この作品は、ジョンホーン（; R15MH083221 NIMH）にNIH R15 AREA助成金により賄われた。

1。トランスジェニック胚<ol><li>ここでは、トランスポゾンを介するエンハンサートラップ法8を介して作成されたゼブラフィッシュのトランスジェニックラインを使用しています。 KalTA4、GAL4転写活性化因子のゼブラフィッシュを最適化したバージョン、および赤色蛍光タンパク質、mCherry：トランスジェニック挿入は、2つのコーディング配列を含む。内因性エンハンサー配列の制御下でこのトランスジェニックカセットを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュのエンハンサートラップ法の収量ライン。したがって、特定のエンハンサー配列の同一性に応じて、KalTA4とmCherry両方の発現が脳の発達の特定の領域にローカライズされています。 ET（：Gal4TA4、UAS：zic4 mCherry）のために我々がここで使用していることをhzm5ライン、式はここで特に重要な、後脳、前脳、いくつかの部位に局在している、嗅球8（また、図1を参照してください。） 。発現のこのパターン、およびゲノム内のカセットの局在を考えると、導入遺伝子は、（また見zic4プロモーター8の制御下になると予測されている<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/神経画像/ lines_distel /メイン</a> 。）。 </li><li>大人のEt（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）トランスジェニック挿入のヘテロhzm5魚は通常、約50％トランスジェニック子孫を導く、WT（AB）の魚と交配されています。 （トランスジェニック子孫の高い割合では、2つのヘテロ接合体を交配することができます。） </li><li>色素形成をブロックし、蛍光イメージングを促進する、6-8 HPFで100μMのN -フェニルチオ尿素（PTU）の先頭にトランスジェニック胚を治療するために。 </li></ol> 2。取付胚<ol><li> 24から28 HPFで、PTUなし卵の水に胚を移す。蛍光顕微鏡を使用してmCherryの発現によってトランスジェニック胚を特定する。微細な鉗子を用いてトランスジェニック胚から絨毛膜を取り外します。 4：転送胚のエレクトロポレーションバッファーに加えて0.02パーセントtricaine [180 mMのNaCl、5mMのKClを、1.8 mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH 7.2のエレクトロポレーションバッファー]を含むペトリ皿に自分の絨毛膜から解放。麻酔のための2分は実装工程に進む前に有効にすることができます。 </li><li>ソリューションを電子レンジしてから、34〜37℃のインキュベーターにソリューションを配置することにより、エレクトロポレーションバッファーを加えたtricaineの低融点アガロースの0.5％溶液を準備します。アガロース溶液の温度が平衡化されていると、60ミリメートルペトリ皿の中央にアガロース溶液の大きな低下（〜500μl）を置きます。アガロースのこのドロップ、6〜8麻酔胚を追加。 </li><li>微細な鉗子（またはカットmicroloaderのピペットチップの細かい端）、位置はすべて同じ方向に向いていると縦の列に並ぶように胚を使用する。アガロースを固化し、位置に胚をトラップするには、氷の2-3 mmの大型ペトリ皿の上に皿を置きます。 </li><li>アガロースが固化した後、溶液が完全に固化したアガロースドロップをカバーすることを確認し、エレクトロポレーション緩衝液を加えたtricaineで料理をあふれさせる。 </li></ol> 3。プラスミドDNAの発現のマイクロインジェクション<ol><li>ミディまたはマキシプレッププラスミド単離キット（例えばQiagen）を用いてプラスミドのGFPの発現を準備します。の0.5μg/滅菌水の添加に加えて0.03パーセントのフェノールレッドの最終濃度にプラスミドを一時停止します。実験は、ここで説明するターゲティング嗅球では、複数のGal4結合部位（14タンデムUAS配列と基底魚のプロモーター、E1B）の制御下でEGFPのコード配列を持つ発現プラスミドを使用しています。このように、GFPの標的発現を仲介する、このプラスミドを用いて、トランスジェニックKalTA4転写因子を発現する細胞のみがGFPを発現することができるようになります。 注：ここで我々が​​開発し、脳の他の地域をターゲットとするために適用されるべきDNAの注射、の可視化のため、フェノールレッドを使用している、限り、地域が心室からアクセスすることができます。蛍光可視化を必要とする他の細胞型を標的とするために、BODIPYまたはQuantamドットの染料は、潜在的に蛍光灯照明下で注射を視覚化するために使用することができる。 </li><li>マイクロインジェクションピペットを水平または垂直ピペットプラーを使用して製造することができる。熱とプル強度の設定は、引き手の種類、発熱体の種類、およびガラスキャピラリーチューブの種類によって異なります。 サターP - 30垂直プラーを使用して、フィラメントを持つ薄肉ホウケイ酸ガラスキャピラリー[サッターインストゥルメント＃BF100 - 78 - 10]から長く、テーパー、シャープなピペットを生成するために980のヒートセットと960のプルフォースを使用。これらの設定に引っ張らMicroinjetionのピペットは封印されており、注入前に戻って分割しなければなりません。 </li><li>インジェクションピペットにDNAプラスミド溶液の1〜2μLを追加するmicroloaderのピペットチップを使用してください。 </li><li>山と圧力注入システムのピペットホルダーにロードされたピペットを確保する。 </li><li>圧力パルスが赤DNA溶液の吹かれたリリースを生成するまで細かい鉗子でロードされたピペットをブレイクバックする。また、チップはすぐに水中に沈め、折り畳まれた実験室のキムワイプを貫通して戻って分けることができます。 注：インジェクションピペットが最初に封印されており、手動でバック破られる必要があるため、チップサイズや注入量が可変である。理想的な注入ピペットは3-5注入パルスが完全に24 HPFの胚（40 psiで100ミリ秒の噴射パルス）の開発前脳の脳室を埋めるために必要としてください。 </li><li>そのようなそのDNAが隣接し、強制され、脳の発達の脳室内にプラスミドDNA溶液を注入し、中にインターカレー、嗅球を形成する運命脳の領域。嗅球は、前脳の脳室のほとんどの前壁の細胞から派生しています。このように、ピペットが発達中の脳の前端に向かって指しているような脳室にインジェクションピペットを挿入することにより、圧力注入は、DNAへと将来の嗅球に隣接して強制的に。赤色の染料が明らかに前脳の脳室の前端に表示されるまでのDNAを注入する。 DNAは、DNAを希釈する、すぐに拡散し始めるので、それは注射後、できるだけ早くエレクトロポレーションステップ（例えば、10秒以内）に進むことが重要です。 </li></ol> 4。エレクトロポレーション<ol><li>エレクトログラスプラチナ皮下電極（グラステクノロジー＃E2）から作られた自己構築電極を用いて行われる。電極は、ハンドヘルドプローブに結合され、白金電極との間の最終的な距離は1mm（建築の詳細については、9を参照）でなければなりません。方形波エレクトロポレーションパルスはグラスSD - 9刺激（グラステクノロジー、モデルSD - 9）に電極を接続することによって生産されています。 </li><li> 70ボルトで、単一の、5ミリ秒のエレクトロポレーションパルスを生成するためにSD - 9刺激を設定します。負極は、胚の頭部の後方のときに正極は、胚の前端に隣接して配置されるように電極を配置します。手動〜1秒で各パルスを分離し、SD - 9刺激のシングルモードスイッチを使用して〜7月8日電気パルスを開始する。適切な電圧は、胚の年齢や使用電圧源によって異なります。古い胚のエレクトロポレーション7を開始するために高い電圧を必要とするのに対し、若い胚は、より低い電圧が胚の損傷を避けるために必要です。 </li><li>胚は、アガロースからそれらを解放する前にエレクトロポレーション後、少なくとも10分間回復することができます。 </li><li>微細な鉗子を使用して、自分自身胚と実際の接触を避けながら、ゆっくりと胚の輪郭をトレースすることによりアガロースから胚を解放する。 </li><li>一度解放された、（PTUと必要に応じて）卵を水に胚を戻す。 28でそれらを保つ° C彼らはGFPの発現のために撮像されるようになるまで。 </li></ol> 5。イメージング用取付胚<ol><li>卵の水に加え、PTUから卵を水に加えて0.02パーセントtricaineに胚を移す。麻酔のための数分は実装工程に進む前に有効にすることができます。 </li><li>ソリューションを電子レンジしてから、34〜37℃のインキュベーターにソリューションを配置することにより、卵水+ tricaineの低融点アガロースの0.5％溶液を準備します。アガロース溶液の温度が平衡化されていると、35ミリメートルのペトリ皿の中央にアガロース溶液の大きな低下（〜300μl）を置きます。アガロースのこのドロップ一つ麻酔胚を追加。 </li><li>微細な鉗子を（またはカットmicroloaderのピペットチップの微細な端）を使用して、位置、彼らはそれが可能な正立顕微鏡（倒立スコープが異なる胚の形状を必要とする、開発途上の脳の背側を可視化すること、直立していることなどの胚と下からの可視化を可能にする別の皿、12を参照してください）。氷の2-3 mmの大型ペトリ皿の上に皿を置くことによってアガロースを固める。細かい鉗子による再配向可能性が高い胚がその側に倒れることがないように凝固時に必要となります。 </li><li>アガロースが固化した後、洪水卵水を加えたtricaineと料理は、ソリューションが完全に固化したアガロースドロップをカバーするようにしています。 </li></ol> 6。代表的な結果： GFPの発現は、エレクトロポレーション後の6時間には早くも観察することができますが、ここでは4日間標的細胞の神経突起構造が十分に発展しているようにエレクトロポレーション後の胚から画像を見せている。 ET（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）hzm5トランスジェニックエンハンサートラップラインは、5日後に受精（図1Aおよび1Cに後脳、小脳、前脳、そして胚の嗅球におけるmCherry（とKalTA4）の構成的発現が表示されます。）。ターゲットエレクトロポレーション（上記のように）、開発嗅球の細胞（図1B、1D、および1E）に制限されているショーのGFPの発現により援用プラスミドUAS - GFPの発現があった胚。唯一の細胞はトランスジェニック発現KalTA4転写因子は、このUAS - GFPプラスミドからの発現を活性化することができます。非トランスジェニック胚にこのプラスミドの組み込みは、任意の検出可能なGFPの発現につながるものではない。したがって、UAS - GFPと開発嗅球の細胞でGFPの排他的な表現につながるKalTA4ドライバのローカライズされたトランスジェニック発現の標的とエレクトロポレーションの複合作用である。 GFP発現細胞は嗅球僧帽細胞（図1Bおよび1D）10の典型的な軸索 ​​投射を示す。軸索突起を可視化するために、図1Bと1Dの画像は、細胞体の領域をはるかに越えて、暴露されたような高いレベルで暴露されなければならなかった。曝露の低いレベルでは（図1E）GFPを発現する細胞体が実際に嗅球（。、灰色の線は、嗅球の境界線を示す図1Cおよび1Eの比較）にローカライズされていることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="図1"/> 図1は、5 DPFのゼブラフィッシュ胚の嗅球でGFPの発現を対象とした。 ET（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）hzm5トランスジェニックエンハンサートラップラインは、後脳、小脳、前脳、および嗅球（とC、mCherry蛍光が赤で表示）にmCherryの構成的発現が表示されます。 mCherryのこの表現は、トランスジェニックGal4の発現によって媒介される。 28 HPFでUAS - GFPの発現ベクターでエレクトロポレーションされた胚は、緑色で示されて5日後に受精（B、D、およびE、GFP蛍光で嗅球の標的とGFPの発現が表示されます。同じ胚では、のようにとC）。下部に低いばく露のイメージは、（E）はGFPの発現は、嗅球の細胞体に制限されて表示されます。灰色の線は、嗅球の境界線を示している。ブライトフィールド（グレースケール）、緑色蛍光（緑）、および赤色蛍光（赤）画像は、すべてオリンパスBX60蛍光顕微鏡を取るれた。

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利害の衝突は宣言されません。

ここでは、発展途上嗅球の細胞の特定の集団にエレクトロポレーション導入遺伝子の発現を標的とするエンハンサートラップGal4のトランスジェニックラインを利用してゼブラフィッシュの in vivoエレクトロポレーション法で説明しています。このアプローチは、エンハンサートラップトランスジェニック行8を介した細胞型特異的な発現のin vivoエレクトロポレーション7 での優れた時間分解能を兼ね備えています。ここで我々は多くの異なった特定の細胞型または組織中のGAL4の標的発現で利用可能な生体内エレクトロポレーションでは 、嗅球の標的化が発展途上の神経系2-7、およびエンハンサートラップラインの他の地域をターゲットとするために使用することができます説明してきましたが、 8、11。もちろん、このエレクトロポレーション技術はまたのLexAやテトシステム13、14、15などの他のcombinatioral遺伝学的ア ​​プローチに適しているはずです。エレクトロポレーションの主な利点は、適切なGAL4 -回線が使用可能であることを考えれば、追加のトランスジェニックラインを作るためにある必要がないということです。これは半年を保存します。 in vivoでのエレクトロポレーションでは神経系の発達の特定段階に関心7のあるもので、神経細胞とその前駆体へのオリゴヌクレオチドの組み込みが可能になります。それは以前の発生段階において必要不可欠な機能を持つ遺伝子を標的と問題を回避できるので、この時間分解能は、機能喪失解析のために特に有利である。我々はここで説明する方法はまたのRNAiオリゴヌクレオチドまたは構造とモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド4,7を含めて機能喪失型の試薬 ​​を組み込むために使用することができます。このようなドミナントネガティブ蛋白質の発現プラスミドまたはショートヘアピンのRNAiプラスミドなどのプラスミド駆動型試薬はまた、我々はGFPの発現のためにここに示されている正確な細胞タイプ特異的発現を可能にする、Gal4のUASの制御下に置くことができます。

試薬： <ul><li>アガロース、低融点（シグマ、A9414） </li><li>プラスミドミディやマキシプレップキット（例えばキアゲン、＃12643] </li><li>フェノールレッド（シグマ、P3532） </li></ul>設備： <ul><li>フィラメントとガラスキャピラリー、ID = 0.78ミリメートル、外径= 1.0ミリ（サッタインスツルメンツ、＃BF100 - 78 - 10） </li><li>草SD - 9刺激（グラステクノロジー、モデルSD - 9） </li><li>草のプラチナ皮下電極、直針（グラステクノロジー、＃E2） </li><li>マイクロローダーのピペットチップ（エッペンドルフ、＃X22703R） </li><li>ピペットプラー（例えばサター、モデルP - 30） </li><li>ピペットプラー（例えばサター、モデルP - 30） </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

in vivoでのエレクトロポレーションではCのものも含めて、胚の特定領域にDNAの発現プラスミドは、RNAi試薬、及びモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供するための強力な方法です虫 、ひよこ、 アフリカツメガエル 、ゼブラフィッシュ、マウス1。ゼブラフィッシュでは、 生体内エレクトロポレーションでこれらの試薬​​2-7の配信のための優れた空間分解能と時間分解能を有することが示されている。それが開発の特定の段階でこれらの試薬の取り込みを可能にするため、この方法の時間分解能が重要です。エレクトロベクトルから式が6時間7内に発生するため、また、、この方法は、トランスジェニックのアプローチよりもタイムリーです。単セル2、6をターゲットにしたときの空間分解能が非常に正確にできますが、それは、組織または構造内の特定の細胞集団に試薬を配合するのが望ましい。複数のセルをターゲットとする場合、in vivoでのエレクトロポレーションで胚の特定の地域に配信するために効率的ですが、特に発展途上の神経系の中で、それは単に空間的に離散的なエレクトロポレーションによって特定の細胞型を標的とすることは困難である。また、エンハンサートラップトランスジェニックラインでは、導入遺伝子8の優れた細胞タイプ特異的発現を提供する。ここでは、特にゼブラフィッシュ嗅球の神経細胞の開発を対象とする生体内エレクトロポレーション7、9 で空間的に離散的にトランスジェニックGAL4ベースエンハンサートラップライン8を組み合わせたアプローチを説明します。 ET（zic4：Gal4TA4、UAS：mCherry）hzm5（旧GA80_9）エンハンサートラップラインは、以前に8を説明し、、mCherryの対象とトランスジェニック発現は後脳などの発展途上の脳の複数の領域におけるゼブラフィッシュ最適化されたGAL4（KalTA4）転写活性化因子によって媒介表示されます。小脳、前脳、および嗅球。嗅球に特異的にGFPの発現を標的に、複数のGal4結合部位（UAS）の制御下にGFPをコードする配列を持つプラスミドを24から28時間後に受精（HPF）における前脳の前端にエレクトロした。このメソッドは、前脳の複数の領域にプラスミドDNAが組み込まれているが、GFPの発現はトランスジェニックKalTA4転写因子を発現する細胞に誘導される。従って、GA080_9トランスジェニックラインを使用して、このアプローチは、発展途上嗅球で排他的にGFPの発現につながった。以前に嗅球10の僧帽細胞のために説明したように、このアプローチを通して標的GFP発現細胞は、典型的な軸索 ​​投射を示した。この方法はまた、空間的及び時間的離散の機能喪失解析する方法を提供するショートヘアピンRNA干渉発現プラスミド、を含む他の試薬の標的配信を使用することができる。

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Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

遺伝子操作の時間的および空間的分解能は、彼らがかき乱すことができる生命現象のスペクトルを決定します。ここでは、時間的空間的に離散的な使用<em&gt; in vivoで</em開発嗅球の神経細胞で特異的にGFPの導入遺伝子の発現を誘導するためにゼブラフィッシュのトランスジェニック系統を組み合わせる&gt;エレクトロポレーション、、。

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K ビュー.  Pace University. 遺伝子操作の時間的および空間的分解能は、彼らがかき乱すことができる生命現象のスペクトルを決定します。ここでは、時間的空間的に離散的な使用 in vivoでエレクトロポレーション、、。

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Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

エンハンサートラップフリッパーゼの幼虫における発現と成人のマッピングとその応用ショウジョウバエ CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

神経科学

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

光反射率と自家蛍光信号を用いたマウス嗅球におけるイメージングの臭い誘発活動

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...