著者らの研究室では、健康補助R37 - HL041026、R01 - HL086483とR01 - HL056786（SSS）と米国公衆衛生局からF32 - HL097463とT32 - AR048523（PB）での国民の協会によってサポートされています。

1。マウスボード、筋肉の台座、本体のウェッジと灌流液<ol><li>マウスボード：透明な長方形のプレキシグラス板は（6&quot;ワイドX 8&quot;長いX 3 / 16&quot;厚さ）顕微鏡のステージに収まるように作られています。&quot;麻酔マウスがの手術の準備中に確保されている場所にマウスボード&quot;が精巣挙筋。 </li><li>筋肉の台座：透明なシラスティックゴム台座は、メーカー° Sの指示にしたがって混合してSylgard 184、から調製される。便利な金型は15 mm厚× 50 mmの直径の直径使い捨てペトリ皿で​​す。 Sylgardのブロックは、かみそりの刃（図1Cを参照してください。）で所望の形状にカットされます。透明な防水シリコーン接着剤の薄層は、マウスボードにSylgardのブロックを保護するために使用されます。役に立つヒント：時間のための真空チャンバ内で脱ガス、ペトリ皿にSylgardを注入後の気泡を除去し、透明性を向上させる。 Sylgardのための時間が50 ° Cで数時間のために実験室のオーブンに皿を置くことによって短縮された硬化、脱気の後。 </li><li>体のくさびと加熱プラットフォーム：マウスの​​下にと台座に対する位置付けウェッジ（2&quot;X 4&quot;X 15 °）は、その原点から台座を介して精巣挙筋を拡張容易前方に体を傾斜させる。表面にアルミのプラットフォームを組み込むことにより、導電性の熱を提供します。プラットフォームは、DC電源装置（図1A）に接続された抵抗によって加熱される。プラットフォームの温度をキャリブレーション〜40 ° C〜37食道温度を維持℃にそうでない場合は、ランプからの輻射熱が使用されます。 </li><li>ピン。台座の精巣挙筋を確保するために、ピンは&quot;L&quot;の形に曲げられている0.15ミリメートルの昆虫ピンから調製される。 </li><li>生理食塩水（PSS）。製剤は、超高純度（MΩ18.2）H 2 Oで調製された重炭酸塩-緩衝PSSで連続的に（灌漑）灌流されていますストック溶液は20倍、最終的な作業濃度で調製し、0.2μmのフィルターを通して滅菌する。 4℃で保存した場合、ストック溶液は、数週間のための良いまま重炭酸塩とは別に塩を準備し、実験当日に希釈してこれらを組み合わせて使用​​すると、重炭酸カルシウムの沈殿を防ぐことができます。株式の塩の溶液（ミリモル/ Lで）で構成されています：2638のNaCl、94のKCl、40 MgS0 4、23.4 CaCl 2を 。株式の炭酸は360のNaHCO 3です。実験日に、それぞれのソリューションは、メスフラスコで最終容量（通常は特定の実験のための2リットル）に運ばれ、〜37℃の水浴に入れ5％CO 2でPSSを平衡化/ガス分散器を用いて〜15分間95％のN 2〜7.4にpHを調整し、沈殿を防ぐことができます。 PSSは、5％CO 2 /実験を通して95％のN 2で連続的にバブリングする。最終的な作業溶液組成は、（ミリモル/ Lの）です：132のNaCl、4.7 KClを、1.2 MgS0 4、2のCaCl 2、18のNaHCO 3。 </li></ol> 2。麻酔と手術の準備<ol><li>動物実験用の委員会の承認に続いて、少なくとも12週齢の雄マウスが使用されます。マウスは、腹腔内（ip）注射を介してペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）で麻酔です。拘束チューブは最初の注射の間は、マウスを確保するための有用証明する。外科的処置および実験的なプロトコルを通じて、麻酔は必要に応じてサプリメント（最初の注射の10-20％は、ip）（;つま先や尾のピンチに撤退の反応によって示される毎に30〜60分）によって維持されています。ヒント：注入が過剰摂取の可能性を軽減する前に滅菌生理食塩水にペントバルビタール10 mg / mlのを希釈。 </li><li>マウスはすぐに最初の注射後に保温されている必要がありますので、麻酔は、体温調節が損なわれます。加熱プレートの上に（換気アルミバスケット）は、金属製のフレームにマウスを置く（〜37 ° Cに校正された）うまく動作します。また、熱のランプは、マウスから適切な距離でそれを配置することに注意しながら使用することができます。麻酔の適切なレベルを（つま先やテールピンチに撤退の欠如）が達成されるまでマウスを5〜10分を監視する必要があります。補足投与量は15〜20分後に必要になることがあります。患者になると、特に肥満や老齢動物で、過剰摂取を避けるために慎重に進めるのが最善です。 </li><li>髪の毛は、慎重にそれぞれの領域を削って下腹部、腰、陰嚢と脚から削除されます。特に注意が特に精巣挙筋を傷つけるだろう陰嚢と精巣への外傷を避けるために注意する必要があります。新鮮アルコール綿棒で抜け毛を削除します。 </li><li>膀胱がいっぱいになっている場合には、腹壁を通って小さなブドウのように感じるでしょう。実験中にクレの準備に排尿からマウスを防ぐために穏やかな圧力を使用して膀胱を空にします。キムワイプはcollecに効果のスポンジです。トン尿。 </li><li>その足は台座をまたいでくさびの上に横たわる、その背中にマウスを合わせます。各足に結び付けられて絹の縫合糸は、（4-0または5-0）台座に対して、その股間にマウスを保護するためのテザーを提供します。胸に緩く置かれたとウエッジに固定されたテープの部分は、全体のボディの位置を維持します。顕微解剖用はさみと角度の鉗子を用いて実体顕微鏡を通して見ながら外科手術が行われます。 </li></ol> 3。オープン精巣挙筋の手術の準備<ol><li>ピンは、陰嚢の頂部（左側または右側）を介して配置され、皮膚の緊張を置く台座に固定されています。 PSS（34〜35 ° C）で灌流は、術野を介して開始され、曝露された組織は、暖かく湿った保つために解剖していても維持されます。陰嚢と真空ラインの他の隣の隣の一端に配置さ芯は（キムワイプで作られた）排水PSSを削除します。シリコーンシーラントのビーズプレキシグラス板に付着し、完全にウェッジと台座を囲むには、顕微鏡にPSS漏れを防ぐために効果的な予防策として、吸い出されていないすべてのPSSを収集する&quot;堀&quot;の役割を果たします。 </li><li>切開は、陰嚢の腹側表面に沿って行われます。睾丸が腹腔内に精巣挙筋によって撤回されている場合は、下腹部で穏やかな圧力は、嚢に睾丸を指示します。睾丸を覆う精巣挙筋の表面は、この時点で識別する必要があります。陰嚢皮膚と精巣挙筋の間に結合組織は、慎重に周囲の組織から精巣挙筋を解放するために削除されます。 </li><li>陰嚢皮膚を穏やかに台座の近位端の後ろに後退し、ピンとそれぞれの側に固定されています。精巣挙筋の表面の外面は、結合組織がクリアされます。解剖の水和物の結合組織中に連続灌流、可視性と除去を容易にする。 </li><li>精巣挙筋の頂点を介してピンが縦張力の下に配置するために使用されます。縦切開は、血管供給の中断を最小限に抑えるために取ら細心の注意を払って筋肉の腹側表面を介して行われます。準備の周囲の近くに血流のダイナミクスは、この組織損傷14で変更されます。そのため、最小限に抑えるためにこれらは、イメージングおよび生理学的研究に使用されるデータの収集、準備の中心付近の血管に影響を与えます。 </li><li>精巣挙筋は、睾丸の下にある精巣上体に薄い靭帯によって接続されている。片側に睾丸を反映して慎重に精巣上体から分離されているこの靭帯を、公開します。精巣挙筋の頂点付近で精巣上体に接続する小型の動脈と静脈です。鉗子とそれらを引くことが離れて出血を最小限に抑えるとの間でこれらの血管を閉塞する。睾丸、精巣上体、精巣動脈と静脈は、関連する鼠径脂肪パッドと一緒に（精巣摘出術）、（4-0または5から0絹縫合糸）近位に連結し、切断して破棄されます。また、睾丸を優しく腹腔内に押し戻さと綿またはキムワイプの一部を保持することができます。精巣摘出術は腹腔内に戻って睾丸を押すと組織することが可能外傷を避けるために提供しています。我々は手順7,15のいずれかを使用してクレマスター微小循環の準備の質の顕著な違いを（3.8節を参照）見つかっていない。 </li><li>精巣挙筋の外部表面は、残りの結合組織がクリアしてから、台座の表面に放射状に広がっている。エッジはそのまま微小循環と横紋筋の平らなシートを作成するために5〜6箇所にピン（1.4項を参照）で固定されています。 </li><li>完成した製剤は、連続的に灌流（3〜5 ml /分、34 ° C）と30分間平衡化、生体顕微鏡のステージに転送されます。 </li><li>クレマスターの準備の整合性はいくつかの基準に従って評価されます。最小限の外科的外傷による自発的な血管運動神経性緊張は、細動脈と細静脈の接着白血球の不足で活発なフローで示されます。応答準備中の最も敏感なインデックスは、5〜10分間の灌流液の酸素含有量を高めるために細動脈の収縮です。この、21％O 2でそれを平衡化することによって行われます（対5％O 2、1.5節を参照して、すべて5％CO 2、バランスN 2）。細動脈における白血球の存在、毛細血管を流れる赤血球の有無、および/または白血球細静脈に蓄積し、周囲の組織は、組織の損傷や炎症の徴候です。 </li></ol> 4。精巣挙筋の微小循環の生体内イメージング<ol><li>生体イメージングは​​、オリンパスMVX10ステレオズームプラットフォームに基づいてカスタム顕微鏡で実行されます。 MVX10顕微鏡本体明視野（ケーラー）イメージングのための透視（ハロゲンランプ）とし、蛍光イメージングのための落射照明（水銀灯）を装備したMVX10ハイブリッドスタンドにマウントされています。落射照明を使用して、GCaMP2は35分の520 nmで収集されたエミッションと30分の472 nmで励起される。パーソナルコンピュータ上でパイパーコントロールソフトウェア（SPI）を介して、XR/Mega-10激化、デジタルカメラ（SPIスタンフォードフォトニクス株式会社）を用いて、画像はMV PLAPO 2XCレンズ（オリンパス開口数= 0.50）を介して取得されます。このシステムでは、視野（FOV）の観測されたフィールドは、22ミリメートル× 18ミリメートル〜553μmからX 442ミクロンを変化させることができます。 </li><li>生体内イメージング実験が完了すると、麻酔マウスは頚椎脱臼に続くペントバルビタールの過剰投与で安楽死されています。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="図1" /> マウス精巣挙の準備の生体内イメージングのための図1。マウスボード。 A）アルミプラットフォームとボディウェッジは（黄色のプラスチックで絶縁）底部から見た。プラットフォームの下面に固定された発熱抵抗体は熱伝導を提供しています。 B）加熱プラットフォームは、プラスチック製のくさびにかかっている。 C）身体のウェッジは、手術と生体顕微鏡のステージへの後続の転送用のプレキシガラスのボード上に配置されます。 Sylgard台座は赤い矢印で示されています。防水シリコーンのビーズは、顕微鏡に滴下からそれを防止する、生体内の手順の間に漏出する可能性のあるソリューションを含むように全体の準備を取り囲んでいる。 <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。広視野イメージングのためのカスタムMacroZoom顕微鏡。 ）XR/Mega-10 ICCDカメラ（スタンフォードフォトニクス）とMVX10顕微鏡本体（オリンパス）は、三眼鏡ポートに取り付け。顕微鏡本体のB）クローズアップビュー。 （A）ズームコントロール（0.63〜6.3X）、（b）のフィルタホイール、（c）の画像ダブラ（25倍光学倍率とNA = 0.50）。明視野（ケーラー）照明（コンデンサーNA = 0.55、作動距離= 27 mm）のC）サブステージのコンデンサー。 <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="図3" /> 図3は、マウス精巣挙の準備を完了。暖かいビニール被覆アルミニウムプラットフォーム（黄色）上の仰臥位で麻酔マウス。体の位置は、テープで固定されています。精巣挙筋は、透明なシラスティックゴムの台座の上に放射状に広げ、端部に固定されます。灌流液は、プラスチック製のドリッパー（白矢印）を介して近位端に導入される。真空ライン（白矢印）は、キムワイプの芯を経由してソリューションを削除します。二つのマイクロピペットは、組織内のそれらの先端に位置し表示されます。参照電極（銀線）は、精巣挙筋の下端に固定されています。 <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。内皮にGCaMP2を表現する細動脈のネットワークを視覚化するための倍率の範囲を図示。 A））蛍光とB明視野像は、ビデオモニタ上で総合倍率= 42Xのために3.2倍の光学倍率で撮影。 [ビューのフィールド（FOV）= 4375 X 3470程度]。スケールバー= 500μmの。この倍率で作業する任意位置でのマイクロピペットの配置を容易にします。総合倍率のための6.4xはの光学倍率で撮影したC）蛍光およびD）明視野像= 83X（FOV = 2,200 × 1759μmの）。スケールバー= 200μmの。総合倍率については12.6Xの光学倍率で撮影したE）蛍光とF）明視野像= 165X（FOV = 1,100 X 885ミクロン）。スケールバー= 100μmの。 G）の画像ダブラ、光学倍率= 25.2Xと。スケールバー= 50μmの。

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	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. 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C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. 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動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、ミズーリ大学の動物実験委員会によって承認され、 実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所のガイドと一致して行った。 このビデオ記事の生産は、スタンフォードフォトニクスによって後援されています。

ここでは、 生体内で微小循環を観察するためにマウスのオープン精巣挙筋の準備方法を説明します。この手順は、まずラット4に記載の&quot;オープン&quot;クレマスターの準備の後にモデル化されています。練習すれば全体の外科的処置は1時間以内で完了することができます。この準備の多様性は、実験操作のさまざまなことができ、容易に同様の方法で研究する実験モデルのさまざまなを可能にする、ハムスターだけでなく、ラットに適応される。製剤は、雄の動物との測定値に制限されて筋肉14のエッジ付近の損傷領域を避け、組織の中心に向かってなされるべきである。また、圧力と流量分布が精巣挙筋の相互接続の船が16をカットしているときに変更されている間に、微小血管の応答性と再現性のデータ収集に適して残っている、ことを認識すべきである。精巣挙筋の微小循環を可視化するために主な制約は、特にラットでもハムスターで、成熟した動物と大きさの増加などの結合組織の蓄積です。さらに、動物が脂肪を取るにつれて、それは、ペントバルビタールは親油性であり、脂肪組織に吸収されるので、麻酔を制御することがより困難になる。続行するための最良の方法は、動物° S体温が〜37に維持されることを保証する一方で、患者であることによって℃に露出しながら組織は、PSSで連続的に灌漑されている。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬またはデバイスの名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S642 - 212 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td>ネンブタールナトリウム溶液</td><td>ルンドベック</td><td> NDC 67386-501-55 </td><td>また、ペントバルビタールナトリウムとも呼ば</td></tr><tr><td>温度コントローラ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> TC - 344B </td><td>代替：調節可能な12V DC電源</td></tr><tr><td>シリーズ20プラットフォームヒーターキットRH - 2 </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0274 </td><td>特注のアルミ板が必要です</td></tr><tr><td>メガ- 10カメラ</td><td>スタンフォードフォトニクス</td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XCレンズ</td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10ハイブリッドスタンド</td><td>リーズ</td><td> LBX -ハイブリッド</td><td></td></tr><tr><td>パイパーコントロールソフトウェア</td><td>スタンフォードフォトニクス</td><td></td><td>メガ- 10カメラのためのプログラム</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td>防水シリコーンシーリング材（クリア） </td><td>ゼネラルエレクトリック</td><td> 47970〜72643 - LW​​5000 </td><td>他の透明なシリコーンシーラントでも動作する</td></tr><tr><td> 60 × 15ミリメートルシャーレ</td><td>フィッシャー</td><td> 08から757 - 13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td>ダウコーニング</td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td>顕微解剖用はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15003〜08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> ＃45分の5 </td><td></td></tr><tr><td> GPミリポアエクスプレスプラスメンブレン</td><td>ミリポア</td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens虫ピン</td><td>アウステルリッツ</td><td> Mサイズ0.15ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトペットトリマー</td><td>ウォールクリッパーコーポレーション</td><td>モデル9966 </td><td>それぞれの使用後に清掃してください</td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

体全体に、恒常性の維持は、酸素と副産物代謝の除去との併用栄養素の一定の供給を必要とします。このバランスは、すべての組織や器官全体の血管供給の最小の枝を包含する微小循環を介して血液の運動によって達成される。密接に実質細胞に関連付けられている毛細血管の多数に流入酸素血液の分布と大きさを制御するネットワークを形成する動脈から動脈の枝。毛細血管は、組織細胞と血液供給の間に拡散交換のための大きな表面積を提供しています。小静脈は毛細管の流出物を収集し、それらが心臓に向かって非酸素化血液を戻すように収束する。リアルタイムでこれらのプロセスを観察するには、生活の微小循環を可視化し、操作するための実験的アプローチが必要です。 ラットの精巣挙筋は、最初に組織学と電子顕微鏡死後1,2を使用して炎症を研究するためのモデルとして使用されました。露出無傷のラットの精巣挙筋のin vivoでの報告の最初は、反射光3を使用して血管作用薬に微小血管の反応を調べた。しかし、焦点を絞った照明の筋肉と不足の曲率は、本製剤の有用性を制限。大きな突破口は、筋肉を開いて睾丸からそれを切り離すと複合顕微鏡4で透視のための平らなシートとして放射状に広がって伴いました。ラット5とハムスター6の微小循環の生理機能を研究する貴重な準備であることが示されているが、マウス7の精巣挙筋は、微小血管の機能8-11と細胞間のリアルタイム画像処理の制御に関与する細胞経路を解剖に特に役立っています12シグナリング。 睾丸が鼠径管13を通って降りるように精巣挙筋は、内部の斜めや横方向の腹の筋肉から導出されます。と精巣の温度を維持する：それはサポート（クレマスター=サスペンダーギリシャ語）に提供しています。ここで説明したように、精巣挙筋は、優れた光学分割のための薄い平らなシートとして調製される。マウスが安定した体温と麻酔の面で維持したまま、手術の準備は、生理食塩水で連続して、それを灌漑しながら、周囲の組織や精巣から筋肉を解放シラスティックゴムの透明な台座の上に拡散し、虫ピンでエッジを確保する関係。現在のプロトコルは、細動脈内皮細胞でGCaMP2を発現するトランスジェニックマウスを利用しています。 GCaMP2は遺伝的に符号化された蛍光カルシウム指示薬の分子の12です。広視野イメージングと激化電荷結合素子カメラは、細動脈内皮におけるカルシウムシグナルのin vivo試験で有効。

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The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

組織の準備を可視化し、生活の微小循環の実験的操作のために説明されています。麻酔雄マウスでは、薄く、非常に血管形成精巣挙筋は細動脈、毛細血管と細静脈を含む微小血管のネットワークを研究する生体顕微鏡検査用に準備されています。この製剤は、容易にラットとハムスターに適合されている。

微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

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JoVE Journal

Biology

32.1K ビュー.  University of Missouri. 組織の準備を可視化し、生活の微小循環の実験的操作のために説明されています。麻酔雄マウスでは、薄く、非常に血管形成精巣挙筋は細動脈、毛細血管と細静脈を含む微小血管のネットワークを研究する生体顕微鏡検査用に準備されています。この製剤は、容易にラットとハムスターに適合されている。

ビデオ: The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

微小循環の生体内蛍光イメージングのためのMicroiontophoresisとマイクロマニピュレーション

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

生物学

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

末梢血幹細胞移動の解析のためのマウス精巣挙筋で微小循環の生体顕微鏡

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

ラット精巣挙筋の細動脈における無細胞層の可視化と定量化

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

根の滲出液中の根茎細菌の化学誘引物質の迅速な同定のための改良された気化症アッセイ

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...