עבודה זו מומנה באמצעות R15 NIH AREA להעניק ג&#39;ון הורן (NIMH; R15MH083221).

1. טראנסגנטי עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן אנו משתמשים בקו מהונדס של דג הזברה נוצר באמצעות שיטה משפר transposon בתיווך מלכודת 8. הכנס מהונדס כולל שני רצפים קידוד: KalTA4, גרסה דג הזברה ממוטבת של Gal4 activator תעתיק, ואת חלבון פלואורסצנטי אדום, mCherry. שיטת מלכודת משפר התשואות שורות של דג הזברה מהונדס המבטאים זה קלטת מהונדס תחת שליטה של ​​רצף משפר אנדוגני. לפיכך, בהתאם לזהותו של רצף מסוים משפר, ביטוי הן KalTA4 ו mCherry הוא מקומי על אזורים מסוימים במוח המתפתח. עבור Et (zic4: Gal4TA4, כטב&quot;מ: mCherry) קו hzm5 כי אנו משתמשים כאן, הביטוי הוא מקומי לאתרים מספר למוח האחורי, המוח הקדמי, וכן, חשיבות מיוחדת כאן, את הנורה חוש הריח 8 (ראה גם איור 1). . בהינתן הדפוס הזה של הביטוי, ועל לוקליזציה של הקלטת בתוך הגנום, transgenes הם חזו להיות תחת שליטה של האמרגן zic4 8 (ראה גם <a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ הדמייה / lines_distel / העיקרי</a> .). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למבוגרים Et (zic4: Gal4TA4, כטב&quot;מ: mCherry) hzm5 דגים הטרוזיגוטיים להכניס את מהונדס הם מזדווגים בדרך כלל עם דג (AB) WT, מובילה לצאצאים מהונדס כ 50%. (לקבלת אחוז גבוה יותר של צאצאים מהונדס, שני heterozygotes ניתן הזדווגו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לחסום את היווצרות פיגמנט ולאפשר דימות פלואורסצנטי, עוברים לטיפול מהונדס עם תחילת N-100 phenylthiourea (PTU) מיקרומטר ב hpf 6-8. </li></ol> 2. הרכבה עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב hpf 24-28, העברת עוברים למים ביצה ללא PTU. זיהוי עוברים מהונדס ידי ביטוי mCherry באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הסר את קרום כוריוני מעוברים מהונדס באמצעות מלקחיים בסדר. עוברי העברה משוחררים סיסית שלהם כדי בצלחת פטרי המכילה מאגר electroporation פלוס 0.02% tricaine [הצפת electroporation: 180 mM NaCl, KCl 5 מ&quot;מ, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, 5 HEPES מ&quot;מ, pH 7.2] 4. אפשר 2 דקות ההרדמה ייכנסו לתוקף לפני שתמשיך לשלב גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.5% נמוך ההיתוך נקודות agarose ב electroporation חיץ פלוס tricaine ידי במיקרוגל את הפתרון, ואז למקם את הפתרון לתוך 34-37 ° C חממה. לאחר טמפרטורה של הפתרון agarose יש equilibrated, מקום טיפה גדול (~ 500 μl) של הפתרון agarose למרכז בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ. הוספת 6-8 עוברים בהרדמה לירידה זו agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קנס (או מסתיים קנס של טיפים pipet לחתוך microloader), מקם את העוברים כזה שהם כולם פונים לאותו כיוון ו מיושרים בשורה אנכית. כדי לחזק את agarose, ואת המלכודת עוברים במצב, במקום מנה על צלחת פטרי גדולה עם 2-3 מ&quot;מ של קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, להציף את המנה עם electroporation חיץ פלוס tricaine, להבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את הירידה הקרושה agarose. </li></ol> 3. מיקרו הזרקה של ביטוי ה-DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ביטוי ה-GFP פלסמיד באמצעות ערכת midi או maxi-הכנה בידוד פלסמיד (למשל Qiagen). להשעות את הפלסמיד לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / μl במים סטריליים פנול אדום בתוספת 0.03%. במשך הניסוי נורה הריח מיקוד המתואר כאן, אנו משתמשים בביטוי פלסמיד עם רצף של קידוד EGFP בשליטת Gal4 אתרים מרובים מחייב (14 רצפי טנדם כטב&quot;מ ואת האמרגן דגים הבזליים, E1b). שימוש פלסמיד, תאים בלבד transgenically המבטא את גורם שעתוק KalTA4 יוכלו להביע את ה-GFP, ולכן המתווך ביטוי ממוקד של ה-GFP. הערה: כאן אנו משתמשים פנול אדום עבור להדמיה של זריקות ה-DNA, שאמור להיות רלוונטי עבור מיקוד באזורים אחרים של המוח המתפתח, כל עוד האזור ניתן לגשת החדרים. עבור המיקוד של סוגי תאים אחרים שדורשים להדמיה ניאון, Bodipy או Quantam צבעים דוט העלול לשמש כדי לחזות זריקות תחת תאורה ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes Microinjection יכול להיות מפוברק או באמצעות חולץ פיפטה אופקי או אנכי. הגדרות חום למשוך כוח ישתנו בהתאם לסוג חולץ, סוג גוף החימום, ואת סוג של צינורות זכוכית נימי. בעזרת חולץ P-30 סאטר אנכי, להשתמש בהגדרה חום של 980 ו למשוך כוח של 960 לייצר ארוך, קוני, טפטפות החד זכוכית דק דופן נימי בורוסיליקט עם חוטים [כלי סאטר # BF100-78-10]. Pipettes Microinjetion משך עם הגדרות אלה אטום יש לשבור חזרה לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה פיפטה microloader להוסיף 1-2 μl של פתרון ה-DNA פלסמיד ל פיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרלאבטח את פיפטה נטען לתוך בעל מערכת הזרקה בלחץ פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שישבור את גב פיפטה עמוסה מלקחיים בסדר עד פולסים הלחץ לייצר שחרור נפוח של פתרון ה-DNA אדום. לחלופין, טיפים ניתן לשבור בחזרה על ידי במהירות חודר מתחת למים, מקופל Kimwipe מעבדה. הערה: מאחר pipettes הזרקת חתומות בתחילה יש לשבור בחזרה באופן ידני, גודל קצה נפח הזרקה משתנה. Pipettes הזרקת אידיאלי צריך לדרוש 3-5 פולסים הזרקה לחלוטין למלא את החדר forebrain פיתוח של 24 עוברי hpf (100 פעימות ms זריקה ב 40 psi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את פתרון ה-DNA פלסמיד לתוך החדרים של המוח המתפתח כאלה כי ה-DNA הוא נאלץ צמוד, ו intercalated לתוך האזור של המוח שנועד ליצור את הנורה חוש הריח. הנורה הריח נובע תאים בדופן הקדמי ביותר של החדר forebrain. לכן, על ידי הוספת פיפטה זריקה לתוך החדרים כך פיפטה מצביע לקראת סוף הקדמי של המוח המתפתח, הזרקה בלחץ כוחות ה-DNA לתוך ובצמוד הנורה הריח פוטנציאליים. להזריק DNA עד צבע אדום נראה בבירור בקצה הקדמי של החדר forebrain. בגלל ה-DNA מתחיל לפזר מיד, דילול DNA, חשוב להמשיך לשלב electroporation בהקדם האפשרי לאחר ההזרקה (למשל, בתוך 10 שניות). </li></ol> 4. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation מתבצעת באמצעות בהקמה עצמית אלקטרודות עשויות פלטינה אלקטרודות subdermal גראס (עשב טכנולוגיה # E2). האלקטרודות מחוברות בדיקה כף יד, והמרחק הסופי בין אלקטרודות פלטינה צריך להיות 1 מ&quot;מ (לפרטים על הבנייה לראות 9). כיכר גל פולסים electroporation מיוצרים על ידי חיבור אלקטרודות SD-9 גראס ממריץ (עשב טכנולוגיה, דגם SD-9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ממריץ SD-9 כדי לייצר יחידה, 5 ms פולסים electroporation ב 70 וולט. מקם את האלקטרודות כזה האלקטרודה החיובית ממוקם סמוך לקצה הקדמי של העובר, ואילו האלקטרודה השלילית האחורי של ראש העובר. ידנית ליזום ~ 7-8 פולסים electroporation באמצעות מתג מצב יחיד של ממריץ את SD-9, להפריד כל הדופק ידי ~ 1 שניות. מתח מתאים ישתנה בהתאם לגיל העוברים ואת מקור מתח בשימוש. עוברים צעירים דורשים מתח נמוך כדי למנוע נזק לעובר, בעוד עוברי מבוגרים דורשים מתח גבוה כדי ליזום electroporation 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים להתאושש דקות לפחות אחרי 10 electroporation לפני לשחרר אותם מן agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, לשחרר את העוברים מן agarose על ידי התחקות בעדינות את קווי המתאר של עוברי תוך הימנעות ממגע ממשי עם העוברים עצמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר פעם אחת, להחזיר את העוברים למים ביצה (עם PTU במידת הצורך). שמור אותם על 28 מעלות צלזיוס עד שהם צילמו להיות ביטוי של GFP. </li></ol> 5. עוברים הרכבה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים מהמים ביצה פלוס PTU למים ביצה פלוס 0.02% tricaine. אפשר מספר דקות ההרדמה ייכנסו לתוקף לפני שתמשיך לשלב גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 0.5% נמוך ההיתוך נקודות agarose בביצה מים בתוספת tricaine ידי במיקרוגל את הפתרון, ואז למקם את הפתרון לתוך 34-37 ° C חממה. לאחר טמפרטורה של הפתרון agarose יש equilibrated, מקום טיפה גדול (~ 300 μl) של הפתרון agarose למרכז בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. מוסיפים העובר הרדים לירידה זו agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קנס (או מסתיים קנס של טיפים pipet לחתוך microloader), מקם את העוברים כזה כי הם זקוף, כך שניתן לדמיין תצוגה הגבי של המוח המתפתח עם מיקרוסקופ זקוף (טווחי הפוך ידרוש הגיאומטריה העובר שונה, וגם מנה שונה המאפשר הדמיה מלמטה; לראות 12). לחזק את agarose על ידי הנחת צלחת על צלחת פטרי גדולה עם 2-3 מ&quot;מ של קרח. Re אוריינטציה עם מלקחיים בסדר סביר להניח שיהיה צורך במהלך מיצוק על מנת להבטיח כי העובר לא מתהפך על צדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר agarose יש הקרושה, להציף את צלחת עם ביצה מים בתוספת tricaine להבטיח כי הפתרון מכסה לחלוטין את הירידה הקרושה agarose. </li></ol> 6. נציג תוצאות: למרות הביטוי GFP ניתן להבחין מוקדם ככל 6 שעות לאחר electroporation, כאן אנחנו מראים תמונות מעובר 4 ימים לאחר electroporation כזה כי המבנה neurite של התאים הממוקדים פיתחה מספיק. Et (zic4: Gal4TA4, כטב&quot;מ: mCherry) hzm5 מהונדס קו משפר מלכודת מציגה ביטוי המכונן של mCherry (ו KalTA4) ב למוח האחורי, המוח הקטן, המוח הקדמי, ואת פקעת ההרחה בעוברים ב 5 ימים לאחר ההפריה (איור 1A ו-1C). עוברים כי יש לו ביטוי כטב&quot;מ-GFP פלסמיד שולבו על ידי electroporation ממוקד (כמתואר לעיל), ביטוי של GFP להראות כי היא מוגבלת תאים של הנורה לפתח חוש הריח (איור 1B, 1D, 1E ו). התאים רק transgenically-לבטא את גורם שעתוק KalTA4 מסוגלים להפעיל ביטוי מתוך פלסמיד זה כטב&quot;מ-GFP. התאגדות זו הפלסמיד לתוך הלא מהונדס עוברי אינו מוביל לגילוי כל ביטוי של GFP. לכן, הפעולה המשולבת של electroporation ממוקד של כטב&quot;מים-GFP וביטוי מהונדס מקומי של הנהג KalTA4 שמוביל הביטוי הבלעדי של ה-GFP בתאים של הנורה חוש הריח מתפתח. GFP-לבטא בתאי להראות תחזיות axonal טיפוסי של תאים הנורה הריח צניפי (1B 1D איור ו) 10. על מנת לחזות תחזיות האקסון, תמונות 1B הדמות 1D היה להיחשף ברמות גבוהות כאלה כי האזור של גופי התא היו גם חשוף יתר. רמה נמוכה יותר של חשיפה (איור 1E) מראה כי גופי התא להביע GFP הם נקודתיים אכן הנורה חוש הריח (איור להשוות 1C ו 1E,. קו אפור מסמן את הגבול של הנורה חוש הריח). <img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. ממוקד ביטוי ב-GFP הנורה חוש הריח של העובר 5 דג הזברה DPF. Et (zic4: Gal4TA4, כטב&quot;מ: mCherry) hzm5 מהונדס קו משפר מלכודת, מציגה ביטוי המכונן של mCherry במוח הקטן למוח האחורי, המוח הקדמי, ואת פקעת ההרחה (A ו-C, mCherry הקרינה באדום). ביטוי זה של mCherry מתווך על ידי מהונדס Gal4 ביטוי. עוברים כי כבר electroporated עם וקטור כטב&quot;מ-GFP ביטוי ב hpf 28, להציג ביטוי של GFP ממוקד הנורה הריח בבית 5 ימים לאחר ההפריה (B, D ו-E, GFP הקרינה שמוצג ירוק. לעובר זהה ו ג). תמונה חשיפה נמוכה יותר בתחתית (ה) מראה כי הביטוי GFP מוגבל גופי התא של הנורה חוש הריח. הקו האפור מציין את הגבול של הנורה חוש הריח. השדה מואר (בסולם אפור), ירוק פלואורסצנטי (ירוק), אדום פלואורסצנטי (אדום) התמונות היו לוקחים עם מיקרוסקופ אולימפוס BX60 פלואורסצנטי.

<ol>
	<li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305, 254-258 (2004).</li><li>Teh, C., Parinov, S., Korzh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ways+to+admire+zebrafish:+progress+in+functional+genomics+research+methodology.">New ways to admire zebrafish: progress in functional genomics research methodology.</a> Biotechniques. 38, 897-906 (2005).</li><li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+DNA,+RNA,+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos.">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li><li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+methods+for+in+vivo,+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development.">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural Development. 15, 2-6 (2007).</li><li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae.">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).</li><li>Kera, S. A., Agerwala, S. M., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temporal+resolution+of+in+vivo+electroporation+in+zebrafish:+a+method+for+time-resolved+loss-of-function.">The temporal resolution of in vivo electroporation in zebrafish: a method for time-resolved loss-of-function.</a> Zebrafish. 7, 97-108 (2010).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).</li><li>Hoegler, K. J., Horne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+zebrafish+optic+tectum+using+in+vivo+electroporation.">Targeting the zebrafish optic tectum using in vivo electroporation.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2010).</li><li>Nobuhiko, M., Kozo, M., Tatsuya, T., Shin-ichi, H., Hitoshi, O., Yoshihiro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+olfactory+bulb+to+higher+brain+centers:+genetic+visualization+of+secondary+olfactory+pathways+in+zebrafish.">From the olfactory bulb to higher brain centers: genetic visualization of secondary olfactory pathways in zebrafish.</a> J. Neurosci. 29, 4756-4766 (2009).</li><li>Davison, J. M., Akitake, C. M., Goll, M. G., Rhee, J. M., Gosse, N., Baier, H., Halpern, M. E., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Developmental Biology. , 304-811 (2007).</li><li>Distel, M., Kö, s. t. e. r., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development.">in vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> CSH Protocols. , (2007).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 320, 113-121 (2008).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiasdis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> PNAS. , 107-10 (1993).</li><li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Sch&#228;rer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System.">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הנה שתיארנו בשיטה electroporation vivo ב דג הזברה אשר מנצל מלכודת משפר Gal4 קו מהונדס למקד ביטוי transgene electroporated לאוכלוסייה ספציפית של תאים הנורה חוש הריח מתפתח. גישה זו משלבת את הרזולוציה הטמפורלית מצוינת ב electroporation vivo 7 עם הביטוי תאים מסוג מסוים בתיווך משפר קווי מלכודת מהונדס 8. אמנם יש לנו כאן תיאר את המיקוד של הנורה חוש הריח, ב electroporation vivo ניתן להשתמש כדי למקד לאזורים אחרים של מערכת העצבים המתפתח 2-7, ו משפר קווי מלכודת זמינים עם ביטוי ממוקד של Gal4 סוגים רבים שונים של תאים ספציפיים או רקמות 8, 11. כמובן, זה טכניקה electroporation צריך להיות גם מתאים אחרים גישות גנטיות combinatioral כגון LexA או ט מערכות 13, 14, 15. היתרון העיקרי של electroporation היא שיש לא צריך לעשות קווי מהונדס נוסף בהתחשב בעובדה מתאים Gal4 שורת זמין. זה חוסך שישה חודשים. בשנת vivo electroporation מאפשר שילוב של oligonucleotides לתוך הנוירונים ומבשרי שלהם בכל מה השלב הספציפי של התפתחות מערכת העצבים מעניין 7. זו החלטה הזמני יתרון במיוחד עבור ניתוח הפסד של פונקציה, כי זה יכול לעקוף בעיות עם מיקוד גנים שיש להם פונקציות חיוניות בשלבים התפתחותיים קודמים. השיטה שנתאר כאן יכול לשמש גם לשלב הפסד של פונקציה ריאגנטים כולל oligonucleotides RNAi או בונה morpholino אנטי תחושה oligonucleotides 4, 7. פלסמיד מונחה ריאגנטים כגון דומיננטי שלילי הביטוי פלסמידים חלבון או סיכת קצר פלסמידים RNAi יכול גם להיות תחת בקרה של Gal4 כטב&quot;מ, המאפשר סוג מסוים של התא ביטוי מדויק הראינו כאן ביטוי של GFP.

ריאגנטים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Agarose, התכה נמוכה נקודות (Sigma, A9414) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכת midi או maxi-הכנה פלסמיד (למשל Qiagen, # 12643] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנול אדום (Sigma, P3532) </li></ul> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נימי זכוכית עם נימה: ID = 0.78 מ&quot;מ; OD = 1.0 מ&quot;מ (סאטר מכשירים, # BF100-78-10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גראס SD-9 ממריץ (עשב טכנולוגיה, דגם SD-9) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטינה גראס אלקטרודות subdermal, המחט ישר (טכנולוגיה גראס, # E2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-מטעין פיפטה טיפים (Eppendorf, # X22703R) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה חולץ (למשל סאטר, דגם P-30) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה חולץ (למשל סאטר, דגם P-30) </li></ul>

targeting olfactory bulb neurons using combined in vivo electroporation and gal4-based enhancer trap zebrafish lines

בשנת vivo electroporation היא שיטה רבת עוצמה להעברת ביטוי ה-DNA פלסמידים, RNAi ריאגנטים, ו morpholino אנטי תחושה oligonucleotides לאזורים ספציפיים של עוברים בפיתוח, כולל אלה של ג elegans, אפרוח, Xenopus, דג הזברה, ועכבר 1. בשנת דג הזברה, ב electroporation vivo הוכח יש רזולוציה במרחב ובזמן מצוין עבור משלוח של אלה ריאגנטים 2-7. הפתרון הזמני של שיטה זו הוא חשוב משום שהוא מאפשר שילוב של חומרים כימיים אלה בשלבים מסוימים בהתפתחות. יתר על כן, כי הביטוי של וקטורים electroporated מתרחשת בתוך 6 שעות 7, שיטה זו היא יותר מאשר בזמן גישות מהונדס. בעוד ברזולוציה מרחבית יכול להיות מדויק מאוד, כאשר המיקוד תא בודד 2, 6, היא לעתים קרובות עדיף לשלב חומרים כימיים לתוך אוכלוסיה תאים ספציפיים בתוך הרקמה או מבנה. כאשר המיקוד תאים מרובים, electroporation vivo יעילה עבור משלוח לאזור ספציפי של העובר, אך במיוחד בתוך מערכת העצבים המתפתח, קשה למקד סוגי תאים מסוימים אך ורק דרך electroporation בדידה מרחבית. לחלופין, משפר מלכודת קווי מהונדס להציע תא מצוין סוג ספציפי ביטוי transgenes 8. כאן אנו מתארים גישה המשלבת מהונדס Gal4 מבוססי קווי משפר מלכודת 8 עם בדידים מרחבית in vivo electroporation 7, 9 עד שמתמקדים בפיתוח נוירונים של הנורה הריח דג הזברה. Et (zic4: Gal4TA4, כטב&quot;מ: mCherry) hzm5 (לשעבר GA80_9) קו משפר מלכודת בעבר תיאר 8, מציגה ביטוי מהונדס ממוקד של בתיווך mCherry על ידי דג הזברה אופטימיזציה Gal4 (KalTA4) activator תעתיק באזורים שונים של המוח המתפתח כולל למוח האחורי, המוח הקטן, המוח הקדמי, ואת פקעת ההרחה. כדי למקד את ביטוי ה-GFP במיוחד כדי הנורה חוש הריח, פלסמיד עם רצף הקידוד של ה-GFP תחת שליטה של ​​Gal4 אתרים מרובים מחייב (כטב&quot;מ) היה electroporated אל הקצה הקדמי של המוח הקדמי בשעות 24-28 לאחר ההפריה (hpf). אמנם שיטה זו משלבת פלסמיד דנ&quot;א לאזורים שונים של המוח הקדמי, ביטוי של GFP הוא המושרה רק בתאים transgenically המבטא את KalTA4 גורם שעתוק. כך, באמצעות קו GA080_9 מהונדס, גישה זו הובילה ביטוי של GFP אך ורק הנורה חוש הריח מתפתח. תאים GFP להביע ממוקד באמצעות גישה זו הראתה תחזיות axonal טיפוסי, כפי שתואר לעיל עבור תאים מיטרלי של הנורה חוש הריח 10. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור משלוח ממוקד של חומרים כימיים אחרים, כולל סיכת קצר הביטוי פלסמידים התערבות RNA, אשר יספק שיטה מרחבית בדידה temporally הפסד של פונקציה ניתוח.

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines at JoVE.com

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

ברזולוציה של זמן ומרחב של מניפולציות גנטיות קובע את הספקטרום של תופעות ביולוגיות כי הם יכולים להפריע. כאן אנו משתמשים ובזמן מרחבית בדידה<em&gt; In vivo</emElectroporation&gt;, בשילוב עם קווי מהונדס של דג הזברה, כדי לגרום ביטוי של GFP transgene במיוחד בנוירונים של הנורה חוש הריח מתפתח.

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

targeting-olfactory-bulb-neurons-using-combined-vivo-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

12.0K Views.  Pace University. ברזולוציה של זמן ומרחב של מניפולציות גנטיות קובע את הספקטרום של תופעות ביולוגיות כי הם יכולים להפריע. כאן אנו משתמשים ובזמן מרחבית בדידה In vivo, בשילוב עם קווי מהונדס של דג הזברה, כדי לגרום ביטוי של GFP transgene במיוחד בנוירונים של הנורה חוש הריח מתפתח.

Video: Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

מיפוי יישומים הביטוי Flippase Enhancer-מלכודת הזחל וגם למבוגרים תסיסנית CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

נוירונים חוש הריח באף הושגו באמצעות ביופסיה משולבת עם Microdissection הלייזר-Capture: גישה פוטנציאלית לחקר טיפול בהפרעות נפשיות תגובה

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadunple Immunostaining של הנורה חוש הריח עבור ויזואליזציה של חוש הריח חושפת אקסון מולקולרית קודי זהות

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...