本研究では、BSにQGとT32 - DC008072にNIH DC052256とDC006015、およびNSF 0324769によってサポートされています。

1。準備 この手順では、バイオセーフティーレベル2であり、従って、以下のすべての準備がマイクロインジェクションの手順が実行されるバイオハザードフードで作られています。 <ol><li>準備と予備加熱。37℃のウォーターベッド：水とビニール袋を記入 - 空に加熱ブロックインキュベーターのシールとのセットを。これは、マウスは、次の注入を回復することができます。 </li><li>この手順からのすべての廃棄物の浸漬に適した量に10％漂白剤でバイオハザード廃棄物容器を埋める。 </li><li> 70％エタノールおよび生物学的安全キャビネットの滅菌ddH2Oと場所で2番目の皿の小さなオープン皿を準備します。 </li><li>プランジ​​ャーは、すべての方法を引き出して70％エタノールで体や針の下に噴霧することにより、33ゲージ針で5μL容量ハミルトンシリンジを滅菌する。繰り返し皿からエタノールを吸引除去し、少なくとも5回、それすべての方法を取り出します。 </li><li>少なくとも5回吸引して排出する滅菌水で注射器のカートリッジを洗浄します。安全な場所文化のフードで注射器を置き、それが乾燥することができます。 </li><li>解凍できるように、氷上で-80℃の冷凍庫に保管し、場所からウイルスストックを取り外します。マイクロインジェクションは、10 9感染単位/ mLの力価でマウスあたりのウイルスストックの2μlを必要とします。レンチウイルスは、確立されたプロトコル（ロイスら 、2002）によると商業的供給源から入手または実験室で製造することができる。 </li><li>フードの表面から浮き出た面積を提供するインジェクション段階を準備 - キムワイプのシートで覆われた10cmの培養皿を使用することができます。 </li><li>注入駅近くのアルコール綿を手配。 </li></ol> 2。嗅上皮へのレンチウイルス粒子のマイクロインジェクション このメソッドで実行されるすべての動物の手順はIACUC承認されたガイドラインに基づいて行われます。ハツカネズミ系統C57BL/6Jは、ここに示したすべての実験で用いた動物モデルである。 <ol><li>ケージから子犬マウス（P0 - P3）を取り出し、氷上で5分間のカット、オープン手袋に子犬を置くことによって、低体温による仔マウスをAnaesthetize。 </li><li>子犬が滅菌ハミルトンシリンジにウイルスストックの完全に麻酔、吸引2μlをされるのを待つ間。 </li><li>注射のステージの上に子犬マウスを置きます。ゆっくりと首の上部に向かって耳に頭の上から離れて肌を引き出します。これは、鼻腔を介して教えて皮膚表面を提供する必要がありますし、注入を容易に行うことができる。 </li><li>嗅上皮に到達するための皮膚表面下に3ミリメートル程度鼻腔の上部から針を挿入します。左と右の両方の側面ごとに2つのサイトを、（マウス1匹あたり合計4回の注射に必要なウイルスの=2μlの）選択、ショットごとのウイルス溶液の0.5μLを顕微注入する。注射部位は、互いに間隔ずらして配置する必要があります。適切な注射部位を標的とするために、嗅球の概要については、背側頭蓋骨表面を検索する。この行は、半透明の皮膚や頭蓋骨を介して出生時にほとんど見えないです。側面ごとに2回の注射を行うには、中心軸一つの電球の輪郭にちょうど吻側回の注射を目指しています。電球の輪郭に横秒の挿入を行い、まだ内側にするので、電球の下に腹側に存在する嗅上皮に到達する可能性があることを注入を角度にしてください。嗅球を貫通しないでください！ </li><li>注射部位またはキムワイプを使用して鼻孔の開口部から脱出する可能性のある残存ウイルス液や血液を乾燥汚点。直ちに希釈液の漂白剤バイオハザード容器にキムワイプ処分する。 </li><li>ウォーターベッドのインキュベーターに注入マウスを置きます。 </li><li>繰り返しますがマウス当たりウイルスストックの2μlの約が必要になります覚えて、注入されるすべてのマウスの1-4を繰り返します。 </li><li>元のネストケージに戻す前に、マウスが30分間ウォーターベッドのインキュベーターにリカバリできます。 </li><li>マイクロインジェクションのステージ、消毒ワイプと液体漂白剤バイオハザード廃棄に余分なクリーニングの紙製品を廃棄してください。 </li><li>として準備のステップで行う繰り返し吸引とエタノールの放出し、水でハミルトンシリンジを清掃してください。シリンジが乾燥することができます。 </li><li>最大の導入効率のために4時間で再び、この手順を繰り返します。感染OSNsは3日間、わずかに細胞の長さにわたって可視化されることがあります。 </li></ol> 3。フローティング嗅球切片の免疫組織化学<ol><li>希望する時点で注入マウスを犠牲にし、血流は、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。 OBをばらばらにする。一晩一晩して、パラホルムアルデヒドでPBSに30％ショ糖をインキュベートする。ドライアイス上のOCT包埋媒体に埋め込む。 </li><li>冠状OBのセクションは、クライオスタットを用いて厚さ60μmで得られる。 5mLの1 × PBS（pH7.4）で10cmの培養皿に電球のセクションをスイープ。セクションは、DにOCTを許可するようにPBSに浮かんで維持する必要がありますissolve。 50mLのコニカルバイアルにフローティングセクションとPBSを転送する。 </li><li>セクションはバイアルの底に沈降することができます。任意のセクションを吸うことなく、PBS掃除機で吸い取る。 20mlのPBSで組織切片を洗浄します。落ち着くと掃除機をかける手順を繰り返します。 10mLのPBSと免疫染色用15mlのコニカルバイアルへの転送フローティングセクションで再懸濁します組織。一度組織切片では、組織を乱すことなく、PBS清オフ真空を解決している。 0.3パーセントトリトンX - 100界面活性剤は細胞膜を穿孔することができます1X PBS、pH7.4の（PBS - TX）にある再懸濁しますセクション。室温で10分間インキュベートする。 PBS - TXと上清と繰り返しインキュベーションオフ真空倍。 </li><li>室温で2時間ブロッキング溶液の10mLを（PBS - TXの5％ウマ血清）で組織切片をインキュベートします。 </li><li>室温で15分間ごとに、PBS - TXで少なくとも二回ブロッキング溶液を洗い流す。 </li><li> PBS - TXでの一次抗体溶液の2mLのを準備します。この実験で使用した抗体のための試薬および器具のセクションを参照してください。 </li><li>一次抗体溶液で2番目のPBS - Txのブロッキング洗浄を交換してください。 ℃で24〜48時間60μmフローティングセクションに徹底浸透を確実にするために4℃でゆっくり振盪プラットフォーム（〜30rpm）でインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、一次抗体溶液を注意深くピペットを使って取り出すことができますし、4℃で保存強度を染色のいずれかをあまり失うことなく、二週間以内にさらに2回まで再利用のためのC。 </li><li>穏やかに回転（〜30rpm）で、室温で切片を20分ごとに、PBS - TXで3回洗浄する。 </li><li> PBS - TXの二次抗体の希釈の2mLのを準備します。最後の洗浄を掃除機で吸い取ると組織切片への二次抗体溶液を加える。フルオロフォアの光退色を引き起こす可能性がある光を、遮断するアルミ箔で染色バイアルの外側を包みます。場所は、4℃で一晩ゆっくりと揺動プラットフォームとインキュベートでバイアルを包んだ。 </li><li>離れて掃除機で二次抗体溶液を捨てる。室温で20分間ごとに、PBS - TXで一回のセクションを洗ってください。室温で20分間ずつPBSでさらに2回（pH7.4）をすすいでください。 Fluoromount G.を使用してガラススライド上に染色した組織切片をマウントします。 </li><li>蛍光顕微鏡で積極的に感染OSNの軸索と軸索の末端のための染色切片を介してスクリーン。 </li><li>ラベル付けOSN軸索と終末の三次元ビューを構築するために、共焦点顕微鏡を使用してターゲットOBの組織切片（z軸に沿った）の60μmの深さを介して光セクションのシリーズを作る。 </li><li> Z -セクションの画像のこのスタックは、その後、その全体のターミナルアーバの詳細を含む単一のラベルが付いたOSN軸索の360 °回転する視点を、再構築するために一緒に投影することができます。いずれかの単一の回転角度がキャプチャされ、2次元形式のプレゼンテーション用のイメージファイル（例：JPG、TIFF）としてエクスポートすることができます。 </li></ol> 4。代表的な結果方法はここで説明すると、我々はin vivoでのレンチウイルスによって嗅覚ニューロンを伝達することができます。我々はこれまで免疫細胞を介したmycタグ融合タンパク質と同様に、GFPとmCherry蛍光レポーターと感染OSNsを可視化した。この手法は、感染したOSNsの豊富さを提供します。それでも、伝達では、単一の細胞形態の解析を可能にする、個別にラベル付けOSNsを提供するために散発的に十分に発生します。軸索と軸索末端は、共焦点顕微鏡（図1）により、ネイティブな環境に囲まれたOB組織切片内に撮像されています。全体OSN軸索終末は通常40 -50μmの光学部内で魅了することができます。感染OSNの軸索末端の高倍率は、糸球体層における軸索のアーバーの形態の詳細な分析を行うことができます。 <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> 図1。単一の嗅覚ニューロンの軸索とその端末のアーバーの軌跡。）嗅神経層（ONL）を示すP7のマウスの嗅球の冠状セクションでは、OMP（赤）を免疫染色し、糸球体層（GL）は、OMPの両方を用いて免疫染色とVglut2（グレー）。 GFP（緑）を発現する単一の嗅覚ニューロンの軸索は、ONL内に移動し、糸球体の構造に浸透する。 B）糸球体内の軸索終末の形態は、明らかにGFPの発現によって強調。灰色のVglut2共同染色は、GFP陽性の軸索は、端末のABORをきれいに仕上ている内に、総glomular面積を照らす。 C）OEにおけるGFP（緑）を発現するレンチウイルス感染OSNsが。嗅上皮のcytostructureは、DAPI染色（青色）で表示されます。 GFPの発現は、OEのOSNの細胞体およびそれらの細胞プロセスを可視化できる。 D）Rap1GAP2発現とOSNの軸索とその端末の形態がノックダウンしたshRNAによる。下のマウスU6プロモーターとGFPの下Rap1GAP2 shRNAを使用してデュアル発現カセットを運ぶレンチウイルスCMVプロモーターは、OEに適用した。 GFPのみのコントロールのそれと比較した場合、感染した嗅覚軸索末端はより簡素化されたターミナルアーバーを示した。バー=20μmの。

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

このプロトコルは、バイオセーフティレベル2に準拠しています。すべての適切なワークスペース、個人用保護具、およびウイルス性廃棄物の封じ込め対策がそれに応じて確立されている。すべての動物の手順は、IACUCガイドラインに従って行った。

OSNゲノムDNAに遺伝子構築物の永久的な移転のレンチウイルスの結果のマイクロインジェクション。このアプローチは、私たちは過剰発現またはshRNAを介したノックダウンを経由して候補遺伝子の短期または長期の操作を実行することができます。さらに、我々は蛍光嗅覚受容体の個体群の共局在を観察するために、既存のトランスジェニックマウスのラインで単一のOSNsにラベルを付けること...

マイクロインジェクション：新生児マウスは33ゲージの注射針（ハミルトン＃7762〜06）を装備した5μLハミルトンシリンジ（ハミルトン＃7647〜01）を用いてマイクロインジェクションした。 免疫細胞化学試薬：一次抗体：ウサギポリクローナル抗体のGFP（Molecular Probes社＃- 6455）、OMPに対するニワトリポリクローナル抗体（カスタム）（Chenら、2005。）、VGlut2に対するモルモットポリクローナル抗体（ミリポア＃AB2251）。二次抗体：Cy2とコンジュゲートロバ抗ウサギ（ジャクソンImmunolab＃711-225-152）、Cy3結合ロバ抗ニワトリ（ジャクソンImmunolab＃703-165-155）およびCy5結合ヤギ抗モルモット（ジャクソンImmunolab＃106-175-008）。セクションは、50ng/mL DAPIクロマチン染色液でFluoromount G（サザンバイオテック＃0010〜01）でスライドガラス上にマウントされました。 共焦点イメージング：Z -スタックのイメージはオリンパスFlouview FV1000共焦点顕微鏡とオリンパスFV10 - ASW 2.01共焦点取得と解析ソフトウェアを用いて3次元予測に収集し、処理された画像を用いて撮影した。

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

正確な嗅覚回路の開発は、嗅球（OB）で、そのシナプスのターゲットへの嗅覚ニューロン（OSN）軸索の正確な投影に依存しています。 OSN軸索の成長と標的の分子メカニズムはよく理解されていない。遺伝子発現を操作すると、単一のOSNの軸索とその終末の形態の可視化、その後のことはこれまでに挑戦されている。指定された時間フレーム内の単一細胞レベルでの遺伝子機能を調べるために、我々は、in vivoで OSNsで遺伝子発現を操作するレンチウイルスベースの技術を開発。レンチウイルス粒子は、嗅上皮（OE）にマイクロインジェクションによってOSNsに配信されます。発現カセットは、その後、恒久的に形質導入​​OSNsのゲノムに組み込まれている。緑色蛍光タンパク質の発現は、感染したOSNsを識別し、軸索終末分を含めて、彼らの全体の形態の概要を説明します。マイクロインジェクションし、レポーターの検出との間の短いターンアラウンドタイムの​​ために、遺伝子機能の研究は、開発の非常に狭い期間内に集中することができます。この方法では、我々は、3日間、わずか三ヶ月限り、次の注入内でGFPの発現を検出した。私たちは、ノックダウンレンチウイルスマイクロインジェクションによって媒介過剰発現やshRNAの両方を達成している。このメソッドは、 生体内での単一細胞レベルでのOSN細胞体と軸索の詳細な形態を提供するため、嗅覚、開発中の候補遺伝子の機能の特性評価が可能になります。

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

我々は、単一の嗅覚ニューロンの軸索とその終末分枝の遺伝子操作と可視化のためのレンチウイルス技術を提示<em&gt; in vivoで</em&gt;。

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K ビュー.  University of California, Davis. 我々は、単一の嗅覚ニューロンの軸索とその終末分枝の遺伝子操作と可視化のためのレンチウイルス技術を提示 in vivoで。

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

神経科学

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.