この研究は国立癌研究所の学内研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

1。休眠性および転移性腫瘍細胞株の細胞培養のメンテナンス<ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）高グルコースおよび10％ウシ胎児血清を（含む10 cm培養プレート中で休眠成長（D2OR / MCF7/K7M2-AS.46）と転移性腫瘍細胞（D2A1 / MDA - MB - 231 / K7M2） FBS）および抗生物質。細胞が70-80％のコンフルエントに到達すると、以下のアッセイに進んでください。 </li></ol> 2。休眠（静止）と転移性（増殖）腫瘍細胞の細胞増殖アッセイでは、3D - BME系で培養 3D系の培養休眠/転移性細胞 <ol><li>アッセイを実施する前に4の融解Cultrexの成長因子-低減基底膜抽出物（BME）は、℃の冷蔵庫夜を。 BMEは常に氷上で処理する必要があります注意してください。 </li><li>翌日に、層流フードの内側氷のトレイに96ウェルプレートを配置。注射器とディスペンサーを用いて氷冷BMEの50 -100μLでコーティング各ウェルを。は気泡がウェル内に形成されていないことを確認してください。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター℃で30分間のBMEでコートした96ウェルプレートを置きます。 </li><li>一方で休眠したり、転移性腫瘍細胞（セクション1で調製した）から培地を吸引除去する。 10 mlのリン酸塩は生理食塩水、pH7.4の（PBS）をバッファで培養プレートをすすぎます。培養プレートにPBSと追加2ミリリットルトリプシンで37予め温めておいた° Cを、吸引除去する。 37加湿5％CO 2で培養する° C、5分間。 </li><li> 10％FCSと抗生物質を補充したDMEM高グルコースの5mlを含む15 mlのコニカルチューブに細胞を移し、細胞を数えます。 </li><li> 5分間、室温で、1500グラムの速度で組織培養の遠心で培養される細胞数をスピンダウン。私たちのアッセイでは、検査する各細胞株や時間の点のために/よく2X10 3細胞を準備します。しかし、これは、使用細胞株によって異なる場合があります。 </li><li>注意深く上清を吸引除去する。 （注）は、ほとんどの場合、ペレットは表示されません。そのため、背後にあるいくつかのメディアを残す。単一細胞の懸濁液が得られることを保証するために、指で15ミリリットルコニカルチューブの底をタップします。ペレットは、2％FCS + 2％BME（アッセイ培地）を添加した抗生物質によるDMEM低グルコースで再懸濁する。アッセイ培地を100μlごとに2 × 3セルを追加する必要があります。単一の細胞懸濁液が維持されていることを保証するために5ミリリットルピペットで細胞を何度もひいて粉にする。 </li><li>プレートの細胞混合液100μl当たり96ウェルBMEコーティングしたプレートの上に。のためのバックグラウンド評価（セクション2.8で）付加100μlのウェル当たり96ウェルBMEコーティングしたプレートの上に唯一のアッセイ培地のプレート。 37加湿5％CO 2インキュベーターで培養96ウェルプレートをインキュベート℃に細胞はアッセイ培地で4日ごとに再供給されるべきである。 </li></ol> 増殖アッセイ： <ol start="8"><li>細胞の増殖アッセイ：希望する時にウェルに追加するには、セルの力価96水溶液Oneソリューションの細胞増殖アッセイキットの20μlを指しています。 2時間、37℃で加湿5％CO 2インキュベーター中でインキュベートする。 490nmのELISAプレートリーダーレコード吸光度を使用する。バックグラウンドの評価と減算の場合は、BMEでコートされたとのみアッセイ培地を重ねて井戸の事前にセルの力価96水溶液Oneソリューションの細胞増殖アッセイキットの20μlのを追加します。 490nmでELISAプレートリーダーレコード吸光度を使用する。 </li></ol> 3。および/または転移性（増殖）休眠（静止）腫瘍細胞腫瘍細胞における細胞シグナル伝達分子のための免疫蛍光染色 immunfluorescence染色用の3Dシステムで培養休眠/転移性細胞 *以下のプロトコルは、Debnath J ら 18日までに発行された3次元培養のプロトコルを変更したものです。 <ol><li>としてセクション2.1で説明BMEを準備します。翌日：層流フード内氷のトレイの代わりに、8室のガラススライドのシステムを。 200μlのpipetmanを使用して氷冷BMEの50ULと各ウェルコート。 BMEが均等に分散され、気泡がウェル内に形成されていないことを確認してください。 20分間37℃、加湿5％CO 2でBMEでコートされた8室のガラススライド° Cを置きます。 </li><li>セクション1とセクション2.3から2.4で説明したように文化のための準備から収穫休眠したり、転移性細胞。 15 mlコニカルチューブで培養される細胞の総数を収集する。我々は/よく検査される各細胞株と時点を5 × 10 3個を準備。 5分間、室温で、1500グラムの速度で組織培養の遠心で細胞をスピンダウン。注意深く上清を吸引除去する。ペレットが表示されていないことに注意しているので背後にあるいくつかのメディアを残す。単一の細胞懸濁液が得られることを保証するために、指で15ミリリットルコニカルチューブの底をタップします。アッセイ培地でペレットを再懸濁する。アッセイ培地の400μlごとに5 × 3セルを追加する必要があります。 5ミリリットルピペットで細胞を何度もひいて粉にする。このステップでは、単一の細胞懸濁液が維持されていることを保証するために非常に重要です。 </li><li> BMEでコートされた8室の各々の上にウェルあたりの細胞混合物のプレートを400μl。 37℃加湿5％CO 2インキュベーターで培養8室のガラスのスライドシステム℃にインキュベートする。細胞はアッセイ培地で4日ごとに再供給されるべきである。 </li></ol> 免疫蛍光染色： <ol start="4"><li>希望する時点で、メディアの上層を吸引除去し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）、5％スクロースおよび0.1％トリトンX - 100を含む固定液の200μlのを追加し、室温で5分間インキュベートする。固定液を吸引し、25分間室温で5％スクロースとインキュベートを含む4％PFAの200μlのを追加します。 </li><li>固定液を吸引、リン酸塩の追加を400μlを各ウェルに（PBS）緩衝生理食塩水。室温で10分間インキュベートする。 PBSを吸引し、400μPBSで室温で10分間、0.05％Tween 20を含むを追加します。 </li><li>どちらかの10％ロバ血清の200μlの、または1時間の3％のBSA（使用されるブロッキング溶液を各一次抗体のために経験的に決定されるべきである）と室温で固定された細胞をブロックする。 </li><li>ブロッキング溶液を吸引除去し、一次抗体（希釈が使用する各一次抗体のために経験的に決定する必要がある）の200μlのを追加します。 10パーセントロバ血清をブロッキングまたは3％BSAブロッキング溶液が使用されている場合、3％BSAで一次抗体を希釈するために使用されていた場合、10％ロバ血清中に一次抗体を希釈します。 4℃で一晩一次抗体とインキュベート℃に</li><li>抗体を吸引、15分間400μlPBSでウェルを洗浄し、二回繰り返す。 PBSを吸引し、ローダミン、赤色（希釈は、経験的に決定されるべきである）に結合ロバ抗それぞれ- IgGの200μlのを追加し、室温で1時間、アルミ箔とインキュベートした8チャンバースライドをカバーしています。 </li><li> 400μlPBS（3x15分各洗浄）でウェルを洗ってください。 PBSを吸引除去する。 VECTASHIELDはDAPIでメディアをマウントするとマウント。暗所で室温で40分間乾燥したスライド。スライドは4℃で1週間のために保持することができます暗闇の中でスライドを保存する。画像は、共焦点顕微鏡でスライドします。 </li></ol> 4。代表的な結果： 3D文化における休眠D2.0Rと転移性D2A1腫瘍細胞の増殖の解析の例を図1Aに示されています。高転移D2A1細胞だけが増殖を開始した後4〜6日のために休止状態のまま、一方D2.0R細胞が全体の実験的な14日間の培養期間を通じて、（静止）休止状態です。他の非増殖細胞は多細胞スフェロイドを形成するのに対し、初期休眠期の間に、多くの細胞が3次元培養（4日目図1B）で孤独なままです。 3次元培養（ 図1B、12日目）で休眠から増殖状態にD2A1細胞の転移は、細胞の形態の劇的な変化に関連付けられています。したがって、このアッセイは、どのような因子をテストするために使用することができます/ sはその休眠状態から出現する休眠D2.0R細胞を誘発する可能性があり、どのような要因は、/ sはその休眠状態からの遷移にD2A1細胞を防ぐことができます。 図2は、エージェントの例です。休眠から増殖状態に移行するD2A1細胞を防止。 図2に示すように、ミオシン軽鎖キナーゼの特異的阻害剤とD2A1細胞（ML - 7）の治療は、休眠状態にD2A1細胞を維持した。 3Dシステムで培養休眠と増殖腫瘍細胞において細胞内シグナル伝達は、細胞シグナル伝達分子のための免疫蛍光染色によって調べることができます。 図3に示すように、アクチンストレスファイバー（緑色の染色）を形成するF -アクチンフィラメントの再編が続くD2A1細胞（赤染色）におけるミオシン軽鎖のリン酸化の有意な増加は、休眠状態からの移行時に発生します（1-4日）へ増殖（7日）。しかし、shRNAまたは特定の薬剤（ML - 7）でD2A1細胞におけるミオシン軽鎖キナーゼ活性をブロックすることはD2A1休眠状態の細胞とミオシン軽鎖のリン酸化およびF -アクチンのストレスファイバーの組織（ 図4）の阻害の結果を保持します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> 図1 in vitroモデルで孤立性腫瘍細胞の休眠と転移の成長への切り替えを検討する。 3 - D Cultrex BMEで休眠D2.0Rと転移D2A1のA）拡散、N = 8（± SEを意味する）。三つの実験（* P≤0.05）の代表的な結果。 B）D2.0RとD2A1細胞の光学顕微鏡像は3次元Cultrex BMEの倍率x20かで培養。図はBarkanら17から変更。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> 図2。ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）の阻害により、3次元培養系での休眠（静止）から増殖までD2A1細胞のスイッチを防止 。 3 - D Cultrex BME、N = 8（± SEを意味する）で培養D2A1細胞増殖の時間経過。細胞は、（コントロール）未処理だった、またはMLCKの特異的阻害剤（ML - 7、5μM）で処理し、培養5日目に48時間の始まりのために。図はBarkanら17から変更。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> 図3。休眠から増殖成長へD2A1細胞のスイッチの間にF -アクチンの再編成に続いてミオシン軽鎖のリン酸化 。 D2A1細胞は、8室のガラススライド上に3 - D Cultrex BMEで培養した。細胞を固定し、核局在化のためのDAPI（青）、F -アクチンのファロイジン（緑色）でとのような種々の時点で示されたミオシン軽鎖（MLC - P）（赤）、のリン酸化体に対する抗体で染色した。 F -アクチンのマージ、およびMLC - P染色（黄色）。 MLC - Pの発現は、休眠（days1 - 4）からアクチンストレスファイバーの形成（矢印）に続いて、増殖成長（7日目）にD2A1セルの遷移中に増加した。共焦点顕微鏡、倍率X63。白いバーは20ミクロンに等しい。図はBarkanら17から変更。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> 図4。ミオシン軽鎖キナーゼの阻害（MLCK）D2A1細胞で介したF -アクチンのストレスファイバーの形成 D2A1細胞（コントロール）未処理だった、またはMLCK阻害剤（ML - 7、5μM）で処理した。、文化の日に48時間の始まりのために5、またはスクランブルまたはMLCK shRNAをで処理し、ミオシン軽鎖（MLC - P）（赤）、F -アクチン（緑）、および核（青）のリン酸化形態のために染色。 F -アクチンのマージ、およびMLC - P染色（黄色）。共焦点顕微鏡、倍率X63。白いバーは20ミクロンに等しい。

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	<li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models,+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy.">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li><li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors.">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases.">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations.">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site:+a+possible+contributor+to+dormancy.">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li><li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+of+solitary+metastatic+cells.">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells.">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li><li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+dormancy:+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer.">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li><li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li><li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+micrometastases.">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li><li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target.">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li><li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li><li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth.">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

転移性の成長への移行を検討されて休止状態または結果で腫瘍細胞を播種維持のメカニズムはほとんどわかっていない。この現象は、この問題に対処するために開発されている人間の患者4,12およびいくつかの前臨床モデルで勉強することは極めて困難されています。それにもかかわらず、腫瘍休眠の in vivo および ex - vivoモデル系の一部は（1,12のレ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> DMEM高グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM低グルコース</td><td>インビトロジェン</td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td>成長因子減少の3 - D Cultrex基底膜抽出物</td><td> Trevigen株式会社</td><td></td><td> 14-15mg/mlの間のタンパク質濃度</td></tr><tr><td> D2.0RとD2A1細胞株</td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2とK7M2AS1.46細胞</td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF - 7およびMDA - MB - 231乳癌細胞</td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8室のガラスのスライドシステム</td><td> （ラボ- TEK、サーモ科学） </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td>細胞力価96水溶液Oneソリューションの細胞増殖アッセイキット</td><td>プロメガ</td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> VECTASHIELDはDAPIでメディアをマウントする</td><td>ベクターラボラトリーズ（株） </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td>通常のロバ血清</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> ELISAプレートリーダー</td><td>バイオテック</td><td></td><td>記録490nmの</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイスLSM - 510 </td><td></td><td>倍率X63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

乳がんの再発はしばしば癌の徴候がないている、長い潜伏期間の後に、転移は原発腫瘍の除去と術後補助療法後何年までは臨床的に明らかになる場合があります。この現象の可能性のある説明は、腫瘍細胞は、転移部位を播種した従来の治療に耐性がある、との時間1〜4の長時間休止状態のままいることです。 セカンダリサイトで休止状態の癌細胞の存在はどちらも増殖されず、アポトーシス5-7を受ける静止孤独な細胞として、以前に記載されている。また、これらの孤独な細胞は、病気の進行8-10の初期段階で原発腫瘍から普及し、患者の骨髄、血液とリンパ節1,4,11で成長逮捕に存在することが示されている。したがって、休眠や増殖状態への切り替えを制御するメカニズムを理解することが病気の再発を防ぐために、新たな目標と介入を発見するために重要です。しかし、転移性増殖する腫瘍の休眠からスイッチを制御するメカニズムを解明することは可能なモデルシステムの不足によって妨げられている。 生体細胞と腫瘍細胞の転移の進行を研究するために生体外でのモデル系で以前に1,12-14記載されている。しかし、これらのモデルシステムは、リアルタイムに、高スループットの方法転移性疾患として増殖することが孤独な休眠腫瘍細胞の出現を誘発するものに機械的な洞察で提供していない。我々は最近（D2A1、MDA - MB - 231、K7M2）のどちらか休眠（D2.OR、MCF7、K7M2 - AS.46）または増殖転移挙動を示す細胞のin vivoでの増殖特性でモデル化するためにin vitroの系で 3Dを開発しました。 生体インチ我々は、転移部位での生体内で休眠を示す腫瘍細胞が3次元（3D）基底膜抽出物（BME）で培養すると、in vivoで高転移性細胞が容易に変数の後に3次元培養中で増殖するのに対し、静止したままであるが、比較的短いことが明らかに休止の期間。重要なのはin vitroのモデル系で 3Dを活用して我々は、ECM組成物は休眠腫瘍細胞が増殖状態に切り替わると、in vivo試験15から17 で 、これを確認したかどうかを制御するのに重要な役割を果たしていることを初めて示した。したがって、本報告書で説明されているモデル系は、in vitro法で腫瘍の休眠をモデル化し、微小環境が誘導される増殖性成長への移行を研究するために用意されています。

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

in vitroの系で修正された3 - Dは、再構成基底膜におけるいくつかの腫瘍細胞株の増殖特性が転移セカンダリサイトでの腫瘍細胞の休眠や増殖挙動と相関した表示されます<em&gt; in vivoで</em&gt;。

アンインビトロ</em転移性増殖に腫瘍の休眠とスイッチを研究する>システム

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.7K ビュー.  University of Haifa. in vitroの系で修正された3 - Dは、再構成基底膜におけるいくつかの腫瘍細胞株の増殖特性が転移セカンダリサイトでの腫瘍細胞の休眠や増殖挙動と相関した表示されます in vivoで。

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Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

人間の神経筋システムを研究するために経頭蓋磁気刺激の活用

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

医学

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

弱視における抑制の測定と治療

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

新規高分解能<em生体内で&gt;</em腫瘍増殖と治療に頭蓋内構造物の動的応答を研究する&gt;イメージング技術

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

腫瘍の増殖、浸潤及び血管新生を研究するために、ニワトリでのヒト多発性骨髄腫異種移植モデルの確立

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

同系マウスメラノーマ細胞の注入は、肺におけるそれらの転移能を決定するために、

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

眼底イメージングを使用して認知症を研究するには

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

前庭系を研究するラットの手術なるほど

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Rat DRG 圧縮モデルのための標準化された Tuina プロトコル

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

著者スポットライト:背根神経節の痛みの圧縮を伴うラットモデルに対するTuinaの鎮痛効果  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

背根神経節痛の圧迫を伴うラットモデルに対する推拿の鎮痛効果

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...

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