小腸粘膜の生体内顕微鏡検査は、異なる免疫細胞タイプ間、またはこれら2つの区画間の上皮内の細胞相互作用の時空間的ダイナミクスに関する洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、腸粘膜内の高速かつ高解像度の画像をリアルタイムで取得できることです。腸のライブイメージングは、細胞相互作用、または粘膜免疫、上皮生物学または癌生物学に関与する細胞シグナル伝達に関するさらなる洞察を提供することができる。
これは、外科的技術の練習だけでなく、画像取得のためのマウスの忍耐と最適な位置を必要とする挑戦的な方法です。麻酔付きトランスジェニックマウスにおけるつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、強化された緑色蛍光タンパク質、またはEGFP、Γ-delta T細胞受容体を発現し、結核注射器を使用して、新たに調製したHoechst 33342 Dye Solutionをレトロオービタル静脈静脈静脈内にゆっくりと200マイクロリットル注入する。注射の1~2分後、動物の目に軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。
次に、下腹部の正中線に沿って皮膚と腹膜を通して2CM垂直切開を行い、角度付き鉗子を使用して腹腔からcaecumを慎重に引き出します。最小の便内容を含む小腸の2〜3CM領域を特定し、腸間膜血管を引き裂かないように注意し、慎重にcaecumと残りの小腸を腹腔に戻し、関心のあるセグメントを外部化したままにします。血管間の下線の腸間の両側に2組の鉗子を置き、鉗子の先端をそっとこすり、膜に穴を開ける。
5CM縫合糸に付けられた斜めの鉗子と湾曲したテーパーポイント針を使用して、膜内の穴を通って腹膜の片側を貫通し、腹膜裏地の反対側を通り抜け、1つの縫合線を上部に配置し、切開の底付近に切開を入れ、腸管のループを外部化したまま切開を閉じる。成功の可能性を高めるために、腹部縫合糸を配置しながら血管を縛ったり引き裂いたりせず、腸の余分な取り扱いを制限してください。次に、腸ループの下の皮膚を同様に閉じ、下線腹骨の前の縫合糸間の切開の途中に1つの縫合糸を配置する。
電気焼灼器を使用して、前腸間縁に沿って穿穿のラインを作り、すぐに追加の熱誘発組織の損傷を防ぐために腸の表面に水の数滴を適用します。残りの水を取り除くためにキムワイプでブロット。vannaはさみを使用して、焼灼された組織の遠位エッジで、焼灼線の長さに沿って、外付された組織セグメントの近位端に向かって約1.5CMの水平スリットを切断します。
粘膜表面が露出したら、組織を水分補給するために湿ったキムワイプで腹部を覆います。スピニングディスク共焦点顕微鏡イメージングの場合、マウスを覆われた容器内の顕微鏡に搬送します。イメージングソフトウェアを起動し、顕微鏡の頭を後ろに傾け、1マイクロモルノミアレクサフルオール染料とハンクの緩衝生理食塩水を150マイクロリットルのグラスカバーの滑った底に加えます。
開いた粘膜表面がカバースリップに直接接触するようにマウスを置きます。マウスと皿を事前に温めたインキュベーターのイメージングステージに置きます。各レーザーの励起強度と露出時間をそれぞれ10~15ミリワット以下、120~150ミリ秒以下に設定し、フレーム平均を2に調整します。
電子乗算ゲイン機能をオンにしてバックグラウンドノイズを低減し、63倍の目的キャリブレーションを選択してピクセルサイズを正しく測定します。405ナノメートルレーザーと20X空気の目的を使用して、手動で核を視覚化して、目立つ動きやドリフトを欠く絨毛のフィールドを見つけ、呼吸、蠕動または心拍による実際の動きの領域を避けます。X-Yスキャンを用いて、対象分野のX-Y座標を記録し、グリセロール浸漬63X目的に切り替える。
405ナノメートルのチャンネルで最大1分間ライブ画像を取得し、選択したフィールドの絨毛が安定していることを確認し、焦点を調整してビラス先端のすぐ下に直交する面を見つけます。その後、1.5マイクロメートルのステップを使用して、核を解決することが困難になるまで、約15〜20マイクロメートル下のvillus先端上皮のすぐ下から始まるzスタックを取得します。取得開始から3~5分後、画像安定性とガンマデルタ上皮内細胞運動性を確認し、絨毛の各フィールドについて30〜60分間画像を取得し続けます。
ガンマデルタ上皮内リンパ球は、地下膜に沿って、研究状態で横間空間に移動することによって上皮をパトロールする動的な監視行動を示す。これらの代表的な画像では、色付きのトラックは、30分間にわたって個々のガンマデルタ上皮内リンパ球の回遊経路を示す。抗インターロイキン-2受容体β抗体で治療したマウスでは細胞間間空間における上皮内リンパ球の頻度は増加したが、これらのガンマδ上皮リンパ球の30%以上がアイドリング挙動を示した。
このアイドリング表現型は、対照に対するインターロイキン-2受容体遮断に続くガンマ-デルタ上皮リンパ球の瞬間速度および閉じ込め比の両方の有意な減少によって確認された。さらに、アイドルガンマデルタ上皮内リンパ球は、より長い住空間を持ち、また、モチルガンマデルタ上皮内リンパ球と比較して、より頻繁に細胞間空間内に局在していた。蠕動による過度の動きを欠く絨毛の畑を特定することは困難である。
マウスの位置を変更すると、より安定したフィールドを見つけるのに役立ちます。細胞追跡データのさらなる分析は、特定の運動行動を特定したり、細胞間相互作用を測定するための追加の指標を提供するのに役立つ可能性があります。IEL-運動性のインビタルイメージングと分析は、IEL機能の標準的な読み取り出しとなっており、自然免疫シグナル伝達がガンマデルタIEL機能をどのように調節するかの洞察を提供しています。
