この作品は、医内科ファンドのマサチューセッツ総合病院部（JMT、MKM、MLC、JMV）、生体イメージングの国立研究所と生物工学助成T32EB006348（CEC）、マサチューセッツ総合病院の計算および統合生物の開発資金のためのセンターとAI062773（によってサポートされていましたRJH）、助成金AI062773、DK83756、そしてDK 043351（RJX）、NSF 0643745（MJL）、NIH R21CA133576（MJL）、および国立衛生研究所の国立アレルギー感染病研究所（NIAID）（NIH）AI057999（JMV ）。我々は技術支援のために有用な議論をニコラスC.ユッダーに感謝、そしてチャールズフェルト（RPI社）。

1。光トラッピングのための病原体の培養条件<ol><li> 3日間、30℃でSBD（サブローデキストロース）を含む半固体寒天培地上でA. フミを （B-5233/RGD12-8）成長する。 </li><li> C.を拡大30℃シェーカーインキュベーターで一晩100μg/ mlのアンピシリンを含有するYPDでアルビカンス （SC5314）（酵母ペプトンデキストロース）液体培養℃に</li></ol> 2。蛍光標識のための病原体の調製<ol><li>収穫は、病原体の量を求め、1.5 mLの反応チューブに移す。 </li><li>リン酸塩の追加300μLを反応管に緩衝食塩水（PBS）。 </li><li> 30秒間混合物を超音波処理してください。 </li><li> 1分間4000 rpmで遠心する。 </li><li>ペレットを残す、上清を吸引除去する。 </li><li>リピート（2.4）と（2.5）をさらに2回。 </li><li> PBSの500μLに再懸濁します。 </li></ol> 3。蛍光色素を用いて病原体のラベリング<ol><li> 100μLのジメチルホルムアミド（DMF）（10 mg / mLの濃度）に関心の色素（例えばのAlexa Fluor ® 488のAlexa Fluor 647）1mgを溶解する。 </li><li>洗浄後の病原体を含む反応管に染料混合物を3μLを加える。 </li><li> ° Cで1​​時間の回転または37サンプルを振る。 </li><li> 1分間4000rpmで遠心分離することによってPBS 3Xでサンプルを洗浄してください。 </li><li> PBS 300μlで再懸濁します。 </li></ol> 4。全血からT細胞を収穫<ol><li>全血を（新鮮な）を取得。 </li><li>暖かい血、PBS + 2％ウシ胎児血清（FBS）、および室温にhistopaque。 </li><li>全血の50μL/ mLでRosetteSepヒトCD4 + T細胞の濃縮カクテルを追加。 </li><li>サンプルを回転させ、室温で20分間インキュベートする。 </li><li> PBS + 2％FBS等量のサンプルを希釈し、穏やかに混合する。 </li><li>層は、混合を最小限に抑え、histopaqueの上にサンプルを希釈</li><li>ブレーキオフ、室温で1,200 xgで20分間遠心。 </li><li>豊かなセルを削除します。 </li><li> PBS + 2％FBS溶液で2倍濃縮された細胞を洗浄。 </li><li>赤血球の溶解用緩衝液で2分間赤血球を溶解する</li><li> PBS + 2％FBSを10 mLを加え、5分間1500rpmで溶解赤血球を遠心分離</li><li>ペレットを乱さないように注意して、上清を吸引する</li><li> 10％ウシ胎児血清を含むIMDM培地中に再懸濁します。 </li></ol> 5。チャンバースライドにRAW 264.7マクロファージの調製<ol><li> DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）は10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L -グルタミンを含むように準備します。 </li><li> 37〜温かいお風呂で暖かいメディア、トリプシン、およびPBS℃に</li><li> PBSでプレートの2倍を洗う</li><li>それぞれの洗浄の間にPBSを吸引除去する。 </li><li> （10cmの組織培養プレート用）表面を覆うようにプレートに5 mLのトリプシンを追加。 </li><li> 37℃で5分間インキュベート℃を</li><li>静かにプレート表面から細胞を分離するためにプレートの側面をノック。プレートの外側にトリプシンを飛散しないように注意してください。 </li><li>トリプシンのメディアを5 mLまたはそれに相当する額を追加。 </li><li>反応管に混合物を吸引除去する。 </li><li> 3分間1,000 × gで遠心する。 </li><li>ペレットを乱さないように注意してメディアを、吸引除去する。 </li><li>メディアの10mLに再懸濁します。 </li><li>チャンバースライドの各チャンバーにメディア400μLを加える。 </li><li>各チャンバーに細胞懸濁液5μLを加える。 </li><li> 37℃インキュベーターで一晩増殖℃、5％CO 2で。 </li></ol> 6。サンプルへの病原体のほか<ol><li>チャンバーへの関心のラベルが付いた病原体のピペットで5〜10μlの（手順1〜3から）。 </li><li>アップペッティングでよく混合し、ダウン、付着したマクロファージを乱さないようにチャンバーの底部に触れないように注意してください。 </li></ol> 7。ディスク共焦点顕微鏡を回転にサンプルをロードする（ビデオでは、コンポーネント全体をスキャン） <ol><li>回転するディスク共焦点顕微鏡にすべてのコンポーネントの電源をオンにします。 </li><li> DICイメージングのための顕微鏡を合わせます。 </li><li>インキュベーターからチャンバースライドを削除します。 </li><li>専門的な段階にチャンバースライドを挿入します。 </li><li>チャンバースライド（DICイメージングのために必要）の上部を取り外します。 </li></ol> 8。光トラッピングのための準備が（ビデオでは、コンポーネントをスキャンし、それがどのように顕微鏡に統合されている） <ol><li>光学トラップのためにシャッターをオンにします。 </li><li> IRレーザーをオンにします。 </li><li>光トラップにシャッターを（レーザー）を開きます。 </li><li> IRレーザーの前でシャッターを確認するにはIRカードで確認することで閉じられます。 </li></ol> 9。光トラップによる病原体の選択と操作<ol><li>付着したスライド上にマクロファージに焦点を当てる。 </li><li>マクロファージに隣接する溶液中で自由に変動する病原体を見つける。 </li><li>病原体は、トラップの近くにあるようなステージを移動する。 </li><li>シャッターを開いて、トラップを従事する。 </li><li>固定トラップと接触マクロファージを持って来るためにサンプルを移動するペッドの病原体。 </li><li> DIC、蛍光、またはその両方の組み合わせのいずれかで、ディスク共焦点顕微鏡を回転すると画像。一般的に、トラップはDICで行われ、リアルタイムイメージングは​​、蛍光で行われます。 </li></ol> 10。代表的な結果： in vivoおよび in vitro の環境での病原体とビーズの完全な空間的、時間的なコントロールを発揮するために、我々は、回転するディスク共焦点顕微鏡（図に示す回路図1）に統合された特注のトラップ装置を考案。完全な強さで、レーザーはパワー350 mWを提供し、光学トラップ装置内に様々な光学部品と光をカップリングした後、のようなパワーメータで測定した全反射の目的での電力の約80 mWのは、、トラップを形成するために使用されチャンバーインチトラッピングレーザーと静止閉じ込められたオブジェクトを保持している間に閉じ込められたオブジェクトへの相対的なチャンバー内のオブジェクトを配置するためには、ステージが移動されました。ステージは、捕捉粒子上にドラッグ力が最大トラッピング力を超えないように、ゆっくりと十分な速度で移動させた。 C. albicansの独立した個体群（典型的なサイズ- 〜5μm）を、複数の蛍光チャネルでイメージングを説明するために三色のそれぞれ（AF488、AF568、AF647と、緑、青、に対応すると図中の赤、それぞれ）で標識した同時に光学的に病原体をトラッピングしながら。シングルC.灰色の矢印で示すようにカンジダアルビカンスはさらに混雑した環境でのオペレータによって選択された単一の病原体の特定の場所（図2A）をキャプチャし、操作する能力を示す、、他の酵母のクラスタを通じて、正方形のパターンの中に閉じ込めと移動された。 病原体が示すさまざまな形の形態をトラップするために、このシステムのさらなる柔軟性を説明するために、光ピンセットにもCを保持して位置づけることができたpseudohyphaeとアルビカンス粒子。 C. AF647（赤）で標識されたアルビは、白い矢印で概説し、蛍光GFP - LC3 - RAW細胞（図2B）の隣に置かれたとして軌道に沿って移動されました。 C.の酵母の部分pseudohyphaeが一緒に後塵としてアルビカンスがトラップされました。 また、この特定の細胞株と病原体（図3A）と貪食の絶対的な時間枠を分析するためにRAWマウスのマクロファージ細胞の隣にアスペルギルスフミと位置づけ。一度病原体が細胞に接触する、トラップがオフになっている、とタイムラプスイメージングが（図3B）、その後の細胞事象を観察するために用いられる。光トラップは一次T細胞は、血液から分離し、ビーズ（図4）と免疫学的シナプスを形成するT細胞ために、抗CD3抗体でコートされたビーズに隣接向け、追加を表示するキャプチャするために使用されていました直接免疫細胞をトラップして操作する汎用性。 <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig1.jpg" alt="図1"/> 図1を組み合わせた光学トラップと回転するディスク共焦点顕微鏡のセットアップの概要と回路図。トラッピングビーム（紫）、電子乗算電荷結合素子（EM -明イメージング（オレンジ色）、蛍光励起ビーム（赤）、蛍光発光（緑）、電荷結合素子（CCD）カメラ用の照明のパスを示す計器のレイアウトCCD）カメラ、ダイクロイックミラー（D1とD2）、ミラー（M1とM2）、及びレンズ（L1、L2、L3、L4）。トラップ - 共焦点顕微鏡システムの他のすべてのコンポーネントは、図のラベルが付いています。 <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig2.jpg" alt="図2"/> 図2（A）の蛍光画像は、トラップとCを操作アルビカンス 。他の蛍光標識Cのフィールドに閉じ込められた蛍光標識（のAlexa Fluor ® 488（AF488）、青）の生物アルビカンス （AF568、緑とAF647、赤）。舞台は、灰色の矢印で示されるトラップ、青州の粒子の周りに移動されます。 C.の（B）閉じ込められた疑似菌糸形GFP - LC3 RAW細胞の隣にアルビカンス 。 CAの蛍光標識psuedohyphalフォーム（赤、AF647）光学的にトラップし、GFP - LC3の隣に移動するには、RAWマクロファージを表明した。白い矢印で示すように、CAの生物は、軌道に沿って移動する。 <img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。トラップとAのポジショニング食RAWセルの隣のフミ 。トラップAの（A）明視野像フミ 、のように赤い矢印で示される経路に沿って移動すると位置付け、白い矢印で示されている。トラップされた病原体が少し外側にわずかに焦点面上に生物を押してトラップに起因する焦点のです。A.それは、目的のRAW細胞に隣接して配置されるまで、 フミが移動されます。 （B）インフルエンザA.の食作用のorescenceイメージングRAW細胞からフミ 。トラップされた病原体がRAW細胞の隣に配置された後、食作用のプ​​ロセスが起動されます。 30秒で、RAW細胞の膜は、粒子の周りにコップを変更し、形成するために開始されます。 60秒で、カップが完全に形成される。 90年代から150S、Aにフミが包まれている、と180秒で、粒子が完全に内面化され<img src="/files/ftp_upload/3123/3123fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。抗CD3コーティングしたビーズでシナプスを形成する主要なT細胞をトラップする。一次T細胞のDIC画像は、抗CD3抗体とビーズコーティングの隣に位置する光トラップによる移動。セルは、画像に簡単に識別することができない免疫学的シナプスを形成する。

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利害の衝突は宣言されません。

5μmの - 本研究では、3μmの間の寸法で病原体を捕捉する光トラップを使用してください。私たちの研究室に興味のある病原体は通常、これらの次元を持っていますが、ここで説明した光ピンセットシステムは、サイズの大きい範囲をトラップする柔軟性があります。実際に光トラップは、単一の原子から、直径約10μmの細胞に至るまでの粒子を捕捉するために使用されている。球状​​、楕?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> A.フミ </td><td></td><td></td><td>アルビノ系統、B-5233/RGD12-8、KJクォン-チョン、NIHからの贈り物</td></tr><tr><td> C. albicansの</td><td></td><td></td><td> SSY50 - B変異体、エレフテリオスMylonakis、MGHからの贈り物、SC5314株、ジェラルドフィンクからの贈り物、ホワイトヘッド研究所</td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 488 </td><td>インビトロジェン</td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor ® 647 </td><td>インビトロジェン</td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td>新鮮な血液</td><td></td><td></td><td> RJWヒース、MGH、HMSからの贈り物</td></tr><tr><td>ニコン倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>モデルのTi - E </td></tr><tr><td>トラッピングレーザー、ChromaLase </td><td>ブルースカイリサーチ</td><td> CLAS - 106 - STF02 - 02 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光励起レーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td>モデルイノーバ70C </td></tr><tr><td>トラッピングコンポーネント用のブレッドボード</td><td> Thorlabs </td><td> MB1224、MB1218 </td><td></td></tr><tr><td>光学式エアテーブル</td><td>テクニカルマニュファクチャリング株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペダル制御付電子シャッター</td><td> Uniblitz </td><td></td><td>ヴィンセントアソシエイツ、ロチェスター、ニューヨーク州から購入</td></tr><tr><td>シングルモード光ファイバ</td><td>オズオプティクス</td><td> PMJ - 3S3S - 1064〜6 </td><td></td></tr><tr><td>ファイバーポジショナー</td><td> Thorlabs </td><td> PAF - X - 5 - C </td><td></td></tr><tr><td>ファイバコリメータ</td><td>オズオプティクス</td><td> HPUCO - 23 - 1064 - P - 25℃ </td><td></td></tr><tr><td>望遠鏡用レンズ</td><td> Thorlabs </td><td> AC254 - 150 - B </td><td> 150mmの焦点距離</td></tr><tr><td>翻訳ステージ（X、Y、Z） </td><td>ニューポート</td><td> M - 461 - XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IRダイクロイックミラー</td><td>彩度</td><td> ET750 - SP - 2p8 </td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ（100倍） </td><td>ニコン</td><td></td><td> NA = 1.49、油浸、TIRF客観</td></tr><tr><td>共焦点ヘッド</td><td>横河電機</td><td> CSU - XI </td><td></td></tr><tr><td>偏光板</td><td>ニコン</td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td>ウォラストンプリズム</td><td>ニコン</td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM - CCDカメラ</td><td>浜松市</td><td> C9100 - 13 </td><td></td></tr><tr><td> CCDカメラ（ORCA ER） </td><td>浜松市</td><td> C4742 - 80 - 12AG </td><td></td></tr><tr><td>フィルターホイール</td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td>フィルターホイール</td><td>サター</td><td> LB10 - NWE </td><td></td></tr><tr><td>チェンカバーガラス</td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td>ダイナビーズ</td><td>インビトロジェン</td><td> 111 - 51D </td><td>抗CD3でコーティング</td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン/ギブコ</td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン/ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>インビトロジェン/ギブコ</td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（HyClone） </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

動的な生細胞イメージングでは、免疫システム1、2のセル間のリアルタイムの相互作用の直接可視化することができますが、食細胞と微生物との間の空間的、時間的なコントロールの欠如は、病原体に対する宿主応答の初期相互作用に焦点を当てた観測をレンダリングしている困難。歴史的に、このような貪食3のような細胞間接触のイベントは、2種類の細胞を混合することにより撮像されており、その後継続的に相互作用の適切な段階で偶然細胞間の連絡先を見つけるために視野をスキャン。これらのイベントの確率的性質は、このプロセスは面倒なレンダリング、そしてそれはこのアプローチにより、細胞間接触の初期段階やつかの間のイベントを観察することは困難です。このメソッドはしない接触の危機に瀕しているセルのペアを見つけ、そして彼らは熟達した自分の連絡先まで、それらを観察する、または必要になります。これらの制限に対処するために、我々は、培養中の細胞を配置するために非侵襲的、非破壊的ですが、迅速かつ効果的な方法として、光トラッピングを使用してください。 光トラップ、または光ピンセットは、ますます三次元4で細胞や他のミクロンサイズの粒子を捕捉し、物理的に操作するために生物学的研究に利用されています。輻射圧は、最初の観察、1970年5、6に光ピンセットシステムに適用され、1987年7生物学的標本を制御するために使用されました。それ以来、光ピンセットは、生物学的現象を8月13日の様々なプローブする技術へと成長している。 我々は進歩がとしてによって決定される宿主細胞との相互作用を促進する生理学的環境における病原性微生物の絶妙な空間的、時間的な制御を提供するために、温度と湿度が制御されているディスク共焦点顕微鏡を回転して光トラップを統合することにより、細胞のイメージングを、生きている方法14を記述する演算子。ライブ、免疫低下個体15、16（ 例えば AIDS、化学療法、および臓器移植患者）において潜在的に致命的、侵襲性感染症を引き起こす可能性カンジダおよびアスペルギルスフミガー 、、のような病原体は、光学的に隣接する非破壊レーザーの強度を使用してトラップされ、移動された病原体を貪食することができますマクロファージ、。光と蛍光ベースの動画を送信した高解像度は、生きた細胞の食作用の初期の事象を観察する能力を設立。免疫学の広範な適用性を実証するために、主要なT細胞はまた、トラップされ、in vivoでの抗CD3コーティングされたミクロスフェアとシナプスを形成する操作、およびシナプス形成のタイムラプスイメージングは、得られたれました。免疫細胞を基準にして、ライブの病原体の微細な空間的​​なコントロールを発揮する方法を提供することにより、細胞間相互作用は、細胞への最小限の摂動による蛍光顕微鏡で捉えることができますし、自然免疫と獲得免疫の初期応答に強力な洞察を得ることができる。

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

メソッドは、個別に、選択した操作、および回転するディスクの顕微鏡に結合される光トラップを使用して画像ライブの病原体に記述されています。光トラップは、生物の空間的、時間的な制御を提供し、宿主細胞にそれらが隣接して配置されます。蛍光顕微鏡は、細胞への最小限の摂動で動的な細胞間相互作用をキャプチャします。

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

use-an-optical-trap-for-study-host-pathogen-interactions-for-dynamic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K ビュー.  Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. メソッドは、個別に、選択した操作、および回転するディスクの顕微鏡に結合される光トラップを使用して画像ライブの病原体に記述されています。光トラップは、生物の空間的、時間的な制御を提供し、宿主細胞にそれらが隣接して配置されます。蛍光顕微鏡は、細胞への最小限の摂動で動的な細胞間相互作用をキャプチャします。

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

免疫・感染学

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging techniques require propagation of light through glass, but on glass macrophage fusion is a rare event. This protocol presents the fabrication of several optical-quality glass surfaces where adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons transforms glass into a fusogenic surface. First, preparation of clean glass surfaces as starting material for surface modification is described. Second, a method is provided for the adsorption of compounds containing long-chain hydrocarbons to convert non-fusogenic glass into a fusogenic substrate. Third, this protocol describes fabrication of surface micropatterns that promote a high degree of spatiotemporal control over MGC formation. Finally, fabricating glass bottom dishes is described. Examples of use of this in vitro cell system as a model to study macrophage fusion and MGC formation are shown.

This protocol describes the fabrication of optical-quality glass surfaces adsorbed with compounds containing long-chain hydrocarbons that can be used to monitor macrophage fusion of living specimens and enables super-resolution microscopy of fixed specimens.

マクロファージの融合を研究するための光学的品質ガラス表面を加工

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...