私たちは、原稿の重要な読書のためにグラント博士隅田川に感謝。この作品は、ベックマン若手研究者賞（SY）、ヘルマンファミリー新学部賞（SY）、NIH EUREKA、カリフォルニア州がん研究調整委員会の大学によってサポートされていました。

1。安定細胞株の生成（例：MDCK細胞） <ol><li> p35の皿でコンフルエント80から90パーセントで、細胞をプレート。細胞はトランスフェクション効率を減少させるが100％コンフルエントな単層を形成させてはいけません。 </li><li>リポフェクトアミン2000を用いて目的のプラスミドで細胞をトランスフェクション。製造業者のプロトコルを使用してトランスフェクション条件を最適化する。 </li><li>次の日、二つのP150ペトリ皿に継代細胞。大皿は、安定したコロニーの間に十分な間隔を許可することをお勧めします。 </li><li>翌日、メディアを変更し、各ディッシュにG418 500μg/ mlを加える。 G418の濃度は、個々の細胞株に対して最適化する必要があります。 </li><li>約2週間、一日おきにメディアを変更します。 2週間後、G418耐性コロニーが形成され始めてください、そして肉眼で見えるようになります。 </li><li>倒立蛍光顕微鏡を用いて、GFP陽性コロニーを識別する。シャーピーペンを使ってプレート上にこれらのコロニーをマーク。 </li><li> sへ待機的、組織培養プレートからコロニーをトリプシンメディアを吸引除去し、PBSまたはトリプシン溶液で2回細胞を洗浄。回目の洗浄では、すべてのソリューションを吸引しないでください。乾燥から細胞を防ぐためにプレートの底に液体の薄層を残す。 </li><li>各マークコロニーのために：植民地の縁の周りにできるだけ近づけて拭くために滅菌綿棒を使用してください。これは、細胞コロニーを含むウェットエリアの島を作成します。コロニー上にトリプシンのピペットを10μl。すべてのコロニーのために繰り返して、乾燥を避けるために迅速に進んでください。経験豊かな研究者は通常、P150プレートあたり〜12コロニーを選択することができます。 </li><li> 37プレートをインキュベート℃で5〜10分間、細胞がプレートから切り離し、ラウンド表示されるまで。 </li><li>各コロニーのための：ピペット10コロニー上にトリプシンの添加、そしてプレートから細胞を分離するために数回上下にピペッティング。その後、24ウェルディッシュ内の単一ウェルにコロニーからすべてのセルをピペット。 </li> &lt;LI&gt;安定したコロニーが成長した後、各コロニーのタンパク質発現は、標準的なウェスタンブロットおよび免疫蛍光法を用いて分析される。さらに分析するためにこれらの細胞株を展開します。 </li></ol> 2。最適なコラーゲンの結合（オプション）用ガラスボトムディッシュの表面改質<ol><li>ガラスをsilanizeに、10mmの開口部がそれぞれp35の皿のガラス部分の上に2％3 - アミノプロピルトリメトキシシラン溶液をピペットを300μl。シラン化および架橋回路図については図1を参照してください。 3 - アミノプロピルトリメトキシシランは、ろ過された水で希釈される。 </li><li>室温で1時間インキュベートする。 </li><li> 3 - アミノプロピルトリメトキシシランソリューションを吸引し、10分ごとにフィルタ処理された水で3回洗浄する。 </li><li> ℃で1.5時間の場合は50に設定したホットプレート上で水と場所料理を吸引除去する。皿にその水分が逃げることができるので、少し皿から料理の場所がトップ。 </li><li>熱から皿を取り外し、COOすることができますL. </li><li>ピペット各皿のガラス部分に2％グルタルアルデヒド溶液を300μl。グルタルアルデヒドは、PBSで希釈される。 </li><li> 1時間インキュベートする。 </li><li>グルタルアルデヒド溶液を吸引し、10分ごとに、PBSで3回皿を洗う。 </li><li> 1時間UV光への曝露によって料理を滅菌する。シラン化皿は室温で保存することができます。 </li></ol> 3。トレーサー粒子を3次元コラーゲンゲルの調製<ol><li> 、5分間15,000 rpmで遠心分離器で株式トレーサー粒子（10 10粒子/ ml）100μlをスピンダウンして蛍光トレーサー粒子を洗浄する液体を吸引し、そしてメディアの500μlを加える。 5回を繰り返します。最後の洗浄の後、メディア30μlに粒子を懸濁します。 </li><li>いつものようにGFP発現細胞をトリプシン処理。 </li><li>約2 × 10 6細胞/ mlに再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li>ピペットエッペンドルフチュー​​ブに増殖培地240μlを。 </li><li> 1M Hepesを、ろ過水を20μl、細胞溶液の50μlを、その後、蛍光粒子を10μlの12.6μlを添加する。 </li><li>最後に、ウシ真皮のコラーゲンI溶液（1 mg / mlのワーキング濃度を得るために）167μlを加える。 </li><li>徹底的に溶液を混合して、シラン化ガラスボトムディッシュのガラス部分に溶液80μlをピペットで。 </li><li>場所のインキュベーターに料理とゲルが37℃重合することができます℃で30分間。 P35ガラスボトムディッシュでの典型的なコラーゲンゲルについては、図1Aを参照してください。 </li><li>各ディッシュに慎重に増殖培地2 mlを加え。 </li></ol> 4。タイムラプス画像取得のための手順<ol><li>顕微鏡のエンクロージャの温度制御をオンにし、37℃にスコープ室が定常状態の温度に平衡させライブセルイメージングシステムの例については、図2を参照してください。 </li><li>中性のpHを維持するために、25mMのHEPESを補った新しいメディアにメディアを変更します。のDICイメージングは​​、ガラストップを持っているものと皿の上部を交換する。パラフィルムの薄いストリップを使用して、メディアの蒸発を防ぐために、皿の側面をカバーしています。 </li><li>油浸対物レンズの場合は、客観的に液浸液の一滴を置きます。 </li><li>顕微鏡のステージ上に皿を含むコラーゲンゲルを置き、そして料理が液浸液と接触することを確認してください。 </li><li>サンプルと画像への関心のセルを検索してフォーカス。ステージのドリフトを最小限に抑えるために、皿が長いキャプチャを開始する前に、約45分間静することができます。 </li><li>画像取り込みのパラメータを指定します。変調レーザパワー、露光時間、周波数およびキャプチャ時間の持続時間によって、細胞を損傷する恐れがあるレーザー露光を、最小限に抑えることができます。実パラメータは、顕微鏡システムや細胞の種類によって異なります。 </li><li>タイムラプス収集中に、阻害剤を添加することができる。阻害剤の添加実験では、パラフィルムで皿をシールしないでください。 <ol><li>準備ヘペスが望ましい稼動濃度で薬剤を使用してメディアを補完しています。 </li><li> 、ときにメディアへの薬剤を追加する準備がイメージキャプチャを一時停止し、慎重に料理を乱すことなく、皿の上部を取り外します。 </li><li>皿の中でメディアを吸引除去し、シャーレに培地を含有する薬剤をピペット。その後、皿の上を慎重に置き換えます。 </li><li>サンプルは、新しいメディアの添加によるアウトフォーカス可能性がある、ピントを合わせ直す。 </li><li>キャプチャを再開し、次の30分間キャプチャを監視し、必要に応じてピントを合わせ直す。薬物添加の実験の例については、図4を参照してください。 </li></ol></li></ol> 5。 FRAPの手順と分析<ol><li> FRAPのセットアップは、システム間で異なるため、メーカーの指示に従ってください。 </li><li>生細胞イメージングのためのパラメータを設定します。 </li><li>退色のパラメータを設定します。細胞にダメージを与えることなく、蛍光信号を光退色するのに十分なレーザーパワーを使用してください。これらのパーをテスト練習の細胞でameters。 </li><li>イメージキャプチャを起動し、関心領域を退色する前に画像キャプチャの少なくとも5つのフレームを許可する。 </li><li>キャプチャを続行し、回復時間は完全に蛍光回復をキャプチャするために十分なはずです。 FRAP実験の例については、図5を参照してください。 </li><li> photobleachedエリアの平均蛍光強度（前と光退色後の）時間の経過を測定することにより蛍光回復を分析する。統計解析ソフト（Excelなど）を使用して、指数方程式に回復曲線をフィット：I = I F（1 - E - KT）、私は私fが最終的な強さである、強さ、tは時間であり、τ ½は半分の最終値に達するまでの強度のために要する時間です。τ½ = LN（2）/ kとハーフタイムには、タンパク質の移動度の速度の尺度になります。 </li><li>パラメータは、ハーフタイムや指数関数フィット曲線から最終的な強度を得る。目を計算する初期蛍光強度への最終の比をとることによって、電子の移動割合。 </li></ol> 6。代表的な結果マトリックス内の健康な上皮細胞の生細胞イメージングの例を図3に示されています。不健康な細胞は、しばしば中断膜、及び液胞の過剰な数を持っているのに対し、健康な細胞は、滑らかで、連続的な膜、および明確な核を示す。 3Dマトリックスでは、単一の上皮細胞は、1を移行し、数日間にわたって、上皮細胞は、マトリックス2内に三次元、球形、多細胞嚢胞を形成する。細胞はまた、非常に動的であり、嚢胞（図3）内に移行します。遊走細胞によって及ぼされるトラクション力の結果として行列の変形は、周囲のマトリックス（図4）に埋め込まれたトレーサー粒子の変位によって分析されます。トレーサー粒子の動きが異なるの最大投影像として表示されます。ENTの時点、およびそれぞれの時間の時点（図4B）を示すために擬似色です。また、個々のトレーサ粒子の画像は、時間の経過にトレーサー粒子（図4C）の動きを示すモンタージュとして表示されます。すべての画像解析は、ImageJを使用して行われました。行列の変形のこのような定性的な評価、およびそのための移行細胞によって加えられる力は、牽引力の分布の有用な第一次近似です。 3Dに移行する細胞によって加えられる牽引力の定量的な推定は、このプロトコルの範囲を超えていますし、他の場所で3,4記述されています。 実験を光退色後の典型的な蛍光の回復を図5に示されています。関心領域は、健康で無傷の細胞を維持しながら蛍光強度が目に見えて、バックグラウンドレベル（信号対雑音比を最大にする）に比べて減少するように最適化されたレーザーの設定を使用してphotobleachedする必要があります。最適な設定はb必要があります各FRAPの設定が異なると、電子は経験的に決定する（例えば、FRAP使用してレーザーを走査型共焦点システム）。 ポストFRAPの画像取得の曝露との時間間隔は、慎重にバックグラウンドの光退色を避けるために制御する必要があります。低レーザパワー、短い露光時間、および高感度カメラの使用と高効率光学系の使用は、高品質のFRAPイメージングのために不可欠です。画像取得中に漂白蛍光が大きい場合、このような背景の退色が観察された蛍光強度の回復から定量化し、正規化する必要があります。環境の三次元性のために、蛍光強度の回復のz成分は重要になることがあります。したがって、photobleached地域の事前および事後の3D -スタック像をとることによってphotobleachedボリュームを定義することが重要です。蛍光回復のさらなる分析とモデリングは他の場所で5,6説明しています。 ライブセルイメージングtのユニークな組み合わせechniques：GFP行列の変形、及び阻害剤の添加を監視するために細胞骨格タンパク質、赤色蛍光トレーサー粒子のダイナミクスに従うことは、蛋白質のダイナミクス、牽引力と分子経路の解析のために同時に使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> 図1コラーゲンゲルの調製。ガラスボトムディッシュ上A）重合コラーゲンマトリックス。ゲルのピンクの色は、埋め込まれた蛍光粒子によるものです。 B）ガラスの表面にコラーゲンゲルを架橋するガラスボトムディッシュを治療するための手順。最初に、ガラスボトムディッシュは、3 - アミノプロピルトリメトキシシランソリューション、ガラスにコラーゲンマトリックスを架橋してグルタルアルデヒド溶液で処理される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> 図2。FRAP /共焦点顕微鏡のセットアップの概略図。共焦点顕微鏡はCoolSnap HQ II CCDカメラとツァイスAxioObserverに基づいており、完全にSlidebookソフトウェア（インテリジェントイメージングイノベーション）によって自動化されています。共焦点ユニットは2つのレーザーの切り替えミリ秒を許可するように設計し、横河、回転するディスクユニットCSU10と音響光学的可変フィルター（AOTF）の2つの固体レーザー（50 mWと40 mWのと561 nmの持つ488 nmの）に基づいてカスタムです。エミッションフィルターは、50分の525 nmと60分の620 nmの（＃118661と＃118085、クロマテクノロジー）であり、ダイクロイックミラーは、488から568 BrightLineデュアルバンド（Semrock）です。目的はNA 1.1と0.62ミリメートル、およびNA 1.4と0.19ミリメートルの作動距離を持つ63xプラン-アポクロマート対物の作動距離との組み合わせで最大40倍C -アポクロマート対物長い作動距離です。顕微鏡は、ファイバ光学色素レーザー、コンピューター制御されたビーム位置と強度、および回折限界スポットサイズを励起で構成されてFRAPのphotoablationシステムが含まれています。さらに、顕微鏡が装備されています各軸上0.1ミクロンのリニアエンコーダを含むXY自動ステージ。タイムラプスイメージングの間に、環境温度は、カスタム設計された顕微鏡室とフィードバック温度制御によるヒータ​​ーによって維持されます。あらゆる騒音と振動を分離するには、全体の顕微鏡システムは、振動のないテーブルの上です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> 図3：GFP -アクチンを発現している上皮細胞の細胞イメージングライブ。これらの細胞は三次元コラーゲンマトリックスで培養4日後に嚢胞を形成した。他の人が嚢胞の内部（赤矢印）内に移行する間、一部の細胞は、嚢胞（黄色の矢印）の表面に沿って移動する。スケールバーは10μm、時間単位。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> 図4。牽引力でRho -キナーゼの効果が阻害。 Gを発現して移行するMDCK細胞のA）DIC画像FPは、核マーカーが付けられている。画像は、Rho -キナーゼ阻害薬Y - 27632の治療の直前に撮影された。スケールバーは10μm。 B）Y - 27632の追加による粒子変位を。様々な時点で（0 - 52分）でのパーティクルの位置は、単一の画像上に投影さ、強度の規模に応じて疑似色でした。白い領域は、移行細胞におけるGFP陽性核です。スケールバーは10μm。分単位の時間。 C）のセルの後縁にある粒子の動きは（Bの矢印を参照）。アスタリスクは、Y - 27632を添加する前にキャプチャされた最後のフレームを表します。トレーサー粒子はそれぞれ、Y - 27632の添加前と後に向かって離れての移行細胞の後縁からの移動。スケールバーは1μm。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> 図5三次元マトリックスに細胞の移行を表現するGFP -アクチンのFRAP解析。のA）タイムラプス画像GFP -アクチンは、退色の前後のセルを表現。セルの背面に蓄積されたGFP -アクチンの小さな領域では、タイムポイントは0から（赤矢印）photobleachedいました。秒単位の時間、スケールバーは5μm。 B）photobleached領域（実線）、および蛍光回復（円）の指数関数フィットの平均蛍光強度は時間の経過とともにプロット。蛍光強度は退色する前の初期値に正規化された。

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	<li>Shih, W., Yamada, S., Myosin, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dependent+retrograde+flow+drives+3D+cell+migration.">A dependent retrograde flow drives 3D cell migration.</a> Biophys. J. 98 (8), L29-L31 (2010).</li><li>O'Brien, L. E., Yu, W., Tang, K., Jou, T. S., Zegers, M. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+biochemical+analysis+of+Rac1+in+three-dimensional+epithelial+cell+cultures.">Morphological and biochemical analysis of Rac1 in three-dimensional epithelial cell cultures.</a> Methods Enzymol. 406, 676-691 (2006).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+in+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices.</a> Nat. Methods. 7 (12), 969-971 (2010).</li><li>Del Alamo, J. C., Meili, R., Alonso-Latorre, B., Rodriguez-Rodriguez, J., Aliseda, A., Firtel, R. A., Lasheras, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+analysis+of+eurkaryotic+cell+motility+by+improved+force+cytometry.">Spatio-temporal analysis of eurkaryotic cell motility by improved force cytometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (33), 13343-13348 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li><li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+approaches+to+in+vivo+imaging.">Kinetic modeling approaches to in vivo imaging.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (12), 898-907 (2001).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">Fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、三次元マトリックスに細胞移動のメカニズムを研究するために生きた細胞のイメージングを使用するための方法を説明します。この手法の成功は、安定的にGFPタグ融合タンパク質を発現している&quot;良い&quot;のクローンを得ることに依存する。 GFPタンパク質の低レベルが高すぎるGFPのレベルは、セル上で望ましくない副作用を持っているが、細胞の健康を損なう過剰な励起の露出...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>コラーゲンは、ウシ、タイプI </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354231 </td><td>株価は3 mg / mlの約</td></tr><tr><td> 3 - アミノプロピルトリメトキシシラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 281778 </td><td>水で薄める</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 340855 </td><td> PBSで希釈し</td></tr><tr><td> 1M Hepes緩衝</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheresのポリスチレン微小球を1μm、赤色蛍光（605分の580） </td><td>インビトロジェン</td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td>ジェネティシン（G418） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11811-031 </td><td></td></TR&gt; <tr><td colspan="4"> 文化メディアコンポーネント： </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

伝統的に、細胞の遊走は、二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。しかし、このような創傷治癒、組織再生、および癌の転移などの重要な生物学的プロセスの間に、細胞は複雑な、三次元細胞組織をナビゲートする必要があります。よりよいこれらの生物学的プロセスの背後にあるメカニズムを理解するには、細胞移動を駆動するための責任蛋白質の役割を調べることが重要です。ここで、我々は、上皮細胞株を（MDCK）を使用して細胞移動のメカニズムを研究するためのプロトコルの概要を説明し、モデルシステムとして、三次元、繊維、自己重合行列。この光学的に透明な細胞外マトリックスは、生細胞イメージング研究に容易に適していると良いの生理的、軟組織の環境を模倣しています。このレポートは、直接タンパク質の局在や動態を可視化するためのテクニック、そして周囲の三次元マトリックスの変形を示しています。 試験細胞プロセス中のタンパク質の局在とダイナミクスの追うものは、タンパク質の機能に重要な洞察を提供します。遺伝的に符号化された蛍光標識は、タンパク質の局在や動態を観察するためのユニークな方法を提供する。このテクニックを使用して、我々は、マトリックスを介して細胞の操縦に、リアルタイムで細胞骨格成分の力が、生成、鍵の細胞内蓄積を分析することができます。さらに、波長の異なる複数の蛍光タグを用いて、我々はこのように私たちは別のタンパク質が類似または発散の役割を持っているかどうか、例えば、テストすることが、同時に複数のタンパク質の局在を調べることができます。さらに、蛍光標識タンパク質のダイナミクスは（FRAP）解析を光退色後蛍光回復を使用して定量することができる。この測定アッセイ蛋白質の機動性とどのように安定的に結合したタンパク質は細胞骨格ネットワークになる。 タンパク質機能阻害剤の治療でライブセルイメージングを組み合わせることで、我々は、タンパク質と移行する細胞の形態の分布のリアルタイムの変化で調べることができます。さらに、我々はまた、細胞移動中に行列の変形を可視化するマトリックス内に埋め込まれた蛍光トレーサー粒子の使用による生きた細胞のイメージングを組み合わせる。従って、我々は移行細胞が力を生み出すタンパク質の配布方法可視化することができます、そしてどこに牽引力が周囲のマトリックスに発揮されています。これらの技術を通じ、我々は、特定のタンパク質と細胞移動のメカニズムへの貢献の役割に貴重な洞察を得ることができます。

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K ビュー.  University of California, Davis. このような細胞遊走などの細胞プロセスは伝統的に二次元、硬いプラスチックの表面に研究されている。このレポートは、直接タンパク質の局在を可視化し、より生理学的に関連する、三次元マトリックスに移行する細胞で蛋白質のダイナミクスを分析するためのテクニックを説明します。

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

導電性インクの平面および三次元印刷

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

ディープティシュ人間血管造影および機能前臨床研究のためのユニバーサルハンドヘルド三次元光音響イメージングプローブリアルタイムで

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

マトリックス修飾により誘導される細胞接着及び脱接着におけるリアルタイムの変化を測定するために、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングを使用して、

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

メカニカルストレッチ中のライブセルイメージング

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...