מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R37-HL041026, R01-R01 HL086483 ו-HL056786 (SSS) ועל ידי F32-HL097463 ו-T32 AR048523 (PB) משירות ארצות הברית לבריאות הציבור.

1. עכבר הלוח, הדום שרירים, טריז הגוף פתרון superfusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הלוח: לוח פרספקס שקוף מלבני (6 &quot;רחב X 8&quot; X ארוך 3 / 16 &quot;עבה) עשוי להתאים בשלב של המיקרוסקופ.&quot; הלוח העכבר &quot;הוא שם את העכבר הרדים מאובטח במהלך הכנת כירורגית של השריר cremaster. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדום שרירים: הדום שקוף גומי silastic מוכן מ 184 Sylgard, אשר מעורבת בהתאם להוראות ° S היצרן. עובש נוח הוא 15 x 50 מ&quot;מ עובי מ&quot;מ קוטר קוטר צלחת פטרי הפנויה. הבלוק Sylgard נחתך לצורה הרצויה בסכין גילוח (ראה תרשים 1C).. שכבה דקה של דבק סיליקון אטום ברור משמש כדי לאבטח את גוש Sylgard לעלות על העכבר. עצות שימושיות: לאחר מזיגת Sylgard לתוך צלחת פטרי, degassing בתא ואקום שעה מסיר בועות אוויר ומשפר את בהירות. בעקבות degassing, ריפוי הזמן Sylgard מקוצר על ידי הנחת צלחת בתנור מעבדה ב 50 ° C למשך מספר שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריז גוף חימום פלטפורמה: טריז (2 &quot;x 4&quot; x 15 °) ממוקם מתחת העכבר נגד הכן מטה את גופו קדימה המאפשרת הארכת שרירים cremaster על הכן ממקור שלה. שילוב פלטפורמת אלומיניום על משטח מספק מוליך חום. הפלטפורמה מחומם על ידי נגדים מחוברים לספק מתח DC (איור 1A). כיול הטמפרטורה פלטפורמה ~ 40 ° C שומר על טמפרטורת הושט ב ~ 37 ° C. אחרת, חום קורן מן המנורה משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכות. כדי להבטיח את השריר cremaster על הכן, סיכות מוכנים מ 0.15 מ&quot;מ סיכות חרקים שהיו כפופות לתוך צורה &quot;L&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מלח פיזיולוגיים (PSS). ההכנות superfused (שלחין) ברציפות עם ביקרבונט שנאגרו PSS שהוכנו ultrapure (18.2 MΩ) H 2 O. פתרונות במלאי מוכנים בריכוז 20X עבודה סופית לעקר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. פתרונות במלאי נותרו טוב במשך כמה שבועות, כאשר מאוחסנים 4 ° C. הכנת מלחים בנפרד ביקרבונט ו לערבב אותם עם דילול ביום הניסוי מונעת משקעים של סידן ביקרבונט. הפתרון מלח המניות מורכב (ב mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 4, 23.4 CaCl 2. ביקרבונט המניות הוא 360 NaHCO 3. ביום של ניסוי, פתרונות בהתאמה מובאים נפח סופי (בדרך כלל 2 L לניסוי נתון) בבקבוק volumetric והניח באמבט מים ~ 37 ° C. Equilibrating PSS עם 5% CO 2 / 95% N 2 עבור ~ 15 דקות באמצעות disperser גז מתאים את ה-pH ל ~ 7.4 ומונעת משקעים. PSS הוא מבעבע ברציפות עם 5% CO 2 / 95% N 2 במהלך הניסויים. ההרכב הסופי פתרון עבודה (ב mmol / L) הוא: 132 NaCl, KCl 4.7, 1.2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. </li></ol> 2. הרדמה לקראת ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות אישור טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, עכברים זכרים לפחות 12 שבועות משמשים. העכבר הוא הרדים עם נתרן pentobarbital (60 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal. צינור הרחקה מוכיח שימושי להבטחת עכבר במהלך הזריקה הראשונית. במהלך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוני, הרדמה מתוחזק על ידי תוספי מזון (10-20% של הזרקת הראשוני, ip) לפי הצורך (כל 30-60 דקות, שמסומן על ידי תגובת נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). טיפ: דילול pentobarbital 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סליין סטרילי לפני ההזרקה מקטין את האפשרות של מנת יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה פשרות לוויסות טמפרטורת כך את העכבר חייב להישמר חם מיד לאחר הזריקה הראשונה. הצבת העכבר במנשא מתכת (סל אלומיניום מאוורר) על גבי צלחת חימום (מכויל ~ 37 ° C) עובד היטב. לחלופין, מנורה חום ניתן להשתמש בטיפול כדי למקם אותו במרחק מתאים מן העכבר. העכבר צריך להיות במעקב כל 5-10 דקות, עד רמה מתאימה של הרדמה מושגת (חוסר נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). המנה הנוספת עשויה להידרש לאחר 15-20 דקות. עדיף להיות סבלניים להתקדם בזהירות, כדי למנוע מינון יתר, במיוחד עם בעלי חיים או מהשמנת יתר בגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיער יוסר הבטן התחתונה, הגב התחתון, שק האשכים ואת הרגליים בקפידה על ידי גילוח לאזורים בהתאמה. תשומת לב מיוחדת יש לנקוט כדי למנוע טראומה שק האשכים ואת האשכים, אשר אחרת לפגוע בשרירים cremaster. הסרת שיער פזור עם ספוגית אלכוהול טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השלפוחית ​​מלאה זה ירגיש כמו ענבים קטן דרך דופן הבטן. לרוקן את שלפוחית ​​השתן באמצעות לחץ עדין על מנת למנוע את העכבר של משתין על הכנת cremaster במהלך הניסויים. Kimwipe הוא ספוג האפקט הקולקטיביתt השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העכבר על גבו, שוכב על טריז עם הרגליים בפישוק על הדום. תפר משי (4-0 או 5-0) קשור כל רגל מספקת לקשור להבטחת עכבר עם המפשעה שלה נגד הכן. חתיכת סרט להציב ברפיון על החזה מאובטח טריז שומר על תנוחת הגוף הכולל. הניתוחים מבוצעים תוך צפייה דרך stereomicroscope באמצעות מספריים microdissection ו מלקחיים זווית. </li></ol> 3. הכנה כירורגי של השריר cremaster פתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינים ממוקם דרך הקודקוד של שק האשכים (או את הצד השמאלי או מימין) מאובטחת הכן למקום מתח על העור. Superfusion עם PSS (34-35 ° C) הוא יזם מעל השדה כירורגית ומתוחזק לאורך לנתיחה כדי לשמור על רקמת חשוף חמה ולחה. הפתיל (עשוי Kimwipe) ממוצבת עם קצה אחד ליד שק האשכים לבין הבא אחרים לקו ואקום מסיר את PSS בשפכים. טיפת דבק איטום סיליקון ללוח הפרספקס לחלוטין המקיפה את טריז ו הדום משמש &quot;החפיר&quot; לאסוף כל PSS שאינו aspirated, משמש אמצעי זהירות יעיל כדי למנוע דליפה PSS על המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצעים חתך לאורך המשטח הגחון של שק האשכים. אם האשך כבר חזר בו על ידי השריר cremaster לתוך חלל הבטן, לחץ עדין על הבטן התחתונה מכוון את האשך לתוך שק. פני השטח של שריר cremaster שמעל האשך יש לזהות בשלב זה. רקמת החיבור בין העור לבין השריר האשכים cremaster מוסרת בזהירות כדי לשחרר את השרירים cremaster מן הרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עור האשכים הוא חזר בו בעדינות מאחורי קצה פרוקסימלי של הכן ומאובטח בכל צד עם סיכה. פני השטח החיצוני של המשטח שריר cremaster מנוקה אז של רקמת חיבור. Superfusion רציף במהלך הידרט לנתיחה רקמת החיבור, בהנחיית ניראות ההסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכה דרך הקודקוד של השריר cremaster משמש מקום אותו תחת מתח האורך. חתך אורכי נעשית באמצעות משטח הגחון של שריר בזהירות רבה לקחת כדי למזער הפרעה באספקת הדם. זרימת הדם דינמיקה ליד בפריפריה של הכנת משתנים על ידי זה 14 נזק לרקמות. לכן, כדי למזער את אלה משפיע על איסוף הנתונים, כלי דם בסמוך למרכז הכנת משמשים הדמיה מחקרים פיזיולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השריר cremaster מחובר באמצעות רצועה דקה כדי יותרת האשך מתחת האשך. המשקף את האשך לצד אחד חושפת רצועה זו, אשר מופרדים בקפידה יותרת האשך. קרוב לשיא של השריר cremaster הוא עורק וריד קטן שבו לחבר אותו יותרת האשך. Occluding אלה כלי בין מלקחיים ופושק אותם ממזער הדימום. האשכים, יותרת האשך, האשכים עורק וריד הם ligated proximally (4-0 או 5-0 תפר משי), ניתק וזנוח (orchiectomy) יחד עם כרית השומן הקשורים מפשעתי. לחלופין, האשך יכול להיות דחף בעדינות בחזרה לתוך חלל הבטן ולהחזיק עם פיסת צמר גפן או Kimwipe. Orchiectomy משמש כדי למנוע טראומה ניתן הרקמה כאשר דוחפים את האשכים חזרה לתוך חלל הבטן. לא מצאנו הבדלים בולטים באיכות הכנת microcirculation cremaster (ראה סעיף 3.8) או באמצעות הליך 7,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח החיצוני של השריר cremaster מנוקה של רקמת חיבור הנותרים ולאחר מכן להפיץ רדיאלית על פני השטח של הכן. הקצוות מובטחות עם סיכות (ראה סעיף 1.4) ב 5-6 מקומות כדי ליצור גיליון שטוח של שריר מפוספס microcirculation ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה השלימה מועבר בשלב של מיקרוסקופ intravital, superfused ברציפות (3-5 מ&quot;ל / דקה, 34 ° C) equilibrated במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Integrity של הכנת cremaster מוערך על פי מספר קריטריונים. הטון ספונטנית וזומוטורים עם טראומה כירורגית מינימלית מסומן על ידי זרימה מהירה של arterioles וחוסר leukocytes חסיד ב venules. המדד הרגיש ביותר של הכנה תגובה היא התכווצות של arterioles להעלאת פתרון superfusion תוכן חמצן למשך 5-10 דקות. הדבר נעשה על ידי equilibrating אותו עם 21% O 2 (לעומת 5% O 2, ראה סעיף 1.5; כל עם 5% CO 2, איזון N 2). נוכחות של לויקוציטים ב arterioles, העדר של כדוריות דם אדומות זורם דרך הנימים, ו / או leukocytes צבירת venules ו לרקמות סימנים של נזק לרקמות ודלקת. </li></ol> 4. הדמיה של Intravital microcirculation השריר cremaster <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intravital הדמיה מבוצע על מיקרוסקופ מותאם אישית המבוסס על פלטפורמה MVX10 אולימפוס זום סטריאו. MVX10 מיקרוסקופ הגוףהוא רכוב על היברידית MVX10 עמדה מצויד שקוף (מנורת הלוגן) הדמיה (קוהלר) brightfield עם עלית תאורה (מנורת כספית) עבור דימות פלואורסצנטי. שימוש עלית תאורה, GCaMP2 הוא מתרגש בכל ננומטר 472/30 עם פליטת שנאספו ננומטר 520/35. תמונות נרכשים באמצעות PLAPO MV 2XC העדשה (הצמצם המספרי = 0.50; אולימפוס) באמצעות XR/Mega-10 התעצמה מצלמה דיגיטלית (סטנפורד Photonics, Inc, SPI) דרך פייפר בקרת תוכנה (SPI) במחשב האישי. עם מערכת זו, בתחום הנצפה של תצוגה (FOV) יכולים להיות מגוונים מ 553 מיקרומטר X 442 מיקרומטר עד 22 מ&quot;מ X 18 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הניסויים הדמיה intravital, העכבר הוא הרדים מורדמים עם מנת יתר של pentobarbital ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li></ol> 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור עכבר הלוח הדמיה intravital הכנה העכבר cremaster. א) טריז גוף עם פלטפורמת אלומיניום (מבודד עם פלסטיק צהוב) צפו מלמטה. נגדים חימום מאובטח התחתון של הפלטפורמה לספק חום שנערך. ב) חימום נשענת על פלטפורמת טריז מפלסטיק. ג) טריז הגוף מונח על לוח פרספקס לניתוח ולהעביר לאחר השלב של המיקרוסקופ intravital. הדום Sylgard מסומן בחץ אדום. טיפת סיליקון אטום המקיפה את כל ההכנות כדי להכיל כל פתרון עלול לדלוף במהלך ההליך intravital, ומונע ממנו מטפטף על המיקרוסקופ. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור MacroZoom אישית מיקרוסקופ עבור widefield הדמיה. א) MVX10 הגוף מיקרוסקופ (אולימפוס) עם מצלמה ICCD XR/Mega-10 (סטנפורד Photonics) רכוב על יציאת trinocular. ב) תקריב נוף של הגוף מיקרוסקופ. (א) זום הביקורת (0.63 ל 6.3X), (ב) גלגל מסנן: (ג) תמונה מכפיל (NA = 0.50 עם הגדלה אופטי 25X). ג) Substage הקבל עבור תאורה (קוהלר) brightfield (Condenser NA = 0.55, מרחק עבודה = 27 מ&quot;מ). <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הושלם הכנה עכבר cremaster. עכבר הרדים בעמדה פרקדן על משטח פלסטיק מצופה אלומיניום חמים (צהוב). תנוחת הגוף מאובטח באמצעות קלטת. השריר cremaster מתפשטת רדיאלית על כן גומי שקוף silastic והצמיד בקצוות. פתרון Superfusion הוא הציג בסוף הפרוקסימלי דרך dripper פלסטיק (חץ לבן). קו ריק (לבן ראש חץ) מסיר את הפתרון באמצעות פתילה Kimwipe. שני micropipettes מוצגים ממוצבת עם טיפים שלהם ברקמות. אלקטרודה הפניה (חוט הכסף) מאובטח בקצה התחתון של השריר cremaster. <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הממחישות את טווח הגדלה המאפשר הדמיה רשתות arteriolar להביע GCaMP2 ב האנדותל. א) פלורסנט ו-B) התמונה נלקחה ב brightfield הגדלה אופטי של 3.2X עבור ההגדלה בסך הכל = 42X על צג וידאו. [שדה הראייה (FOV) = 4,375 x 3,470 מיקרומטר]. בר סולם = 500 מיקרומטר. עבודה בהגדלה זה מאפשר השמה של micropipettes במקומות הרצויים. ג) פלורסנט ו-D) התמונה נלקחה ב brightfield הגדלה אופטי של 6.4X עבור ההגדלה הכולל = 83X (FOV = 2200 x 1759 מיקרומטר). בר סולם = 200 מיקרומטר. E) פלורסנט ו-F) התמונה נלקחה ב brightfield הגדלה אופטי של 12.6X עבור ההגדלה הכולל = 165X (FOV = 1100 x 885 מיקרומטר). בר סולם = 100 מיקרומטר. G) עם מכפיל תמונה, הגדלה אופטי = 25.2X. בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Majno, G., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+1.+The+effect+of+histamine+and+serotonin+on+vascular+permeability:+an+electron+microscopic+study.">Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).</li><li>Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+inflammation.+II.+The+site+of+action+of+histamine+and+serotonin+along+the+vascular+tree:+a+topographic+study.">Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.</a> J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Skeletal+Muscle+Blood+Vessels+(Rat+Cremaster).">Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster).</a> J. Physiol. 172, 123-137 (1964).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+microvascular+pressures+in+normal+and+spontaneously+hypertensive+rats.">Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats.</a> Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).</li><li>Klitzman, B., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+hematocrit+and+red+cell+flow+in+resting+and+contracting+striated+muscle.">Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle.</a> Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).</li><li>Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &amp;amp, S. e. g. a. l., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasomotor+control+in+arterioles+of+the+mouse+cremaster+muscle.">Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle.</a> FASEB J. 14, 197-207 (2000).</li><li>Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+of+connexin40+in+the+propagation+of+electrically+activated+vasodilation+in+mouse+cremasteric+arterioles+in+vivo.">Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo.</a> Circ. Res. 92, 793-800 (2003).</li><li>Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin45+cannot+replace+the+function+of+connexin40+in+conducting+endothelium-dependent+dilations+along+arterioles.">Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles.</a> Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).</li><li>Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+importance+of+the+endothelial+K++channel+SK3+and+connexin40+in+arteriolar+dilations+during+skeletal+muscle+contraction.">Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction.</a> FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).</li><li>Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+impaired+neurovascular+transmission+in+a+murine+model+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).</li><li>Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagated+endothelial+Ca2++waves+and+arteriolar+dilation+in+vivo:+measurements+in+Cx40BAC-GCaMP2+transgenic+mice.">Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice.</a> Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).</li><li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+denervation+on+skeletal+muscle+blood+vessels+(rat+cremaster).">The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> J. Anat. 100, 305-316 (1966).</li><li>Proctor, K. G., Busija, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+arteriolar,+regional,+and+whole+organ+blood+flow+in+cremaster+muscle.">Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle.</a> Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation:+Role+of+conducted+vasodilation.">Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiol. , (2011).</li><li>Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+cremaster+muscle+hemodynamics+due+to+disruption+of+the+deferential+feed+vessels.">Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels.</a> Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).</li></ol>

נהלים ופרוטוקולים מעורבים כל בעלי החיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש מאוניברסיטת מיזורי והופיעה בקנה אחד עם מדריך National Institutes of Health לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפקה של המאמר וידאו זה כבר ממומנים על ידי סטנפורד Photonics.

כאן אנו מתארים את הכנת שריר לפתוח cremaster בעכבר על התבוננות microcirculation in vivo. הליך זה הוא המודל לאחר הכנת &quot;פתוח&quot; cremaster שתוארה לראשונה בשנת החולדה 4. בעזרת תרגול ההליך הכירורגי כולו יכול להסתיים בתוך פחות משעה 1. הרבגוניות של הכנה זו מאפשרת מגוון רחב של מניפולציות ניסיוניים מותאם בקלות אוגרים כמו גם חולדות, המאפשר מגוון רחב של דגמים ניסיוניים להיחקר באופן דומה. הכנה מוגבל חיות זכר מדידות צריך להיעשות לכיוון מרכז הרקמה, הימנעות האזורים שנפגעו ליד הקצוות של שריר 14. ראוי גם הכיר בכך, בעוד הפצות הלחץ ואת זרימת משתנים כאשר כלי מקשרות של שריר cremaster נחתכים 16, microvessels להישאר קשוב מתאים איסוף הנתונים לשחזור. המגבלה העיקרית לדמיין את בזרימת הדם בשריר cremaster היא הצטברות של רקמת חיבור כחיות בוגרת להגדיל את שטחו, בעיקר חולדות, אלא גם אוגרים. יתר על כן, כמו בעלי חיים להשמין, הוא הופך להיות קשה יותר לשלוט הרדמה כי pentobarbital הוא lipophilic והוא יכול להיקלט ורקמת השומן. הדרך הטובה ביותר להתקדם היא על ידי כך המטופל תוך הקפדה כי טמפרטורת הגוף ° S חיה נשמר ~ 37 ° C תוך הרקמה הנחשפת הינו מושקים ברציפות עם PSS.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או התקן </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> דיג </td><td> S642-212 </td><td></td></tr><tr><td> אשלגן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> סיגמא </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> דיג </td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן נמבוטל פתרון </td><td> לונדבק </td><td> NDC 67386-501-55 </td><td> המכונה גם סודיום כמו pentobarbital </td></tr><tr><td> בקר טמפרטורה </td><td> וורנר מכשירים </td><td> TC-344B </td><td> חלופי: מתכוונן 12V DC אספקת החשמל </td></tr><tr><td> סדרה 20 פלטפורמה דוד ערכת RH-2 </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0274 </td><td> דורש שהותקן צלחת אלומיניום </td></tr><tr><td> Mega-10 מצלמה </td><td> סטנפורד Photonics </td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td> אולימפוס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XC עדשה </td><td> אולימפוס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10 היברידית לעמוד </td><td> לידס </td><td> LBX-Hybrid </td><td></td></tr><tr><td> פייפר בקרת תוכנה </td><td> סטנפורד Photonics </td><td></td><td> תוכנית מצלמה מגה-10 </td></tr><tr><td> סטריאו מיקרוסקופ </td><td> ניקון </td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td> סיליקון איטום Waterproof (Clear) </td><td> ג&#39;נרל אלקטריק </td><td> 47,970-72,643-LW5000 </td><td> אחרים איטום סיליקון ברור גם לעבוד </td></tr><tr><td> 60 x 15mm צלחת פטרי </td><td> דיג </td><td> 08-757-13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td> Microdissection מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> דומון מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> # 5 / 45 </td><td></td></tr><tr><td> GP Millipore אקספרס PLUS ממברנה </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens סיכות חרקים </td><td> אוסטרליץ </td><td> M בגודל 0.15 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> חיות מחמד קומפקטי גוזם </td><td> וואהל קליפר קורפ </td><td> דגם 9966 </td><td> נקי לאחר כל שימוש </td></tr></tbody></table>

the mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation

בכל הגוף, שמירה על הומאוסטזיס מחייב אספקה ​​קבועה של חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של תוצרי חילוף החומרים. איזון זו מושגת על ידי תנועת הדם דרך microcirculation, אשר כוללת את הענפים הקטנים ביותר של אספקת הדם בכל רקמות ואיברים. סניף Arterioles מן העורקים כדי ליצור רשתות לשלוט בהפצה ובהיקף של דם מחומצן זורם לתוך ריבוי נימים קשר אינטימי עם תאים parenchymal. הנימים מספקים שטח פנים גדול לחילופי diffusional בין רקמות ותאי את אספקת הדם. Venules לאיסוף שפכים נימי להתכנס כפי שהם לחזור deoxygenated הדם לכיוון הלב. כדי לבחון את התהליכים האלה בזמן אמת דורש גישה ניסויית המאפשר הדמיה מניפולציה של microcirculation חיים. השרירים של חולדות cremaster שימש לראשונה כמודל לחקר דלקת באמצעות היסטולוגיה 1,2 ו במיקרוסקופ אלקטרונים פוסט מורטם. הראשון בדו&quot;ח vivo של השריר חשוף עכברוש שלם cremaster נחקר כלי הדם התגובות לתרופות vasoactive לידי ביטוי באמצעות האור 3. עם זאת העקמומיות של השריר וחוסר תאורה ממוקדת מוגבל את השימושיות של הכנה זו. פריצת דרך הכרוכות בפתיחת שרירים, לנתק אותו מן האשך ומפיצים אותו רדיאלית כמו סדין שטוח שקוף תחת מיקרוסקופ מתחם 4. בעוד העולם להיות הכנה חשוב ללמוד את הפיזיולוגיה של בזרימת הדם אצל חולדות 5 ו - 6 אוגרים, השריר cremaster בעכברים 7 הוכיחה שימושית במיוחד בניתוח מסלולי הסלולר המעורבים בוויסות תפקוד כלי הדם 8-11 בזמן אמת הדמיה של אינטר איתות 12. השריר cremaster נגזר השרירים הפנימיים abdominus עקיפה רוחבי כמו האשכים יורדים דרך התעלה מפשעתי 13. הוא משמש לתמיכה (ביוונית: cremaster ביריות =) ולשמור על טמפרטורת האשכים. כפי שתואר כאן, שריר cremaster מוכן כמו סדין דק שטוח עבור רזולוציה אופטית יוצאת מן הכלל. עם העכבר נשמר בטמפרטורת גוף יציב מטוס של הרדמה, הכנת הניתוח כרוך לשחרר את השריר מן הרקמה שמסביב ועל האשכים, להפיץ אותו על בסיס שקוף של גומי silastic ואבטחת הקצוות עם סיכות חרקים תוך להשקיית זה ללא הרף עם תמיסת מלח פיזיולוגית . הפרוטוקול הנוכחי מנצל העכברים הטרנסגניים GCaMP2 לבטא בתאי האנדותל arteriolar. GCaMP2 סידן הוא מקודד גנטית פלורסנט אינדיקטור 12 המולקולה. Widefield הדמיה התעצמה תשלום מצמידים את המצלמה במכשיר לאפשר במחקר vivo של איתות סידן האנדותל arteriolar.

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation at JoVE.com

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

הכנת רקמות מתואר עבור להדמיה של מניפולציה ניסויית בזרימת הדם החי. בעכברים מורדמים זכר, רזה, שרירי מאוד vascularized cremaster מוכן מיקרוסקופיה intravital ללמוד רשתות כלי הדם כולל arterioles, נימים venules. הכנה זו היא מותאמת בקלות לחולדות ואוגרים.

Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

the-mouse-cremaster-muscle-preparation-for-intravital-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

32.1K Views.  University of Missouri. הכנת רקמות מתואר עבור להדמיה של מניפולציה ניסויית בזרימת הדם החי. בעכברים מורדמים זכר, רזה, שרירי מאוד vascularized cremaster מוכן מיקרוסקופיה intravital ללמוד רשתות כלי הדם כולל arterioles, נימים venules. הכנה זו היא מותאמת בקלות לחולדות ואוגרים.

Video: The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...