原発腫瘍の全身影響は、現在、転移性播種過程において重要な役割を果たすことが認識されている。しかし、これは実験的転移アッセイでは見落とされがちです。このモデルは、研究者がこの効果を評価する方法を提供することを目的としています。
このプロトコルには、臨床的に関連性のある原発腫瘍の外科的切除後の自然転移の評価が含まれています。主に、生物発光イメージングを利用して、肺の転移成長をリアルタイムで監視します。この実験設定は、ネオアジュバント設定における乳がんの薬理学的または遺伝的介入、および転移過程における特定のシグナル伝達経路の関連性を評価するために拡張できます。
まず、細胞培養培地を吸引して細胞を回収し、滅菌PBSで洗浄します。次に、2ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTA溶液と摂氏37度で約2〜3分間インキュベートし、細胞が剥離するまでインキュベートし、8ミリメートルの完全培地で洗浄して反応を急冷します。上清を吸引し、細胞をPBSで洗浄した後、細胞をPBSに再懸濁し、細胞を1ミリリットルあたり600万細胞に希釈するのに必要な計算量でPBSに懸濁します。
次に、細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、注射の準備が整うまで氷上に保ちます。麻酔をかけたマウスの腹部の毛を電動バリカンで剃り、仰臥位に置きます。次に、70%エタノールとポビドンヨード溶液を使用して、準備した腹部を洗浄します。
はさみを使用して、4番目の乳房組織のレベルで腹部の皮膚に小さな正中線切開を行い、下にある腹膜を露出させますが、貫通しません。次に、鉗子を使用して皮膚を腹膜から離し、滅菌生理食塩水に浸した綿棒で皮膚を腹膜から離し、横方向に動かして右の乳房脂肪パッドを露出させ、左側で繰り返して左の乳房脂肪パッドを露出させます。手動ピペットを使用してE0771細胞懸濁液を再懸濁した後、100マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
次に、等量の基底膜マトリックス溶液を加え、気泡が入らないように注意しながらよく混ぜます。その後、チューブを氷の上に保ちます。100マイクロリットルの細胞懸濁液を28ゲージの0.5ミリリットルU-100インスリン注射器に引き込み、氷の上に保ちます。
鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、左の乳房脂肪パッドをそっとつかんで露出させます。次に、50マイクロリットルの細胞懸濁液を乳腺脂肪パッドに注入し、注射器を取り外す前に3〜5秒待ちます。次に、鉗子から皮膚を離して、自然に正常な位置に戻り、皮膚の切開部を閉じて、皮膚のステープルを適用します。
同所性乳房腫瘍病変の成長を監視するには、ノギスを使用して原発腫瘍の長さと幅を週に3回測定します。麻酔後、疼痛管理のために40マイクロリットルのメロキシカムを皮下投与し、マウスを仰臥位に置きます。次に、必要に応じて以前の外科用ステープルを取り外し、70%エタノールとポビドンヨード溶液で腹部を洗浄します。
はさみを使用して、4番目の乳房組織のレベルで腹部の皮膚に小さな正中線切開を行い、下にある腹膜を露出させますが、貫通しません。次に、ハサミを使用して腫瘍の近位および遠位に位置する正常な乳腺組織を切断することにより、同所性腫瘍を切除します。腫瘍組織をバイオハザードバッグに捨てながら、反対側の腫瘍で手順を繰り返します。
次に、1〜3本のステープルを使用して手術部位を閉じ、マウスを温かい温熱パッドの下に設置した清潔なリカバリーケージに移します。骨抵抗が感じられるまで鼻から45度の角度で眼の内側眼瞼に挿入し、針が眼窩後静脈洞内に配置されるようにして、眼窩後注射を使用して100マイクロリットルのD-ルシフェリン溶液を動物に注射します。送達時に液体がフラッシュバックしていないことを確認し、イメージングの2分前に待ってください。
次に、ROI の測定ボタンをクリックします。剣状突起の下に正中線を切開し、皮膚、筋肉組織、腹膜を切開して、横隔膜が見えるまでハサミを使用して胸腔の下部を露出させます。その後、横隔膜に穴を開けて肺を崩壊させ、横隔膜を切断します。
右側と左側の胸郭を切断し、次に止血器を使用して剣状突起をつかみ、胸郭を邪魔にならないように移動して、心臓と肺を露出させます。次に、ハサミで右の心房を切り取ります。次に、左心室を通じて10ミリリットルの氷冷PBSを動物に灌流し、右心房から流れる液体が透明になり、肝臓が淡黄色に変わることを確認して灌流の完全性を評価します。
次に、気管を特定し、3ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドが入った22ゲージのニードルシリンジを挿入し、気管と平行に保持します。次に、肺が完全に膨らむまでゆっくりとしたペースで溶液を送達します。気管を優しく保持し続けます。
鉗子の上でハサミで切り取り、結合組織をすべて取り除きながら、組織を慎重に持ち上げ始めます。次に、心臓を肺から離剖します。その後、肺組織をPBS中の4%パラホルムアルデヒドに一晩置き、摂氏4度で保存して固定します。
C57 black 6マウスを使用すると、顕著な肺転移生物発光シグナルは、通常、原発腫瘍切除後約2週間で検出され、長期にわたって追跡することができますが、ルシフェラーゼレポーターの種類とマウス系統によって多少の変動が見られます。エンドポイントでの肺組織のex vivo生物発光イメージングにより、肺転移負荷の正確で高感度な定量が可能になり、他の治療法と比較するためにプロットできます。ステレオスコープ下での肺結節カウント、ヘマトキシリンおよびエオシン組織学的分析は、定量化研究を補完するために利用できます。
乳腺脂肪パッド注射後の針の抜管をわずかに遅らせると、マトリックス溶液がゲル化し、細胞懸濁液の漏出や乳房外腫瘍の発生を防ぐための鍵となります。現在、この技術をさまざまな遺伝子ノックアウトおよびノックインマウスモデルと組み合わせて利用し、転移カスケード、特に転移前ニッチの発達をさらに研究しています。
