LWEとRKは健康補助R37 NS033506-16とR01 NS060699-03の米国の国立研究所によってサポートされています。 MPTは、アメリカ癌協会ポスドク研究フェローシップ（PF-10から057-01-MPC）によってサポートされていました。博士マシュー·ライマン博士とオレンKobilerのアドバイスや知識は、顕微鏡の構成と生細胞イメージング法を設計に尽力しました。また、顕微鏡の取得、インストール、およびパフォーマンスの彼らの技術支援のためにニール·バーロウとニコンインスツルメンツ社のブライアン·T·ケインのおかげで拡張します。

セクション1 - ライブセル蛍光顕微鏡のための環境制御条件<ol><li>任意のイメージング実験前に30分接続し、顕微鏡ステージトップインキュベーターを温め始める。 <ol><li>顕微鏡、透過および落射蛍光光源、および自動化されたハードウェアコントロールをオンにします。顕微鏡に接続し、EM-CCDカメラの冷却を開始する顕微鏡制御ソフトウェア、NISの要素を開く。 </li><li>適切な目標（どちら60Xまたは100X油浸）に暖かいレンズを取り付け注：実験の種類に基づいて対物レンズを選択します。 60X相目的は順行性の広がりを可視化するために適している間100X微分干渉コントラスト（DIC）は、順行性輸送ビリオンアセンブリの追跡のために最適です。彼らはサンプルに直接接触しないように低倍率、非油浸対物レンズは、レンズが暖かい必要としません。 </li><li>マイルの電動ステージ上にステージ天インキュベーターを取り付け<html> croscope。サンプルが所定の位置にある保持する適切な挿入を確認してください。インキュベーターコントロールからステージトップインキュベーターの入力ポートに加湿空気ラインを取り付けます。 </li><li>インキュベーターとレンズ暖かいコントロールをオンにして、撮像されている客観的サンプルの特定以前に検証条件に温度設定を調整（説明を参照してください）​​。 </li><li>トップインキュベーターを上演するためにCO 2補足空気を提供するために、5％CO 2/95％大気のタンクに制御バルブを開きます。流量は毎分ガスの60〜80ミリリットルであるべきである。速い速度は、加湿チャンバーにもかかわらず、大規模なサンプルの脱水になります。 </li></ol></li><li>対物レンズにレンズオイルを追加し、すぐにステージ天インキュベーターに結像される文化を配置。 </li><li> 10分の最低文化の中での温度の平衡を許可します。一時間は、特に第3章で述べた一晩イメージングのため、好ましい。 </li></ol>ve_title &quot;&gt;セクション2 - 順行ビリオントランスポートイベントプロトコルのリアルタイムイメージング<ol><li> 6〜8時間前のイメージングに、テイラーらに記載された方法を使用して興味のあるウイルスの1×10 6プラーク形成単位を持つ成熟した、解離SCGニューロンの35ミリメートルカバースリップボトムディッシュ（例：ウイルスについては、表1を参照）感染ら 2012A 11。複数のウイルスをテストする場合は、30〜60分間でオフセット接種は、同様の回感染後に、順次サンプルのイメージングを可能にするために。 </li><li>どんな実験を実行する前に、10分の最低限の舞台トップインキュベーターに皿を挿入します。温度が平衡しながら、焦点面がシフトしていると否定的に任意のイメージング実験に影響を与えます。 </li><li>透過光、顕微鏡の接眼レンズを使用して、はっきりと分離された軸索の拡張子を持つ神経細胞体を見つける。また、検出を発現する細胞を見つけることが、適切な蛍光照明を使用蛍光タンパク質の表の金額。それがために、光誘起される細胞の損傷のと蛍光タンパク質の漂白、このステップとその後のステップで、蛍光灯照明にサンプルの露出を制限することが重要である。 </li><li>細胞が暴露される励起光の強度を低減する蛍光照明を減衰させる。蛍光照明光路中の中性密度（ND）フィルターを減衰させる光を従事。 1分よりも長く持続するムービーでは、ND4の最小は、光漂白蛍光タンパク質と軸索の光損傷広範囲を防ぐために使用しなければなりません。高い蛍光の構造は、一般的な場所にND8フィルターで可視化することができます。 </li><li>顕微鏡ソフトウェア（ 図2及び補足作品1A）を使用して、EM-CCDカメラへの光路を切り替える。 </li><li>各蛍光チャネルに最適な画像処理時間と条件を決定する。 <ol><li> &quot;プレイ&quot;ボタンを使用したライブ画像ウィンドウを開始します&lt;/李&gt; <li>各蛍光タンパク質のための最適なカメラの露出設定を決定します。高速移動ビリオン構造の運動収差が発生するようにチャネルあたり300ミリ秒を超えないようにしてください。 （メーカーが最大利得を示唆）、露光時間を短縮し、薄暗い信号の検出を強化するために300の設定にカメラのEMゲインを利用する。適正露出時間は、低いバックグラウンド強度の高い特定の信号で画像を生成する必要があります。 </li></ol></li><li>エクスポージャーを設定し、軸索の明確に定義された領域を発見した後、ソフトウェアは、自動画像取得を実行するように構成されなければならない。漂白サンプルを防ぐために、ライブイメージングウィンドウを停止します。 <ol><li> NISの要素ソフトウェアで、6Dを選択-定義/ダウンメニュー&quot;アプリケーション&quot;ドロップダウンから実験アプリケーションを実行します。 </li><li> ND取得ウィンドウで、画像取得の頻度を決定するであろう時間]タブをクリックします。 &quot;遅延なし&quot;と時間5分にする間隔を設定します。木曜日電子ソフトウェアは、5分間の間、可能な限り高い周波数で画像フレームを取得する。 </li><li>複数の蛍光画像取得のために使用され、あらかじめ設定ハードウェア構成の選択を可能にする &quot;ラムダ&quot;のタブを選択します。最初のボックスをクリックし、メニューダウン続くドロップ適切なハードウェア構成を選択する。撮像されるすべての蛍光タンパク質について、この手順を繰り返します。 </li><li> &quot;XY体位&quot;、 &quot;Zシリーズ&quot;と &quot;大画像&quot;のタブが非選択であることを確認してください。 </li><li>タブの上に、マークされたボックスが自動的に取得中にハードディスクに画像を保存するには、 &quot;ファイルに保存&quot;を選択します。実験出力ファイルの場所とファイル名を設定する。シーケンシャルな実験が行われたように、ソフトウェアは、指定されたファイル名の末尾に連番が追加されます。 </li><li>一度にすべてのタブが選択されています。 &quot;実行今&quot;ボタンをクリックして実験を開始します。 </li><li>露出設定を介して画像取得速度を最適化し、IMAGEサイズ。イメージ可能領域の小さな領域を使用すると、多くの場合、フレーム取得率をスピードアップします。 25％、総画像面積の50％との間の領域を選択して、NIS-ElementsでROIツールを使用して、関心領域を定義する。あるいは、より短い露光時間がフレーム取得速度を増加させるが、信号の品質を低下させる（議論を参照）になる。 </li></ol></li></ol>セクション3 - 順行スプレッドイベントの晩タイムラプスイメージング<ol><li>イメージングの前に四時間は、35ミリメートルμ-ディッシュ上に構築区画神経文化に感染。テイラーらに記載された方法を使用して（たとえば、ウイルスについては、表1を参照）興味のあるウイルスの1×10 6プラーク形成単位と神経細胞体を接種する。2012B 12。 </li><li>ゆっくりステージトップインキュベーターに培養皿を置きます。目的の位置が皿の側に設定されていることを確認。ゆっくり焦点、ensurに目的を持って目的をINGは、サンプルに押し上げていません。フォーカスフィールドが識別されると、徐々に軸索コンパートメントの内部側に境界を定める内部障壁の近傍に、皿の中心に対物レンズを移動させる。移動中に、焦点深度が維持されていることを確認し、試料中に押し上げ避ける。目的によってプラスチック表面のたわみは、軸索とプラスチックが破損します。 </li><li>暖かいの約2 mlを加え（〜37°C）、リン酸はテフロンリングの外で培養皿に緩衝生理食塩水。これは、サンプル脱水を最小限に抑え、断熱を提供するために、PBSのリングと神経細胞培養物を取り囲んでいる。 </li><li>温度が自動化された画像取得（3.8）を開始する前に1時間の最小平衡化することができます。 3.7〜ステップ3.5は、この期間中に設定することができます。 </li><li>すべてのNDフィルターを係合することにより、可能な限り低いレベルに照明の強度を制限します。これは、頻繁な画像取得がオベできるようになります過度の光損傷せずにrを長期間。照明を減らすことは（説明を参照してください）​​より長い露光を必要とする、低信号になります。 </li><li>歴史的な露出設定を使用するか、前に実験のセットアップ2.5節で説明したように露出設定を確立するために、ターゲットの蛍光タンパク質を発現する感染上皮細胞のパラレルディッシュを生成します。 </li><li>必要なチャネルに対してエクスポージャーを設定した後に、自動化された画像取得用のソフトウェアを構成するための時間である。漂白サンプルを制限するために、ライブイメージングウィンドウを停止します。 <ol><li>要素ソフトウェア（ 図2および補足映画の2）において、6Dを選択- ND集録ウィンドウを表示するためにダウン&quot;アプリケーション&quot;ドロップダウンメニューから実験アプリケーションを定義/実行します。 </li><li> ND取得]ウィンドウで、[時間]タブをクリックします。 &quot;5分&quot;の間隔を設定します。 20時間の時間を設定します。ループフィールドが自動的にPROGRA繰り返し数について計算されるmは、実行されます。 </li><li> &quot;ラムダ&quot;タブを選択します。最初のボックスをクリックし、メニューダウン続くドロップ位相コントラストのための適切なラムダ構成を選択します。撮像される各蛍光タンパク質の適切な設定を選択すると、その後のポジションのために繰り返します。 </li><li>ビューの単一のより大きなフィールドに結合される複数の画像のパラメータを決定する &quot;大画像&quot;タブを選択します。良いサイズの面積は7％ステッチのオーバーラップを使用して5×2の画像で構成されています。これは、画像取得の周波数に影響を与えずに撮像される位置当たりのセル数の最大値を可能にする。また、 &quot;ステージ移動中に閉じるアクティブシャッター&quot;のチェックボックスを選択解除します。このオプションでは、画像間のシャッターを閉じていないことで買収の速度を向上させます。 </li><li>順次一夜映画の過程で並行して画像化される複数の位置を識別するために、 &quot;XY体位&quot;タブを選択します。中心Poを定義する位置を選択してくださいそれぞれの大きな画像領域のint型。試料中に6-8画像位置を選択します。良好な画像領域は、明確に定義された軸索に近い並置内のセルの小さなクラスターを有する。細胞は最小化されるべきで互いに軸索同梱の上に積まれてはいけません。ピント位置は、細胞の核である。明確に定義された核膜は細胞の大多数のために見られるような目標を置きます。 </li><li> &quot;Zシリーズ&quot;のタブの選択が解除されていることを確認。 </li><li>セクション2.6.5に上記のような自動保存機能を設定します。 </li><li> &quot;1時間のループ&quot;をクリックすることで、露出や位置の設定をテストします。透過光照明、フォーカス、フレーミングの結果の画像を評価します。焦点がずれている場合は、XY]タブの下に、それぞれのポジションにフォーカスをリセットします。 10分待って、フォーカスが安定するまで、この手順を繰り返します。 </li><li>すべての設定が検証され、テストされた後、 &quot;今すぐ実行&quot;ボタンをクリックすることで、自動化された実験を開始する。 </li></ol></lI&gt; </ol>セクション4 - 画像処理とエクスポートデータのエクスポート<ol><li>輸送やスプレッドのイベントのライブセルイメージングの間に得られたデータセットは、プレゼンテーションや出版物（補足ムービープレビュー3）後で使用するために一般的に使用されるフ​​ァイルタイプにNISの要素ソフトウェアからエクスポートする必要があります。エクスポートするには映画はNISの要素に適切なRAW。ND2ファイルを開いて、目的の蛍光チャンネルを視覚化する &quot;スプリット·コンポーネント&quot;ビューを選択します。適切な速度で再生ファイル;毎秒5フレームは、高速輸送の可視化のための良い出発点です。 </li><li>動画再生中にリアルタイムクロックを表現するためにタイムスタンプが含まれています。画像を右クリックして、選択して、ND-情報を追加します。デジタルカウンターは、左上隅に表示されます。 <ol><li>情報を表示するには、タイムスタンプを編集します。右カウンターの上にクリックし、[Edit] ND-情報を選択します。その後のポップアップウィンドウで、イマジを反映するためにテキストを編集重要なパラメータはNG。わかりやすくするためにフォント、色、サイズを編集します。 </li></ol></li><li> &quot;編集​​&quot;メニューに移動し、 &quot;ビューのスナップショットを作成します&quot;または &quot;X&quot;キーを押して見つける。このコマンドは、 &quot;ビューのスナップショット&quot;ウィンドウが開きます。 8ビットを生成するために、RGB、ムービー全体からの蛍光チャンネルを含むエクスポート対応ファイル &quot;すべてのフレームに適用&quot;を選択します。 </li><li>クロスプラットフォーム互換性のために。aviファイルとして保存します。フレームあたり200ミリ秒で、再生速度を設定します。 NISの要素によって生成された。aviファイルは、その後、さらに目的のファイルの種類に他の変換ソフトで圧縮することができます。 </li></ol>

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我々は、開示することは何もありません。

彼らは観察の行為によって重大な変更を加えること無く発生したライブセルイメージングの目的は、生物学的プロセスを観察している。環境制御、撮像速度、および蛍光照明：この目的は、3つの変数を最適化することによって達成される。これらの相互依存変数が実行可能な撮影条件を達成するためにバランスをとらなければなりません。提示プロトコルは、代表的な結果を生成するために...

alphaherpesなどの単純ヘルペスウイルスなどのウイルス（HSV）-1、-2、および仮性狂犬病ウイルスによる末梢神経系（PNS）の感染（PRV）ウイルスのライフサイクル全体を通じて、いくつかの複雑かつ高度に規制の手順が必要。 PNSの神経細胞内の輸送は、プライマリウイルス感染とその後のホスト間の広がりの両方のイベント中に、非常に重要です。ウイルスのライフサイクルの二つの成分を調節する分子機構、感受性細胞へ離れて軸索内の細胞体（順行性輸送）からのウイルスアセンブリの監督輸送とビリオンのその後の送信（順行スプレッド）はヘルペスウイルスの病因を理解する上で重要です。 神経細胞におけるウイルス粒子の輸送と出口は、成熟感染性ビリオン1,2のアセンブリに依存しています。免疫蛍光法（IF）および電子顕微鏡（EM）を含む予め固定されたアッセイは、粒子の組立て状態とprotのを研究するために使用されたビリオン輸送と広がり3-6関連付けられたEINの相互作用。しかし輸送ビリオンおよび化学固定によって導入された実験的な成果物の動的な性質は、固定された画像7,8の解釈を混同。最近、ウイルスの蛍光融合タンパク質の数は、タンパク質の機能にほとんど影響を与えるHSVおよびPRVについて記載されている。キャプシド、被包、および糖タンパク質9-11：緑色蛍光タンパク質（GFP）及びレッド蛍光タンパク質（mCherryまたはmRFPを）フルオロフォアは、しばしば、成熟ビリオンの3つの構造構成要素のうちの2つの撮像を可能にするように対になっている。二重標識ウイルスを用いた順行性輸送の生細胞イメージングは​​輸送中のウイルス粒子の組立て状態を可視化する。ウイルス株を発現する同様の蛍光体は、数および拡散12,13に続くウイルスゲノムの多様性を可視化するために使用される。蛍光タンパク質の特性は（14,15で検討）が大きく影響しウイルスまたは細胞のアセンブリを視覚化する能力。野生型の機能性の保全のための新規なタンパク質融合を設計し、テストするときに、自己相互作用と安定性を含む蛍光タンパク質、、の本質的な特性を考慮する必要があります。 蛍光タンパク質融合と組み合わせて、二人はインビトロでの細胞培養系において十分に特徴付けヘルペスウイルス感染の生細胞のイメージングのために使用される（ 図1A）16解離し、17区画ラット上頸神経節（SCG）ニューロン。両方のシステムでは、胚のSCGのは、単一の細胞体への解離、解剖され、in vitroで培養する18のためにメッキ。 SCGニューロンは、自律神経系の一部であり、容易に成熟した偏光状態を ex vivoで培養し、神経細胞への成長因子（NGF）によって区別することができる。解離SCGニューロンは、Fを可能に軸索の拡張されたネットワークを形成彼らは順行性輸送6を受けるようにウイルス粒子のか視覚化。区分SCG文化が神経細胞体（S区画）および遠位軸索末端（Nコンパートメント）19の流体分離を提供。原稿20又は変性Campenotチャンバ17を用いて区画ニューロンの構造及び使用のための詳細なプロトコルの数は、以前に公表されている。流体分離は、神経細胞体と孤立軸索末端への輸送後の子孫ビリオンの検出を選択的に感染することができます。感染前末端上の上皮細胞をメッキするとウイルス感染の広がりのためにレシピエント細胞を提供する。 そこにすべてのライブセルイメージング実験のための重要な多くの重要な要素がありますが、我々のプロトコルに最も関連性があります：自動画像取得、蛍光灯照明、画像処理の速度、および環境制御。すべてのイメージング実験のために、我々が使用する反転、自動化され、落射蛍光照明顕微鏡（ 図1B）。顕微鏡はニコンエクリプスTiの基盤を中心に構築され、急速に再構成する自動画像取得中に顕微鏡を、コンピュータ制御電動システムの数を採用しています。蛍光照明のために、我々は、照明経路に沿って中性密度フィルタを減衰させることができる広域スペクトル水銀アークランプを使用する。励起フィルタは、蛍光照明のスペクトルを制限し、マルチパスダイクロイックミラーと蛍光発光フィルター特定の蛍光化合物を可視化と組み合わせた場合。励起および発光フィルターが異なる蛍光チャネルの急速順次取得を可能にするために独立した、高速スイッチングフィルターホイールに取り付けられている。画像取得速度が低い強度信号と短い画像の検出のための読み取り時間を有用な、高感度かつ高速のEM-CCDカメラではさらに向上する。 microsc上の環境制御OPEをインキュベーター加熱ステージ上と加湿CO 2に富んだ雰囲気をインキュベーターに渡されながら高温で試料を保持する対物レンズヒーターで達成される。顕微鏡は近い25までのすべての窓に遮光カーテンで最小化℃、外光を維持し、周囲温度と暗い部屋に保管されています。以下のプロトコルでは、順行性輸送及び拡散アッセイのための本システムの使用を記載している。 選択肢の数は、ライブセルイメージングの変数をコントロールするために存在します。顕微鏡の制御設定は、手動またはプロプライエタリ·ソフトウェアに依存して自動化システムを介して行うことができる。蛍光照明は、ハロゲン、LEDまたはレーザーソースで実現することができる。イメージング速度は、フィルタ切り替えの速度および一対の検出系と信号を可視化する時間によって修正される。環境制御は、マイルに専用のハードウェアで実現することができますcroscopeステージ全部または加熱および加湿ボックスで顕微鏡の一部、または顕微鏡検査が実行される部屋の温度を上げることによってのエンクロージャ。これらの選択肢の各々は、コストおよびパフォーマンスに関連する利点と欠点を有する。 その後のプロトコルでは、我々は詳細換えウイルス株を使用することにより迅速な順行性輸送とalphaherpesウイルスの順行広がりを研究するライブセルイメージングを使用すること。リアルタイムのライブセルイメージングは軸索11内輸送を受けて動的構造体上のカプシド、被包、および/ ​​または糖タンパク質の共局在を可視化する。区分ニューロン培養の一夜タイムラプスイメージングは、感受性細胞の軸索のビリオン出口と感染12を可視化する。ここで提示プロトコルは、我々の特定のイメージング·システムと共に使用するために最適化されているが、生細胞のイメージングの四つの要素に対して大まかに示されている。議論では、私たち更に詳細は成功実験のために必要である最適化のいくつかの意志。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm glass bottom culture dish</td>
 <td>MatTek Corporation; Ashland, MA </td>
 <td>P35G-1.5-20-C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm &mu;-Dish </td>
 <td>Ibidi USA LLC, Verona, WI </td>
 <td>81156</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope body </td>
 <td>Nikon Instruments Inc. </td>
 <td>Nikon Eclipse Ti</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized microscope X-Y stage</td>
 <td>Prior Scientific; Rockland, MA </td>
 <td>H117 ProScan Flat Top</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized filter wheels</td>
 <td>Prior Scientific</td>
 <td>HF110 10 position filter wheel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent illumination source </td>
 <td>Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada </td>
 <td>X-Cite 120Q </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multi-band Fluorescence filter sets</td>
 <td>Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT</td>
 <td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor Technology USA; South Windsor, CT</td>
 <td>iXon3 897 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chamlide stage top environmental incubator</td>
 <td>Live Cell Instruments; Seoul, South Korea</td>
 <td>TC-L-10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objective lens heater</td>
 <td>Bioptecs; Butler, PA</td>
 <td>150803 Controller 150819-12-08 Heater</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Analysis software</td>
 <td>Nikon Instruments Inc.; Melville, NY</td>
 <td>NIS Elements </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live cell imaging of alphaherpes virus anterograde transport and spread

生細胞の蛍光顕微鏡技術と同様に、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株の構築の進歩は、輸送およびニューロンのalphaherpesウイルス感染の広がりのリアルタイム可視化を有効にしている。ライブセルイメージングと一緒にウイルス膜、被包、およびキャプシドに新規蛍光融合タンパク質の有用性は、軸索内輸送を受けてウイルス粒子アセンブリを同定した。同様のツールが正常細胞との間で送信さビリオンの数と多様性を定量化するウイルス粒子の広がり細胞 - 細胞の分析に用いられてきた。重要なのは、順行性輸送と普及のライブセルイメージングの技術は、粒子輸送速度、粒子の分布、およびタンパク質の局在の時間的分析を含む豊富な情報を生成します。古典的なウイルスの遺伝子技術と並んで、これらの方法論は、重要な洞察を提供してきた重要な機械論的な質問へ。この記事では、詳細にalphaherpesウイルス輸送と広がりの基本的な質問に答えるために開発された撮像法について説明します。

順行性輸送 PRV 348と解離SCG文化の感染症にこのプロトコルのアプリケーションでは、GFP-US9とGM-mCherry膜融合タンパク質を発現する組換えPRV株は、ビリオンの順行性輸送（ 図3及び補足作品4）の可視化を促進してきた。涙点を輸送する上でそれらの検出でウイルス粒子の結果、および前述の撮像条件にこれらの融合タンパク質の取り込みは、フィルタ?...

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Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

alphaherpesウイルス感染のライブセルイメージングに向け輸送と細胞間スプレッドの動的事象の分析を可能にします。ここでは、一次ニューロンのウイルス感染中にアセンブリの可視化を容易にするために、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株を利用する手法を提案する。

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

live-cell-imaging-alphaherpes-virus-anterograde-transport

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.0K ビュー.  Montana State University. alphaherpesウイルス感染のライブセルイメージングに向け輸送と細胞間スプレッドの動的事象の分析を可能にします。ここでは、一次ニューロンのウイルス感染中にアセンブリの可視化を容易にするために、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株を利用する手法を提案する。

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

免疫・感染学

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung injury (ALI)/acute respiratory distress syndrome (ARDS) and other respiratory pathologies in vivo is difficult due to the limited accessibility and inherent motion artifacts of the lungs. Nonetheless, various approaches have been developed to overcome these challenges. This protocol describes a method for intravital fluorescence microscopy to study real-time leukocyte-endothelial interactions in the pulmonary microcirculation in an experimental model of ALI. An in vivo lung imaging system and 3-D printed intravital microscopy platform are used to secure the anesthetized mouse and stabilize the lung while minimizing confounding lung injury. Following preparation, widefield fluorescence microscopy is used to study leukocyte adhesion, leukocyte rolling, and capillary function. While the protocol presented here focuses on imaging in an acute model of inflammatory lung disease, it may also be adapted to study other pathological and physiological processes in the lung.

Intravital fluorescence microscopy can be utilized to study leukocyte-endothelial interactions and capillary perfusion in real-time. This protocol describes methods to image and quantify these parameters in the pulmonary microcirculation using a vacuum-stabilized lung imaging system.

真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

マウス顎下腺再生のリアルタイムライブイメージング

Interrogating Cell-Cell Interactions in the Salivary Gland via Ex Vivo Live Cell Imaging

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal role played by macrophages in driving the regenerative response. However, our understanding of this critical role has primarily relied on static views obtained from fixed tissue biopsies. To overcome this limitation and gain insights into these interactions in real time, this study outlines a comprehensive protocol for culturing salivary gland tissue ex vivo and capturing live images of cell migration.
The protocol involves several key steps: First, mouse submandibular salivary gland tissue is carefully sliced using a vibratome and then cultured at an air-liquid interface. These slices can be intentionally injured, for instance, through exposure to radiation, to induce cellular damage and trigger the regenerative response. To track specific cells of interest, they can be endogenously labeled, such as by utilizing salivary gland tissue collected from genetically modified mice where a particular protein is marked with green fluorescent protein (GFP). Alternatively, fluorescently-conjugated antibodies can be employed to stain cells expressing specific cell surface markers of interest. Once prepared, the salivary gland slices are subjected to live imaging using a high-content confocal imaging system over a duration of 12 h, with images captured at 15 min intervals. The resulting images are then compiled to create a movie, which can subsequently be analyzed to extract valuable cell behavior parameters. This innovative method provides researchers with a powerful tool to investigate and better understand macrophage interactions within the salivary gland following injury, thereby advancing our knowledge of the regenerative processes at play in this dynamic biological context.

著者スポットライト:損傷後の唾液腺再生におけるマクロファージ-上皮細胞相互作用の研究 

Immunofluorescent imaging is constrained by the ability to observe complex, time-dependent biological processes in just a single snapshot in time. This study outlines a live-imaging approach conducted on precision-cut mouse submandibular gland slices. This approach allows for the real-time observation of cell-cell interactions during homeostasis and the processes of regeneration and repair.

唾液腺における細胞間相互作用の Ex Vivo Live Cell Imaging(英語)

Salivary gland regeneration is a complex process involving intricate interactions among various cell types. Recent studies have shed light on the pivotal ...