前以下の蛍光顕微鏡で定性的な評価のための完全な断片を製造するために、骨片の鉱化骨片を標識するために、各ウェルに）、製造業者の指示に従って比べ。さらに24時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>蛍光ビスホスホネート標識溶液中での培養の24時間後に、画像GFP（485 nm）であり、ビスホスホネートラベル（680 nm）に設定され、蛍光顕微鏡を用いて、フェノールレッドを含まない培地とビューを含む組織培養プレートにフラグメントを転送するために鉗子を使用する。 </li></ol> 5.骨組織フラグメントに乳癌細胞の移行を測定し、培養骨断片上清<ol><li>骨組織培養上清の方へ移行。 注記：特定のTHR標本から3断片を3上清を生成するために使用されるような三連での実験を行います。各実験について、マイグレーションが骨上清対コントロール培地のみを含む3つのウェルを含む3つのウェル間で比較される。 <ol><li>骨のTISの生成ウェル当たり2.2ミリリットルDMEM-10％FBSを含有する12ウェルプレートのウェルに、骨片を配置することにより、上清を訴える。 24時間、37℃の組織培養インキュベーター中で培養。 24時間後に培地を撤回し、2.2ミリリットルの新鮮なDMEM-10％FBSを交換してください。 DMEM-10％FBSを同じように含有処理対照ウェル。 注：培地は、手術に起因する組織損傷に応答して分泌された因子を除去するために24時間後に変更される。骨組織の上清を、FBS含有培地中で生成されるので、FBS含有培地を含むウェルのみ乳癌細胞遊走に対するFBSの寄与を制御するために含まれる。 </li><li> 48時間後に、レシーバプレートのウェルに各上清/対照培地とピペット0.9mlの収集。インサートは、後に、これらのウェルに配置される。挿入物を播種しながら組織培養インキュベーター中レシーバープレートをインキュベートする。注：残りの上清（蒸発後〜1ml）をセクレトーム事実上の分析のために収集することができるRS場合は44を希望する。 </li><li>トランスウェルインサートをシードするには、標準の、空の24ウェル組織培養プレートに入れます。 図1Aに示すように、各インサートの上部の、内膜表面にDMEM-10％FBS中に1×10 5個の乳癌細胞を含むピペット350μlの細胞懸濁液。付着を促進するために45分間37℃で組織培養インキュベーター中に播種された挿入物を含有する24ウェルプレートを置く。 </li><li>細胞をインサートに取り付けた後、製造業者の説明書に従って受け板にインサートを転送するために鉗子を使用する。角度インサート膜とウェル上清受信機との間の気泡の形成を防止するだけでなく、受信機にそれを置く各インサート。 37℃の組織培養インキュベーター中で20時間インサートレシーバープレートをインキュベートする。 注：インサート膜と受信機の間に気泡のためのレシーバープレートの下側​​を確認してもsupernatanトン。泡が表示されている場合は、特定のインサートを削除し、気泡が存在しないまでも受信機に再配置します。 </li><li> 20時間後、レシーバープレートからのインサートを削除する鉗子を使用しています。ステップの手順を使用すると、3.6から3.7イメージにに​​移行し、レシーバプレートウェルの底部に取り付けた細胞をBLIを行う。 </li></ol></li><li>骨組織片の方へ移行。 注記：特定のTHR標本から3フラグメントは、3つの別々のインサート内に配置され、3ガラスビーズを対照として、3つの別々のインサート内に配置されるように三連での実験を行います。 <ol><li>各ウェルに0.9ミリリットルDMEM-10％FBSをピペッティングすることによりレシーバプレートを準備します。挿入を準備している間、組織培養インキュベータにそれを置きます。 </li><li>挿入を種子に、蓋を持つプラスチック製のマイクロチューブボックスの表面にそれらを反転。 dは1×10 5乳癌細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をピペットirectly（反転インサート上で上を向いている）各挿入膜の外、底面に。蓋付きのマイクロチューブボックスが開いて割れてカバーし、細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養器に移す。 </li><li>組織培養フードにマイクロチューブボックスを転送し、右側アップシードの挿入をオンにし、レシーバプレートのウェル中にそれらを転送するために鉗子を使用する。各インサートカップにピペット0.450ミリリットルDMEM-10％FBS。ピンセットを用いて、それぞれの準備インサートカップにつの骨組織片（約3 mm）を転送する。必要に応じて、追加のウェルにおけるネガティブコントロールとしてガラスビーズを使用しています。 20時間組織培養インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li>遊走を測定するために、ウェルあたり1mlのDMEM-10％FBSを含有する標準的な24ウェル組織培養プレートを準備する。インキュベーターからレシーバープレートを取り外し、それぞれから骨片とビーズを転送するために鉗子を使用する標準プレートの別々のウェルに挿入します。ルシフェリンを追加基板を各ウェルに（300μgの/ mlの最終濃度を達成するため）、ステップ3.6から3.7までの手順を使用してBLIを行う。 </li></ol></li></ol> 6.追加前後の実験的解析<ol><li>フラッシュされた骨髄の分析。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブの最上部に配置された70μmのセルストレーナーに骨片を転送します。激しくコニカルチューブに骨髄細胞の懸濁液を得るために10mlのPBSで断片をフラッシュするために25 G針を用いた10mlの注射器を使用する。遠心分離機300×gで21℃で3分間、細胞懸濁液を、上清を吸引し、PBSまたはフローサイトメトリーのための他の所望の溶液中で細胞ペレットを再懸濁する。 注：再懸濁体積は遠心分離後の細胞ペレットのサイズは、用途に応じて変化する。 </li><li>生存率アッセイのため〜PBSの75〜300μlの体積は適切であり、これらの懸濁液は、市販fluorescencを用いて分析することができる電子基づく生存率アッセイは、製造業者の指示に従って、従来の血球計数器にピペットで入れ、倒立蛍光顕微鏡を用いて計数した。 </li><li> GFP陽性乳癌細胞の検出に基づいてフローサイトメトリー分析またはソーティングのために、濃度が1×10 6細胞/ mlであることFBS、2mMのEDTA、および10mM HEPES、例えば2％を含有する1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol></li><li> H＆E染色および免疫組織化学。 <ol><li>ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）染色および/または免疫組織化学のための断片を処理するには、番号2鉛筆で標識されたプラスチック製のカセット内の断片を配置し、24時間、10％緩衝ホルマリンを満たした容器に水没。 </li><li>パラフィン包埋のためのプロセス組織切片、各フラグメント内鉱化骨片を考慮して脱灰工程を含む慣用のプロトコールを用いて染色する。 </li></ol></li></ol>

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Mehra らは以前に、高品質の組織を明らかにし、転移プロセス47を研究するためのヒト骨髄サンプルの使用を検証し、剖検時に採取し、転移性前立腺癌患者の骨片の死後の収集と分析を記載している。ここでは、収集、処理および乳癌細胞移動、コロニー形成及び増殖を研究するための短期共培養系におけるTHR手術後の破棄大腿骨頭から得られたヒト骨組織の断片を使用するた?...

腫瘍微小環境は広く、乳癌の進行および転移拡散1-3中の癌細胞の挙動の重要な決定因子として認識されている。ここに提示された方法の目的は、人間の骨組織、乳癌転移4-6の最も頻繁な部位の微小環境内での乳癌細胞の研究を容易にすることである。骨は、細胞と転移進行10,11に関与する分泌因子を抱くどちらも、鉱化と骨髄コンパートメント7-9で構成されている。広く生体マウスモデルで使用されるが、転移プロセス12-15の全身研究を促進、スケルトン内の細胞の相互作用は観察と直接摂動のために容易にアクセスすることはできません。マウス骨髄組織およびマウス骨髄細胞がより良いアクセスを提供し、クロストークおよび乳癌セルmのメカニズムに関する多くの知見が得られている研究及び培養するためのモデル系ネズミスケルトン16-22のetastasis。しかし、研究は、骨組織23,24のためosteotropismの種特異的なパターンが存在し得ることを示唆している。これらのパターンは、骨の可能性の決定因子である全てが骨組織の特性に固有の種特異的な差異は、免疫欠損マウス11、及び/又は実験に使用したマウスは、比較的若い年齢で変化した骨髄集団から得られた差を反映している可能性が微小環境。 インビトロでは 、典型的には、骨髄由来の骨芽細胞または単層として培養された間質細胞として、または操作された3次元モデル系25〜35内の特定の骨の細胞型に焦点を当ててきたヒト骨共培養において乳癌細胞を研究するために近づく。 2次元の細胞培養モデルは、in vitroでの柱を形成し、がん研究のために近づいているが、それは長い細胞の挙動は基本メートルに変更されることが認識されている培養系18,36,37 onolayer。これは、コラーゲンのような天然材料からなるマトリックス - 足場ベースのモデルを含む3次元の生体組織の複雑性を模倣工学的微小環境が開発された、または合成ポリマーが組織様微小環境を作成するために特定の細胞型を播種36-41。工学的ア ​​プローチも制御し、微小環境18,19,41-43のホルモン環境を研究するためのバイオリアクタープラットフォームの使用が含まれている。バイオミメティックモデル及びバイオリアクターを制御する設定で複雑 ​​な組織微小環境の多くの要素を提供し、成功した骨18,19,35,42,43の乳癌転移の研究を進めるために適用されているが、操作されたモデル系は、一般的に内蔵されていない天然の骨の環境内に存在する細胞型および細胞外マトリックス成分の全スペクトル。 最近まで、乳癌細胞は、ヒト骨組織の天然の、無傷の、3次元微小環境内で検討されていない。我々は最近、（THR）手術が44標本人工股関節全置換から単離されたヒト骨組織フラグメントを用いた共培養モデルの開発を報告した。これらの標本は、短期培養でマイクロ転移のメカニズムを研究するために必要な鉱化と骨髄コンパートメントの両方を抱く。以前の研究では、骨片44（MDA-MB-231-Fluc細胞）とを共培養し、ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞の増殖をモニターするために生物発光イメージング（BLI）を使用するための原理の証明を確立した。ここでは、乳癌細胞癌の増殖、コロニー化、及びヒト骨組織外植片を使用して、ネイティブの微小環境のコンテキスト内での移行を研究するための詳細な実験プロトコルを提示する。 まず、乳房を測定するための骨片に隣接する共培養乳癌細胞のためのプロトコルを提示BLIを使用して細胞増殖。このセクションでは、乳房の細胞懸濁液を骨ろう片により固定される骨片に隣接する6ウェルプレート中の細胞スポットとして播種する。対照ウェルは、骨のワックス、ない骨片が含まれている。セルスポットがアタッチすると、培地を添加し、プレートをBLIにより測定される生物発光シグナル強度（細胞数に関連する）、その後24時間、培養されている。次のステップでは、コロニー形成および増殖を研究するために、骨片に直接播種共培養乳癌細胞のための方法を提示する。ここでは、乳房細胞懸濁液をコロニー形成細胞数を追跡するために時間をかけてBLI、蛍光顕微鏡により培養物中に監視された骨組織断片上に直接ピペットで移す。この方法では、骨髄区画は、フローサイトメトリー、または骨髄生存率アッセイによりコロニー形成さ乳癌細胞の解析のために任意の時点での骨片から洗い流すことができる。 さらに、我々はデ乳癌細胞遊走を測定するための2つの異なるアプローチをスクライブ。第一の方法のステップは、骨組織培養上清に向かって移動を測定するために概説されている。このプロトコルでは、乳癌細胞は、内側に播種され、トランスウェルの上面は、（ 図1Aに示されるように）8μmの孔径を有する膜を挿入する。挿入物は、次いで、骨組織上清または対照培地を含有するウェルを有する受け板内に配置される。 20時間のインキュベーション期間にわたって、乳癌細胞の少数がダウンそれらがBLIによる検出に取り付ける下部組織培養ウェルへの挿入膜を通って移動する。第二の移行方法で乳癌細胞をトランスウェルインサート膜の下側、外表面上に播種される。骨組織断片を挿入カップおよび乳癌細胞内に配置される（ 図1Bに示すように）骨片にコロニーを形成するために、膜を通って移行し、これその後、BLIを使用して画像化される。

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Supplement all McCoy&#039;s&amp;nbsp; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&amp;nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Supplement media used for transfected cell lines.</td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &amp;mu;m pore size)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 70 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Bone wax</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Imaging Platform</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&amp;nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Version 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

骨は、乳癌転移の最も一般的な部位である。それは広く微小環境に影響を与える癌細胞の挙動が認められているものの、ほとんどは人間の骨組織の天然の微小環境内での乳癌細胞の特性および動作について知られている。我々は、追跡定量化の微小環境内でのヒト乳癌細胞を調節するためのアプローチを開発した人工股関節全置換手術の後に廃棄された大腿骨頭から単離された培養されたヒト骨組織断片。ルシフェラーゼおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のために操作乳癌細胞を用いて、我々は、再現性生物発光イメージング（BLI）を用いて、遊走および増殖パターンを定量することができ、蛍光顕微鏡を用いて、骨片内のトラックの細胞の相互作用、および後の乳癌細胞を評価するフローサイトメトリーでのコロニー形成。このモデルの主な利点は、1）ネイティブ、アーキテクチャ的に無傷組織のマイクロE関連するヒト細胞型を含み、かつ迅速な定量的および定性的な監視と乳癌および骨細胞の性質、行動や相互作用の摂動を促進する微小環境、2）直接アクセスnvironment。主要な制限は、現在では、短期培養の研究のウィンドウを閉じ込める組織断片、有限の生存能力である。モデルシステムのアプリケーションは、乳癌および転移性のニッチ内の他の骨求め悪性疾患の基礎生物学を研究し、効果的に骨組織中の乳癌細胞を標的とする治療戦略の開発を含む。

大腿ヘッドから組織片を分離大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目人工股関節全置換術を受けた男性と女性患者（年齢の44から90歳）の同数から収集した。各廃棄された大腿骨頭は、鉱化骨片と骨髄から構成される小柱骨組織を保有上部の大腿骨の小部分が含まれています。この組織は、小さな断片を抽出するために、外科骨鉗子を使用し?...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K ビュー.  Stanford University School of Medicine. プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。 

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Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

がん研究

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

医学

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

の調製と分析<em&gt;インビトロ</em&gt;三次元乳癌サロゲート

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

生物工学

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

生物学

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

要約

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この動画の章

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

の調製と分析

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

要約

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細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

の調製と分析

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

癌細胞の浸潤や衛星腫瘍形成を探検するための三次元培養アッセイ

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド