著者は、技術サポートのために博士は公僕趙と丹霞柯に感謝します。我々は、博士に感謝する。それらの画像処理ソフトウェアを共有するためのエドワードEgelmanとNiko Grigorieff。我々はまた、医学のピッツバーグ大学大学の構造生物学低温電子顕微鏡施設、Beowulfクラスタおよびグリッドをサポートするスタッフを認めます。この作品は、GM082251とGM085043によってサポートされていました。

1。凍結水和したEM試料作製 HIV - 1キャプシドタンパク質（CA）アセンブリ9低温電子顕微鏡の画像で強力なバックグラウンドノイズを寄与する、唯一の高塩（1M NaCl）をバッファで安定しているため、我々は一時的に塩を低減する方法をブロッティング急速希釈し、裏面を使用してください凍結水和したEMグリッドを準備する濃度。 <ol><li> 25秒用に25mAの下に200メッシュのR2 / 1 Quantifoil銅グリッドのグロー放電では、炭素側。 </li><li> 80％に、、環境室内の湿度をもたらすために自家製マニュアル重力のプランジャーを噴霧器を使用してください。 </li><li> FEI Vitrobotプランジャデュワー、液体窒素を使ってクールな液体エタンで。手動の重力のプランジャーにプランジ凍結デュワーをマウントします。 </li><li>鉗子にマウントされているグリッドの炭素側、上に組み立てられたCAのソリューション2.5μLを適用し、あなたから離れて直面しているグリッドの炭素側とプランジャに鉗子を読み込みます。 </li><li>グリッドの背面側に低塩の希釈バッファー（100mMのNaCl）を3μlを加え、直ちにろ紙片でグリッドの裏面にしみ。グリッドの全体の裏面には、ろ紙を削除する前に、約6秒間、ろ紙と密接な連絡をしてください。直ちにろ紙を除去した後、液体エタン中にグリッドを突き通す。 </li><li>プランジ​​ャーから鉗子を外し、すぐにグリッドストレージボックスにグリッドを移す。 </li></ol> 2。 CA管状アセンブリの低温電子顕微鏡<ol><li> 200kvでFEI Polara G2電子顕微鏡の動作に凍結水和したグリッドをロードし、ガタン4Kx4K CCDカメラを装備。 </li><li>低線量の検索モードの下で、&lt;0.001e〜200倍の倍率でと用量との- / Å 2は 、適切な氷のある地域のためのグリッド全体を審査し、stageファイルでこれらの領域の位置を保存する。 </li><li>低線量の検索モードで3900 xの倍率で保存された位置とさらに画面これらの領域を思い出してください。データ収集のために、穴の上に十分に分離、長い管を含む氷の均一な、薄層で領域を選択します。第二段階のファイルにこれらの領域の場所を保存してください。 </li><li>露出あたり/ Å 2 - 59000 X、はめ込み100μmの目標の開口部、および〜15 Eの投与のための客観的紅斑出現し、ビーム強度を調整するの倍率で露出モードに切り替えます。 </li><li>低線量の検索モードに戻るには、保存した位置に移動し、CCDカメラを用いて良好なチューブを識別し、センター。フォーカスモードに切り替えて、フォーカスを調整し、0.5〜2.5μmの間で、通常、デフォーカス値を設定します。露出モードに切り替え、15 Eの投与量については、0.3から0.5秒の露光時間を設定します- / Å 2、および画像を収集する。画像は、プレートのカメラで収集され、露光が行われる前に、フィルムは10秒間静置してください。 </li><li>次に保存した位置に移動し、より多くの画像を収集するために手順5を繰り返します。 </li><li>フィルムは12分間フル強度D19で開発され、6.35ミクロンのピクセルサイズでニコンスーパーCOOLSCAN 9000 EDのスキャナを使用してデジタル化されています。画像ファイルの形式はTIFFです。 </li></ol> 3。ヘリカルインデックス作成ベッセル次数 n、およびレイヤの行番号、L：ヘリカルオブジェクトは、2つのパラメータでインデックスを作成することができます。として（N、L）を特徴とフーリエ変換の各レイヤの線は、2次元格子から表記を使用して、（H、K）のインデックスで表される螺旋状の物体の表面の格子上にラインのセットに対応しています。任意の（H、K）の場合は、（N HK、L HK）層の線は、NおよびLの値である2つの基本的なベクトル（nは 10、L 10）と（N 01、L 01）、の線形結合である二つの主要層の線（1,0）と（0,1）。lはフーリエ変換でZ軸に沿って測定されたレイヤの行の高さから取得することができます。 nの値は次の式10を用いて推定することができます πRr≈J のn≈1.1 | N | -0.9 .....................( 1） J nは n 番目の層線の強度を決定するベッセル関数、ここで、rはヘリカルオブジェクトの半径であり、そしてRは、層線の最大振幅の半径です。レイヤの行番号、lは 、選択ルール11でnに関連している L = TN + UM ....................( 2） ここで、t と u は、螺旋の定数である。任意のらせんの場合は、（または非常に密接に）正確にはT Cを正確にuは単位があるかもしれませんompleteになります。 <ol><li> EMANのプログラム12 helixboxerを使用して均一な直径を持つ比較的まっすぐで長いチューブ外箱とMRCの形式で画像を保存する。 </li><li> MRCのパッケージ13のような&quot;imgccf&quot;として相互相関ベースのプログラムを使用してヘリカルリピート距離、cを 、、、決定する。 </li><li>繰り返し距離、cの積分である新しいボックスの長さでフーリエ変換を計算する。 </li><li>二つの基本的な表面の格子ベクトル（1,0）を定義し、（0,1）は、2つの主要な層の行を選択してください。 </li><li>それぞれ、R 01 L 10、R 10、L 01、管の半径、r、およびフーリエ変換の2つの主要な層の線の高さと半径を測定する（図1）。 </li><li>式（1）にしたがってnを 10とN 01を計算する。 </li><li> n個の値しか推定なので、nを 10とN 01のいくつかの組み合わせがプログラムパッケージIHRSRを使用して、正しいらせん対称性を見つけるために（ステップ4.2を参照）後のステップでテストされています。 </li><li>サブユニット間のローテーション（Δφ）と一つ星のらせん（N = 1）の軸方向の上昇（ΔZ）：2つの実数で記述されたネジの対称性を計算する。 L 10、L 01、N 10、N 01の値を与え、uとtは、選択規則に従ってm個の値の範囲（例えば、-50 &lt;M &lt;50）をテストすることによって得ることができます。最後に、ΔφとΔZはΔφ= 360 T / UとΔZ= C / Uを使用して計算されます。 </li></ol> 4。三次元再構築<ol><li>粒子のセグメンテーション<ol><li> EMANのパッケージ内のプログラムのグラフィカルプログラムのボクサーを、使用して、らせん状粒子を含む顕微鏡写真を開きます。 </li><li>重複するセグメントにヘリカル粒子をカット。ボクサーのコントロールパネルでは、Helixのモードを選択し、ボクシング​​のパラメータを設定する：箱の大きさは粒子の直径よりも大きくする必要があり、&quot;OLAP&quot;の値は、ボックスの大きさの〜90％でなければならない。 </li><li>ヘリカル粒子のいずれかの端を左クリックした後、ボクサーは自動的にらせんの長さに沿って粒子の一連のボックスを生成します。 </li><li>箱入りのセグメントだけでなく、それらの座標を保存します。 </li></ol></li><li> IHRSRプログラムを使用して初期の三次元再構成<ol><li>低温電子顕微鏡像のコントラストを反転し、反復ヘリカル実空間の再構成法（IHRSR）で処理する前に14（オプション）ローパスフィルタリングを適用する。 </li><li> &quot;ジェネレータ&quot;と入力してIHRSRプログラムのグラフィカルインタフェースを開きます。スタックの名前とパスを含む箱入り粒子のスタックのすべての情報、とグラフィカルインタフェース、スタック内の画像の数を提供する、対称性のパラメータなどの値は、再建のスクリプトを作成するためのボタン&quot;Finish&quot;をクリックして、 b25.spi。 </li><li>初期のリファレンスとして実又は中空の円筒を使用し、通常は数サイクル後に発生する定義されているネジの対称性、に変更がないまで、サイクルへの手続きを可能にする。右ヘリカル対称性は、安定的に収束の再建を与える必要があります。最後のサイクルで生成された再建は、さらなる改良のための最初の基準として使用されます。 IHRSRはSPIDERプログラムを使用して三次元再構成を実行します。 </li></ol></li><li>反復改良15との再建はIHRSRによって生成された3D再構築は、現在追加の改良のための最初の基準として使用されます。洗練された中に、ヘリカル対称性は、ΔφとIHRSRの手順から決定されるΔZ、に固定されています。 <ol><li>プログラムCTFFIND3とCTFTILT 16を使用して顕微鏡でデフォーカスと非点収差の存在を決定する。 </li><li> SPIDERプログラム17を使用してCTFによる粒子のセグメントを掛けます。 SPIDERのスイートでFTと呼ばれる操作は、2次元画像のフーリエ変換（FFT）を計算するために使用されます。その後、FFTはSPIDERスイート内のMUと呼ばれる操作を使用して、前の手順で決定した、CTFの値が乗算されます。得られた値は、再び、SPIDERの操作を使用して実空間でのFTを新しいイメージを（CTF補正）を形成する逆変換、逆です。 </li><li>マルチリファレンスアラインメントを使用して、CTF -補正画像と参照量の予測を比較することによって、投影のマッチングを行います。面外傾斜角の変化は、+ / -10 °に制限し、1 °ステップでサンプリングされます。このような各セグメントのアラインメントパラメータの0 °または180 °、およびX -シフト限定、近くに高い相関係数、面内の角度などの制約を導入する。制約を満たす再建のみのセグメントに含まれています。 </li><li>それぞれが洗練サイクルを反復した後、3D再構築は、CTFにわたって合計で逆投影を使用して生成され、分割されています2。 </li><li>対称化ボリュームを生成するらせん対称性を課す。新しい3D復元の解決にはさらなる改善が発生していないときに反復改良は終了します。 </li><li>画像処理パッケージSPIDERは、洗練されたステップのほとんどに使用されます。一連の操作は、操作とパラメータ値の配列を含むユーザが作成したバッチコントロールファイルであるSPIDERのスクリプトによって制御されます。最終的な再建は、SPIDERスイートでプログラムを使用して計算されます。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果： 単一のHIV - 1 CA A92Eチューブ（図1a）は、箱入りの出であり、そのフーリエ変換（図1b）はヘリカルインデックス作成のために算出した。レイヤの線（1,0）と（0,1）に対して、L 10 = 28、L 01 = 37、R 10 = 55、R 01 = 44。 211.57Åのチューブの半径を考えると、我々は、N 10 =- 12、nは 01 = 11（ここで、利き手が所定した）近似。 5195.48Åの繰り返しの距離で、管のねじの対称性は、ΔZのように決定された= 6.8093Å、Δφ= 328.88 °。 ΔZ、Δφは7.1321Åと328.86に洗練°でIHRSR（図2a）と初期の再建を使用することは図に示されています。図2b。最終的な復興（図3）、反復改良した後、IHRSR（図2b）で計算された初期のモデルから大幅に密度マップを改善。 <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="図1"/> 図1 HIV - 1 CAヘリカルチューブのインデックス作成。 （A）、単一のHIV - 1 CA A92Eチューブの画像を。スケールバー、30nmの。 （B）フーリエ変換（A）に示すようにチューブの変換。ヘリカル指数（N 10 =- 12、nは 01 = 11）が示されています。 23Aの解像度でレイヤーの線に矢印をポイントします。 <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。IHRSRを使用して初期の再建。各反復サイクルのための（A）スクリューの対称性の決定。 10は改良のサイクルを反復した後、ΔφとΔZは、初期値から開始し、安定した値に収束する。 （B）10、反復サイクル後の最初の3次元密度マップ。 <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。反復改良後の3次元密度マップ。 （AC）CAチューブの密度マップは、3つの直交スライスとして表示されます。チューブ軸に平行して管軸（B）に対して垂直に、表面（）に近い、と平行管軸（C）へと経由。スケールバーは10nm。 （D）3次元密度マップの表面のレンダリングには、100％の体積を囲む1.8sで輪郭。

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利害の衝突は宣言されません。

我々は、螺旋状物体の3次元構造を取得するためのわかりやすいアプローチを提供する一連のプロトコルを提示する。記載された手順を使用して、我々は、シングルチューブのイメージ（176セグメント）からHIV - 1キャプシドアセンブリの3D構造を取得しました。高分解能構造は、より多くの画像データを含むことによって達成することができます。 最適なデータ収集と分析のためのいくつかの重要なポイントがあります：まず、低温電子顕微鏡の試料の準備中に、試料溶液はサンプルのサイズよりもやや厚くなるソリューションの均一な、薄い層を残して、ブロットされるべきである。サンプルをブロットにいくつかの異なる方法があります。このようなHIV - 1 CAアセンブリとして細菌細胞および管状試験片については、特に背面側から、片側からブロッティング、最も適切です。 第二に、らせんの利き手は、これがヘリカルインデックス作成または再構築によって行うことができないとして、決定する必要がある。一般的な方法は、利き手を判断するために18をシャドウイングロータリー続いて、凍結エッチングを使用することです。密度マップの解像度が十分に高い場合に利き手は、ポスト再建を決定することができます。正しい利き手が想定される場合、個々の成分の3次元原子モデルは、密度マップによく適合している必要があります。そうでなければ、反対の利き手を仮定する必要があります。 第三に、ウィーナーフィルタは、ノイズの増幅を低減するため、位相と振幅補正の両方に対して、画像処理中に使用する必要があります。単一のイメージからCTFは常にゼロ交差を持っているので、逆格子空間内の情報の一部は失われます。したがって、それは別のデフォーカス値で3次元再構成、各画像形成されたために含まれる複数の投影データをセット持っていることが必要である。

<table border="1"><tbody><tr><td> の名前 </td><td> 元 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 100Xグロー放電装置</td><td> 100Xグロー放電装置</td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polaraフィールドエミッション銃を持つF30顕微鏡</td><td> FEI、オレゴン州ヒルズボロ</td><td></td></tr><tr><td>ガタン4K X 4K CCDカメラ</td><td>ガタン、プレザントン、カリフォルニア州</td><td></td></tr><tr><td>プランジ​​凍結装置</td><td></td><td>自家製マニュアル重力のプランジャー</td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200メッシュholely炭素銅グリッド</td><td> Quantifoilマイクロツール、Jena、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td> EMソフトウェアEMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EMソフトウェアIHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/〜ehe2n /</a> </td><td>エドワードH. Egelmanから利用できるプログラム</td></tr><tr><td> EMソフトウェアスパイダー</td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRCによるヘリカル加工ソフト</td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td>浩二米倉から利用できるプログラム</td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILTと実空間ヘリカル洗練ソフトウェア</td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure of hiv-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction

画像処理と組み合わせることで低温電子顕微鏡（クライオEM）は、高分子タンパク質複合体とアセンブリの構造決定のため、ますます強力なツールです。実際には、単一粒子の電子顕微鏡1と2次元（2D）電子線結晶学2は比較的日常的方法論となっていると構造物の多数はこれらのメソッドを使用して解決されている。それと同時に、画像処理とヘリカルのオブジェクトの3次元（3D）再構成は急速に、特に、ヘリカル対称性と併せて単粒子解析ツールを使用してヘリカル実空間の再構築（IHRSR）方法3を 、反復開発しました。アクチンフィラメント4、微小管5、アミロイド繊維6、タバコモザイクウィルス7、及びバクテリアの鞭毛8、および、を含む糸状またはらせんの形態、の多くの生物学的実体の機能ヘリカルエンティティの3D密度マップは、単一の投影から達成することができるので、画像は、非ヘリカルオブジェクトの3D再構成するために必要な多くの画像と比較して、IHRSRメソッドを使用して、このような柔軟性と不規則ヘリカルアセンブリの構造解析は、現在達成可能です。 このビデオの記事では、我々はクライオ- EMによるクライオEMの試料作製、低用量のデータ収集のためのプロトコルを含むヘリカルタンパク質のアセンブリの3D密度マップ（HIV - 1キャプシド9は私たちの例です）、、インデックス作成をobtainingための詳細なプロトコルを提供ヘリカル回折パターン、およびIHRSRを使用して画像処理と3次元再構成の。他の技術に比べ、低温電子顕微鏡は、ほぼネイティブ条件下での最適な標本の保全を提供しています。サンプルは、急速冷凍により、硝子体、氷の薄層に埋め込まれており、放射線損傷を最小限に抑えるために低用量の条件下で、液体窒素温度で電子顕微鏡で画像化されています。サンプル画像は低信号と記録された顕微鏡の低コントラストを犠牲にしてほぼネイティブ条件下で得られる。幸いなことに、ヘリカル再建のプロセスは、主にらせん状の回折パターンのインデックスを作成するのを除いて、自動化されています。ここでは、インデックスらせん構造へのアプローチを説明し、デジタル化された顕微鏡写真から3次元ヘリカル再構成のための不可欠なステップをヘリカル対称性を（ヘリカルパラメータ）を決定します。簡単に言えば、我々はIHRSR法を適用して初期の3次元密度マップを得る。この初期マップは、反復的にこのように自由の学位を制御し、各セグメントの位置合わせパラメータの制約を導入することにより洗練されている。さらなる改善が電子顕微鏡のコントラスト伝達関数（CTF）（振幅と位相の補正）のために補正することにより、組立のらせん対称性を最適化することによって達成されます。

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Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

この記事では、低温電子顕微鏡を用いて螺旋状に組み立てられた分子の3次元（3D）構造を取得する方法を説明します。このプロトコルでは、我々は反復ヘリカル実空間再構成法による密度地図を達成するための詳細な3次元再構成の手順を説明するために、HIV - 1キャプシドアセンブリを使用してください。

クライオ電子顕微鏡によるHIV - 1キャプシドアセンブリの構造とヘリカル実空間の反復再構成

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K ビュー.  University of Pittsburgh School of Medicine. この記事では、低温電子顕微鏡を用いて螺旋状に組み立てられた分子の3次元（3D）構造を取得する方法を説明します。このプロトコルでは、我々は反復ヘリカル実空間再構成法による密度地図を達成するための詳細な3次元再構成の手順を説明するために、HIV - 1キャプシドアセンブリを使用してください。

ビデオ: Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' surface envelope glycoprotein. We previously proposed that the crown of the V3 loop, although dynamic and sequence variable, is constrained throughout the population of HIV-1 viruses to an immunologically relevant &beta;-hairpin tertiary structure. Importantly, there are thousands of different V3 loop crown sequences in circulating HIV-1 viruses, making 3D structural characterization of trends across the diversity of viruses difficult or impossible by crystallography or NMR. Our previous successful studies with folding of the V3 crown1, 2 used the ab initio algorithm 3 accessible in the ICM-Pro molecular modeling software package (Molsoft LLC, La Jolla, CA) and suggested that the crown of the V3 loop, specifically from positions 10 to 22, benefits sufficiently from the flexibility and length of its flanking stems to behave to a large degree as if it were an unconstrained peptide freely folding in solution. As such, rapid ab initio folding of just this portion of the V3 loop of any individual strain of the 60,000+ circulating HIV-1 strains can be informative. Here, we folded the V3 loop of the R2 strain to gain insight into the structural basis of its unique properties. R2 bears a rare V3 loop sequence thought to be responsible for the exquisite sensitivity of this strain to neutralization by patient sera and monoclonal antibodies4, 5. The strain mediates CD4-independent infection and appears to elicit broadly neutralizing antibodies. We demonstrate how evaluation of the results of the folding can be informative for associating observed structures in the folding with the immunological activities observed for R2.

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

The crown region of different V3 loop sequences of the surface envelope glycoprotein (gp120) of HIV-1 can be structurally characterized in many cases by in silico folding of positions 10 to 22 of the loop using a state-of-the-art ab initio folding algorithm. Here we demonstrate the folding and evaluation of this region of the V3 loop from the R2 strain of HIV-1, a uniquely neutralization sensitive strain with puzzling functional properties.

によるHIV - 1 V3ループクラウンR2シーケンスの免疫学的に関連する動的第三紀の構造的特徴の評価第一原理折りたたみ

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

免疫・感染学

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

遺伝子型アプローチを用いた配列解析によるHIV-1コレセプター使用（指向性）の予測

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...