これらの研究は、部分的には、オルタナティブ研究開発財団（107588）、国立衛生研究所（1U54CA136465-04S1）、およびカリフォルニア乳がん研究プログラム（201B-0141）からの補助金により、賄われた。私たちは、博士に感謝。彼らの寛大な寄付のためのアンドリュー·ウィルバーとR.スコット·マッキバー<pkt2 lubig=""> transponsonおよびPK / hUbiC-SB11トランスポザーゼプラスミド。私たちは感謝ジョンTamaresis、博士号を認めるTHR標本の収集を容易にするための統計的手法、移行のアッセイにアドバイスをフローサイトメトリー、ジョーゼットHenrichを実行するためのティモシー·ブラウン、そしてナンシーBellagamba上のアドバイス。 </pkt2>

大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目THR手術を受けている患者から採取した。すべての組織は、スタンフォード大学の研究コンプライアンス室の規則に従って匿名化検体として採取した。 1。乳癌細胞株（複数可）を選択する<ol><li>取得またはルシフェラーゼ-GFPレポーター構築物を有する所望の乳癌細胞株（複数可）をトランスフェクトする。以下の実験は、 スリーピングビューティートランスポゾンプラスミドPKT2 / LuBiGトランスフェクションすることによってMDA-MB-231およびMCF-7乳癌細胞株ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作（Fluc細胞）および高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用いて行った。とトランスポザーゼプラスミドPK / hUbiC-SB11 45,46。 注：トランスフェクトされた細胞株は、MDA-MB-231-Flucを-EGFPおよびMCF-7-Fluc細胞-EGFPと呼ばれている。 </li></ol> 2.組織Fの分離大腿ヘッドからragments <ol><li> THR手術後、生理食塩水で満たされた無菌の容器に廃棄された大腿骨頭を収集する。研究所に検体を移し、手術の1-3時間以内にそれを処理する。注：処理の遅延がある場合には、4℃で試料を置く。 </li><li>実験の各タイプについては、以下に定める滅菌手袋、外科鉗子、ピンセット、器具をすすぐために、70％イソプロパノールでビーカー、および組織培養容器：層流の組織培養フード内で吸収マットの上、以下の項目を配置することによって、作業領域を準備する。 </li><li>無菌手術用手袋を身に着けていることは、片方の手で丸い大腿骨ヘッドを保持する大腿骨の露出した上軸から希望のサイズ（〜2〜5ミリメ​​ートル）の小柱骨片を抽出する一方で骨鉗子を使用する。増殖のタイプに応じて、培養容器（ 例えば、6-、12-、または24ウェル組織培養プレートまたは遊走チャンバー）内に骨片を移し、コルonizationまたは遊走実験手順3、4または5に記載の方法。 注：上記のように骨組織断片は、それぞれ特定の増殖、コロニー化または移行アッセイのための最初のステップを完了した後に収穫する必要があります。 図2に示すように、断片は、サイズの範囲であろう。フラグメントの前または標準化の目的のために実験後に秤量することができる。 </li></ol> BLIを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断片に隣接3.共培養乳癌細胞<ol><li>実験の前に、/50μlの2×10 5乳癌細胞を含有する懸濁液を調製し、培養物中の骨片を固定するための骨ワックスのプラグを用意する。 3ピースにP200のマイクロピペットチップをカットし、骨ワックスの小さい（〜35 mg）の作品をカットする「クッキーカッター」の方法で最大の作品の狭い方の端を使用しています。ペトリ皿に骨ろうプラグを排出する最小単位の広い方の端を使用してくださいストレージ用。 </li><li>各ウェルの12時の位置に骨ろうの部分を置き、静かに滅菌手袋をはめた人差し指で押し下げます。 </li><li>ピペット6ウェルプレートの各ウェルの中央にDMEM-10％FBS +ペニシリン-ストレプトマイシン中で1×10 5乳癌細胞を含む細胞懸濁液50μl。 （あるいは、必要に応じて分散されたパターンでシード細胞が）、細胞付着を促進するために、45分間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。 </li><li>各実験ウェルについての骨のワックスの1枚に1骨片を置き、それを確保するために骨鉗子で穏やかな圧力を適用します。下の3つのウェルのみをコントロールとして、骨のワックスを含有しながら、与えられたTHR標本から3骨片は、トップ3ウェルに入れられるように三連で実験を行う。 </li><li>を5mlピペットを用いて、穏やかにゆっくりと乳房細胞または骨断片を追い出し回避するために、各ウェルの側にDMEM-10％FBSを5ml提供。 37でプレートを置き76; 20〜24時間、C組織培養インキュベーター。 </li><li>生物発光イメージング（BLI）を実行するために、各ウェルに（300μgの/ mlの濃度を達成する）インキュベーターからプレートを除去し、ルシフェリン基質を加える。イメージは、次のパラメータを用いてIVISイメージングプラットフォーム上ですぐにプレート：1のFストップ、小さなビニング、1秒の露光時間は、レベルD.は、信号それぞれの強度だけでなく、平均的な輝き（光子/秒/平方センチメートルを測定/ステラジアン）。 </li><li>すべての実験およびコントロールウェルについての平均輝きを定量するために関心領域（ROI）の領域を定義するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 Excelシートにエクスポート平均放射輝度値は、統計を実行し、グラフを生成する。 </li></ol> 4.共培養コロニー形成を研究する骨の断片上に直接播種乳癌細胞と細胞数<ol><li>直接24ウェル組織培養プレート（1断片/ウェル）の空のウェルに骨片を配置するために鉗子を使用する。 </li><li>ピップ各骨片の上に直接1 X 10 3-6乳がん細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をETTE。細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。静かにフラグメントが完全に培地中に沈められていることを各ウェルなどの側面に1〜2ミリリットルDMEM-10％FBSを追加します。 20-24時間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、各ウェルを1mlのDMEM-10％FBSを含有する新鮮な24ウェルプレートに、各骨組織フラグメントを転送するために鉗子を使用する。 BLIを実行するには、手順上記の3.6から3.7に従ってください。さらに、断片は、蛍光顕微鏡を使用して表示、またはステップ6で説明したように、乳癌細胞数および特性の分析のための骨髄集団を得るためにフラッシュされる。 </li><li> BLI、ピペット蛍光ビスホスホネート標識溶液を5μl（事前以下の蛍光顕微鏡で定性的な評価のための完全な断片を製造するために、骨片の鉱化骨片を標識するために、各ウェルに）、製造業者の指示に従って比べ。さらに24時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>蛍光ビスホスホネート標識溶液中での培養の24時間後に、画像GFP（485 nm）であり、ビスホスホネートラベル（680 nm）に設定され、蛍光顕微鏡を用いて、フェノールレッドを含まない培地とビューを含む組織培養プレートにフラグメントを転送するために鉗子を使用する。 </li></ol> 5.骨組織フラグメントに乳癌細胞の移行を測定し、培養骨断片上清<ol><li>骨組織培養上清の方へ移行。 注記：特定のTHR標本から3断片を3上清を生成するために使用されるような三連での実験を行います。各実験について、マイグレーションが骨上清対コントロール培地のみを含む3つのウェルを含む3つのウェル間で比較される。 <ol><li>骨のTISの生成ウェル当たり2.2ミリリットルDMEM-10％FBSを含有する12ウェルプレートのウェルに、骨片を配置することにより、上清を訴える。 24時間、37℃の組織培養インキュベーター中で培養。 24時間後に培地を撤回し、2.2ミリリットルの新鮮なDMEM-10％FBSを交換してください。 DMEM-10％FBSを同じように含有処理対照ウェル。 注：培地は、手術に起因する組織損傷に応答して分泌された因子を除去するために24時間後に変更される。骨組織の上清を、FBS含有培地中で生成されるので、FBS含有培地を含むウェルのみ乳癌細胞遊走に対するFBSの寄与を制御するために含まれる。 </li><li> 48時間後に、レシーバプレートのウェルに各上清/対照培地とピペット0.9mlの収集。インサートは、後に、これらのウェルに配置される。挿入物を播種しながら組織培養インキュベーター中レシーバープレートをインキュベートする。注：残りの上清（蒸発後〜1ml）をセクレトーム事実上の分析のために収集することができるRS場合は44を希望する。 </li><li>トランスウェルインサートをシードするには、標準の、空の24ウェル組織培養プレートに入れます。 図1Aに示すように、各インサートの上部の、内膜表面にDMEM-10％FBS中に1×10 5個の乳癌細胞を含むピペット350μlの細胞懸濁液。付着を促進するために45分間37℃で組織培養インキュベーター中に播種された挿入物を含有する24ウェルプレートを置く。 </li><li>細胞をインサートに取り付けた後、製造業者の説明書に従って受け板にインサートを転送するために鉗子を使用する。角度インサート膜とウェル上清受信機との間の気泡の形成を防止するだけでなく、受信機にそれを置く各インサート。 37℃の組織培養インキュベーター中で20時間インサートレシーバープレートをインキュベートする。 注：インサート膜と受信機の間に気泡のためのレシーバープレートの下側​​を確認してもsupernatanトン。泡が表示されている場合は、特定のインサートを削除し、気泡が存在しないまでも受信機に再配置します。 </li><li> 20時間後、レシーバープレートからのインサートを削除する鉗子を使用しています。ステップの手順を使用すると、3.6から3.7イメージにに​​移行し、レシーバプレートウェルの底部に取り付けた細胞をBLIを行う。 </li></ol></li><li>骨組織片の方へ移行。 注記：特定のTHR標本から3フラグメントは、3つの別々のインサート内に配置され、3ガラスビーズを対照として、3つの別々のインサート内に配置されるように三連での実験を行います。 <ol><li>各ウェルに0.9ミリリットルDMEM-10％FBSをピペッティングすることによりレシーバプレートを準備します。挿入を準備している間、組織培養インキュベータにそれを置きます。 </li><li>挿入を種子に、蓋を持つプラスチック製のマイクロチューブボックスの表面にそれらを反転。 dは1×10 5乳癌細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をピペットirectly（反転インサート上で上を向いている）各挿入膜の外、底面に。蓋付きのマイクロチューブボックスが開いて割れてカバーし、細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養器に移す。 </li><li>組織培養フードにマイクロチューブボックスを転送し、右側アップシードの挿入をオンにし、レシーバプレートのウェル中にそれらを転送するために鉗子を使用する。各インサートカップにピペット0.450ミリリットルDMEM-10％FBS。ピンセットを用いて、それぞれの準備インサートカップにつの骨組織片（約3 mm）を転送する。必要に応じて、追加のウェルにおけるネガティブコントロールとしてガラスビーズを使用しています。 20時間組織培養インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li>遊走を測定するために、ウェルあたり1mlのDMEM-10％FBSを含有する標準的な24ウェル組織培養プレートを準備する。インキュベーターからレシーバープレートを取り外し、それぞれから骨片とビーズを転送するために鉗子を使用する標準プレートの別々のウェルに挿入します。ルシフェリンを追加基板を各ウェルに（300μgの/ mlの最終濃度を達成するため）、ステップ3.6から3.7までの手順を使用してBLIを行う。 </li></ol></li></ol> 6.追加前後の実験的解析<ol><li>フラッシュされた骨髄の分析。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブの最上部に配置された70μmのセルストレーナーに骨片を転送します。激しくコニカルチューブに骨髄細胞の懸濁液を得るために10mlのPBSで断片をフラッシュするために25 G針を用いた10mlの注射器を使用する。遠心分離機300×gで21℃で3分間、細胞懸濁液を、上清を吸引し、PBSまたはフローサイトメトリーのための他の所望の溶液中で細胞ペレットを再懸濁する。 注：再懸濁体積は遠心分離後の細胞ペレットのサイズは、用途に応じて変化する。 </li><li>生存率アッセイのため〜PBSの75〜300μlの体積は適切であり、これらの懸濁液は、市販fluorescencを用いて分析することができる電子基づく生存率アッセイは、製造業者の指示に従って、従来の血球計数器にピペットで入れ、倒立蛍光顕微鏡を用いて計数した。 </li><li> GFP陽性乳癌細胞の検出に基づいてフローサイトメトリー分析またはソーティングのために、濃度が1×10 6細胞/ mlであることFBS、2mMのEDTA、および10mM HEPES、例えば2％を含有する1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。 </li></ol></li><li> H＆E染色および免疫組織化学。 <ol><li>ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）染色および/または免疫組織化学のための断片を処理するには、番号2鉛筆で標識されたプラスチック製のカセット内の断片を配置し、24時間、10％緩衝ホルマリンを満たした容器に水没。 </li><li>パラフィン包埋のためのプロセス組織切片、各フラグメント内鉱化骨片を考慮して脱灰工程を含む慣用のプロトコールを用いて染色する。 </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra らは以前に、高品質の組織を明らかにし、転移プロセス47を研究するためのヒト骨髄サンプルの使用を検証し、剖検時に採取し、転移性前立腺癌患者の骨片の死後の収集と分析を記載している。ここでは、収集、処理および乳癌細胞移動、コロニー形成及び増殖を研究するための短期共培養系におけるTHR手術後の破棄大腿骨頭から得られたヒト骨組織の断片を使用するた?...

腫瘍微小環境は広く、乳癌の進行および転移拡散1-3中の癌細胞の挙動の重要な決定因子として認識されている。ここに提示された方法の目的は、人間の骨組織、乳癌転移4-6の最も頻繁な部位の微小環境内での乳癌細胞の研究を容易にすることである。骨は、細胞と転移進行10,11に関与する分泌因子を抱くどちらも、鉱化と骨髄コンパートメント7-9で構成されている。広く生体マウスモデルで使用されるが、転移プロセス12-15の全身研究を促進、スケルトン内の細胞の相互作用は観察と直接摂動のために容易にアクセスすることはできません。マウス骨髄組織およびマウス骨髄細胞がより良いアクセスを提供し、クロストークおよび乳癌セルmのメカニズムに関する多くの知見が得られている研究及び培養するためのモデル系ネズミスケルトン16-22のetastasis。しかし、研究は、骨組織23,24のためosteotropismの種特異的なパターンが存在し得ることを示唆している。これらのパターンは、骨の可能性の決定因子である全てが骨組織の特性に固有の種特異的な差異は、免疫欠損マウス11、及び/又は実験に使用したマウスは、比較的若い年齢で変化した骨髄集団から得られた差を反映している可能性が微小環境。 インビトロでは 、典型的には、骨髄由来の骨芽細胞または単層として培養された間質細胞として、または操作された3次元モデル系25〜35内の特定の骨の細胞型に焦点を当ててきたヒト骨共培養において乳癌細胞を研究するために近づく。 2次元の細胞培養モデルは、in vitroでの柱を形成し、がん研究のために近づいているが、それは長い細胞の挙動は基本メートルに変更されることが認識されている培養系18,36,37 onolayer。これは、コラーゲンのような天然材料からなるマトリックス - 足場ベースのモデルを含む3次元の生体組織の複雑性を模倣工学的微小環境が開発された、または合成ポリマーが組織様微小環境を作成するために特定の細胞型を播種36-41。工学的ア ​​プローチも制御し、微小環境18,19,41-43のホルモン環境を研究するためのバイオリアクタープラットフォームの使用が含まれている。バイオミメティックモデル及びバイオリアクターを制御する設定で複雑 ​​な組織微小環境の多くの要素を提供し、成功した骨18,19,35,42,43の乳癌転移の研究を進めるために適用されているが、操作されたモデル系は、一般的に内蔵されていない天然の骨の環境内に存在する細胞型および細胞外マトリックス成分の全スペクトル。 最近まで、乳癌細胞は、ヒト骨組織の天然の、無傷の、3次元微小環境内で検討されていない。我々は最近、（THR）手術が44標本人工股関節全置換から単離されたヒト骨組織フラグメントを用いた共培養モデルの開発を報告した。これらの標本は、短期培養でマイクロ転移のメカニズムを研究するために必要な鉱化と骨髄コンパートメントの両方を抱く。以前の研究では、骨片44（MDA-MB-231-Fluc細胞）とを共培養し、ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞の増殖をモニターするために生物発光イメージング（BLI）を使用するための原理の証明を確立した。ここでは、乳癌細胞癌の増殖、コロニー化、及びヒト骨組織外植片を使用して、ネイティブの微小環境のコンテキスト内での移行を研究するための詳細な実験プロトコルを提示する。 まず、乳房を測定するための骨片に隣接する共培養乳癌細胞のためのプロトコルを提示BLIを使用して細胞増殖。このセクションでは、乳房の細胞懸濁液を骨ろう片により固定される骨片に隣接する6ウェルプレート中の細胞スポットとして播種する。対照ウェルは、骨のワックス、ない骨片が含まれている。セルスポットがアタッチすると、培地を添加し、プレートをBLIにより測定される生物発光シグナル強度（細胞数に関連する）、その後24時間、培養されている。次のステップでは、コロニー形成および増殖を研究するために、骨片に直接播種共培養乳癌細胞のための方法を提示する。ここでは、乳房細胞懸濁液をコロニー形成細胞数を追跡するために時間をかけてBLI、蛍光顕微鏡により培養物中に監視された骨組織断片上に直接ピペットで移す。この方法では、骨髄区画は、フローサイトメトリー、または骨髄生存率アッセイによりコロニー形成さ乳癌細胞の解析のために任意の時点での骨片から洗い流すことができる。 さらに、我々はデ乳癌細胞遊走を測定するための2つの異なるアプローチをスクライブ。第一の方法のステップは、骨組織培養上清に向かって移動を測定するために概説されている。このプロトコルでは、乳癌細胞は、内側に播種され、トランスウェルの上面は、（ 図1Aに示されるように）8μmの孔径を有する膜を挿入する。挿入物は、次いで、骨組織上清または対照培地を含有するウェルを有する受け板内に配置される。 20時間のインキュベーション期間にわたって、乳癌細胞の少数がダウンそれらがBLIによる検出に取り付ける下部組織培養ウェルへの挿入膜を通って移動する。第二の移行方法で乳癌細胞をトランスウェルインサート膜の下側、外表面上に播種される。骨組織断片を挿入カップおよび乳癌細胞内に配置される（ 図1Bに示すように）骨片にコロニーを形成するために、膜を通って移行し、これその後、BLIを使用して画像化される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

骨は、乳癌転移の最も一般的な部位である。それは広く微小環境に影響を与える癌細胞の挙動が認められているものの、ほとんどは人間の骨組織の天然の微小環境内での乳癌細胞の特性および動作について知られている。我々は、追跡定量化の微小環境内でのヒト乳癌細胞を調節するためのアプローチを開発した人工股関節全置換手術の後に廃棄された大腿骨頭から単離された培養されたヒト骨組織断片。ルシフェラーゼおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のために操作乳癌細胞を用いて、我々は、再現性生物発光イメージング（BLI）を用いて、遊走および増殖パターンを定量することができ、蛍光顕微鏡を用いて、骨片内のトラックの細胞の相互作用、および後の乳癌細胞を評価するフローサイトメトリーでのコロニー形成。このモデルの主な利点は、1）ネイティブ、アーキテクチャ的に無傷組織のマイクロE関連するヒト細胞型を含み、かつ迅速な定量的および定性的な監視と乳癌および骨細胞の性質、行動や相互作用の摂動を促進する微小環境、2）直接アクセスnvironment。主要な制限は、現在では、短期培養の研究のウィンドウを閉じ込める組織断片、有限の生存能力である。モデルシステムのアプリケーションは、乳癌および転移性のニッチ内の他の骨求め悪性疾患の基礎生物学を研究し、効果的に骨組織中の乳癌細胞を標的とする治療戦略の開発を含む。

大腿ヘッドから組織片を分離大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目人工股関節全置換術を受けた男性と女性患者（年齢の44から90歳）の同数から収集した。各廃棄された大腿骨頭は、鉱化骨片と骨髄から構成される小柱骨組織を保有上部の大腿骨の小部分が含まれています。この組織は、小さな断片を抽出するために、外科骨鉗子を使用し?...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。

培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K ビュー.  Stanford University School of Medicine. プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。 

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

医学

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

アンインビトロ</em転移性増殖に腫瘍の休眠とスイッチを研究する>システム

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

個々の腎細胞がんの中のタンパク質発現変動を探るために逆相タンパク質アレイ（RPPA）の使用

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

三次元文化：乳細胞の悪性形質転換正常対腺房アーキテクチャを研究するためのツール

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...