この作品は、ウェルカムトラスト（：084277参考）からの助成金によって支えられて。

1。小脳顆粒ニューロンの準備<ol><li>約100直径25mmのカバースリップ（表1）オートクレーブ。 </li><li>滅菌ポリ- D -リジン溶液（表2）を含む50 mlの滅菌チューブに場所のカバースリップ。コー​​トカバースリップを2時間回転台の上に置きます。 </li><li>層流フードで滅菌ティッシュペーパーでドライコーティングカバーガラス（表1）。 </li><li>無菌6ウェルプレートおよびCO 2インキュベーター（表1）で暖かい。 カバーグラスに入れますカバースリップは使用前に4℃で1ヶ月間保存できます 。 </li><li>地元の倫理委員会のガイドラインに従って子犬7日間の古いのSprague Dawleyラットを安楽死させる。我々は、頸椎脱臼を使用して子犬を安楽死。 </li><li>小脳を摘出し、リン酸塩溶液（溶液B、表3）バッファを含む滅菌ペトリ皿に入れてください。 </li><li> 4月6日仔ラットのためのステップ1.5および1.6を繰り返します。 </li><li>小脳は、マッキルウェーン組織チョの無菌ステージ上に配置されていますPPER（表1）。組織は、90度のステージを回転させ、プロセスを繰り返す前に、375μmの間隔で切り刻まれている。 </li><li>みじん切り小脳は、以前は次の37暖めていたトリプシン溶液（溶液T、表4）℃に転送されます。 </li><li> 37インキュベート小脳℃で穏やかに攪拌しながら約5分毎と20分。 </li><li>中のトリプシン消化、火炎研磨ブンゼン火炎を使用して、3つの滅菌ガラスピペット（表1）。ピペットのそれぞれの口で細かいボア、ミディアムボアと広いボアを作成するには、炎を使用しています。 </li><li>ソリューションのTで20分間インキュベートした後、ベンチトップ遠心機（表1）で1分間1,000 gで小脳サスペンションと細胞をペレット化するためにトリプシン/ DNaseを阻害剤溶液（溶液W、表5）20 mlを加える。 </li><li>上清をデカントし、広いボアピペットを用いて濃縮されたトリプシン/ D​​Naseを阻害剤（溶液C、表6）1.5 mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li細胞懸濁液が均一になるまで&gt;最初のワイドボアピペットを用いて細胞をひいて粉にする、そしてミディアムボアと最終的にナローボア。 これは重要なステップであり、懸濁液は、この段階で均質にする必要があります 。 </li><li> 10mlの上の層の細胞懸濁液温めておいた（37℃）滅菌15 mlのチューブにウシ血清アルブミンを補充Earlesバランス塩溶液（表7）。 </li><li> 1500 グラムで5分間懸濁液を遠心し2で（37℃）温めておいたのMLS培地（表8）を細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> haemocytometerを用いて細胞数（表1）を推定し、mlあたり3.3 × 10 6細胞の最終的な密度に細胞懸濁液を希釈する。 </li><li>細胞をポリ- D -リジンでコーティングされたカバースリップ（最終密度2.5 × 10 5）の中心に細胞懸濁液の75μlを添加してメッキが施されています。 </li><li>カバースリップを含む培養プレートに細胞を可能にするために60分間CO 2インキュベーター内に配置されていますdhere。 </li><li>各ウェル播種した細胞を邪魔し、CO 2インキュベーターに培養プレートを返すように注意しながら中に培養液の1.5ミリリットルを追加。 </li><li>翌日は、有糸分裂阻害剤シトシンアラビノシド（表8）を添加した新鮮培地で培養液を交換してください。 培養中のグリア細胞のこの逮捕の増殖 。 </li></ol> 2。実験的なセットアップ<ol><li>基本的な実験は、（使用される特定の機器およびソフトウェアのための表1と表9を参照）、以下で構成する必要があります。 <ul><li>反転落射蛍光顕微鏡</li><li>冷却CCDカメラ</li><li>蛍光光源（単色光分光器またはフィルタホイール） </li><li>重力の灌流装置</li><li>パラレル白金電極とイメージング室</li><li>電気刺激装置</li><li>コンピュータ</li><li>画像取得ソフトウェア</li></ul></li><li>実験は、暗所でまたは赤色光のcondの下で実行する必要があります漂白FM色素を避けるために、サンプルの最小蛍光照明付きitions。 </li><li>実験は室温で実施されています。生理的な温度が必要な場合は、温度制御灌流システムを使用することができます。 </li></ol> 3。サンプル準備<ol><li>培養物は、in vitroで 8〜12日後に使用する必要があります。 </li><li>新しい培地で安定化を可能にするために室温で10分間、生理食塩水（表10）に、単一のカバースリップを転送する。 </li><li> 、カバーを取り外し、その下側およびペーパータオルまたは吸収紙の小片と接着細胞の周囲を乾燥させる。 </li><li>接着剤イメージングチャンバーの下側にカバーガラス、シリコーングリース（表2）を使用する。細胞は二つの平行線の間でなければなりません。十分なシリコーングリースは、入浴室の中央に入るあらゆるグリースなしで完全にチャンバーを密閉するために使用されるべきですが。 </li><li>そっと〜260μlのSAでお風呂室を埋めるラインのソリューションと、同じソリューションで入力チューブを埋める。 </li><li>それを密閉するチャンバの上部に接着剤シリコーングリースを持つクリーンなカバーを。入力と出力管をチャンバー内に閉じ込められた気泡を除去するために使用することができます。 これは、電気回路が気泡によって中断されないことが重要です 。 </li><li>ステンレス製のプラットフォームでのイメージング室をImmobiliseゆっくりと入力チューブを通して生理食塩水を灌流することで漏れをチェックします。 </li><li>倒立顕微鏡のステージ上に組み立て室をマウントして、重力の灌流システムにチャンバーを接続するには、まず生理食塩水で口をプライミングした。 </li><li>電気刺激装置にチャンバーのワイヤを接続して取り付けます。 </li><li>オイルのレンズが使用されている場合は客観的にイマージョンオイルの滴を追加します。明視野照明を用いてチャンバーの中央にある細胞に焦点を当てる。 </li></ol> 4。 S1フェーズ<ol><li> 1.5mlでニューロンを灌流生理食塩水で希釈したFM色素（表2）の。 </li><li>付属の刺激を用いた色素の取り込みを喚起するニューロンを刺激する。 </li><li>刺激の後、2分間新鮮な生理食塩水で浸み込ませる神経細胞が離れて過剰FM色素（流量率7 ml /分）を洗浄する。CGN培養系におけるグリア汚染が5％未満14です、したがって、この時間枠は、色素を除去するのに十分です。 。 </li><li> 8分間休息するニューロンを残す。 </li><li>このインターバルの間に、個々のFM色素負荷の神経終末が見える使用してフルオレセインの波長（;放射、&gt; 550nmの励起、480nm以下）である軸索のネットワークを探します。細胞のクラスターを持つ領域を避けてください。 強い励起は色素光毒性をもたらすことができますので、この段階で最小限に照明をキープ。このモードでの明らかな兆候は、軸索と染料アンロード（固定を染色するため）の不足のブレブ形成されています 。 </li><li>再フォーカスの画像はすぐに画像取得の前にわずかなドリフトので、残りの期間中に発生した可能性があります。 </LI&gt; <li> 1フレームの速度は4秒でタイムラプス画像取得を開始</li><li> 5取得した後- 10ベースラインの画像を、2秒（60活動電位）8 30 Hzの刺激を提供することで、RRPのエキソサイトーシスを呼び起こすフレームのキャプチャ後に手動ですぐに刺激を開始する 。。 </li><li>別の10枚の画像を取得した後、離れて10秒（400活動電位）を40 Hzの三刺激を使用してRP、各30秒8のSVエキソサイトーシスを呼び起こす。 </li><li>別の5を獲得 - 10個のイメージして、一時停止の画像取得を。 </li></ol> 5。回復フェーズ（図2を参照） <ol><li>ニューロンは少なくとも20分以上回復することができます。 </li><li> オプション -エンドサイトーシスに対する薬剤の効果がテストされる場合、3,8（図2b）この期間中に薬液とニューロンを灌流。 </li></ol> 6。 S2フェーズ<ol><li>とビューの同じフィールドを使用して対照実験のためにS1フェーズプロトコル（セクション4）を繰り返します。S1インチ</li><li> オプション -エンドサイトーシスに対する薬剤の効果がテストされる場合、FM色素（図2b）3,8を添加した薬液とニューロンを灌流。 </li><li> オプション -エキソサイトーシスに対する薬剤の効果に関心がある代わりに場合、前とRRPとRP除荷の刺激（図2c）3時の両方の薬液で浸み込ませるニューロン。 </li></ol> 7。データ解析<ol><li> ImageJとMicrosoft Excelやデータ解析のための同様のソフトウェアを使用してください。 </li><li>分析のために、スタック形式のイメージシーケンスが必要です。いくつかのイメージングソフトウェアは、単一のイメージとしてのシーケンスをエクスポートできます。このような場合は、内蔵機能のイメージ&gt;スタック&gt;画像がスタックに ImageJを使用してスタックに画像を変換します。 </li><li>ダイナミックレンジを最大化するためにスタックの明るさとコントラストを調整します。 イメージ&gt;調整&gt;明るさ/コントラスト （図3a）。 </li><li>重要な水平方向のドリフトは、tの間に発生した場合彼は実験、実行StackReg（ <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> ）とTurboReg（ <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ImageJの上に）プラグイン画像のスタック（図3b）を整列させる。 </li><li>時系列解析のプラグイン（実行<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ）（図3c）を。 </li><li>少なくとも90神経終末上の関心の領域（ROI）を定義します。これらは、それがアクティブな神経終末を（代わりに、事前刺激のイメージは後の刺激の画像から減算することができます）明らかにするためにアンロード染料の前と後の画像を切り替えるために有用である（1.5μmの直径を持つ円形のROI）と同一である必要があります。 理想的には、 ROIのサイズは典型的な神経終末 （図3c） よりわずかに大きいものです 。 </li><li>ティム上の各ROIの合計/統合された蛍光強度を取得するMicrosoft Excelへの電子と輸出（図3D及び4A）。 </li><li> S1とS2の両方のフェーズの最初の荷刺激（図4b - c）のY -軸の平面でのトレースを調整することで、任意の同じ値にROIのトレースを正規化する。 これは、バックグラウンドの蛍光強度の小さな変動を制御することです 。 </li><li>次のように、S1とS2の任意の蛍光単位（図4d）に各荷刺激により誘発される蛍光の絶対的減少を測定する。 <ul><li>蛍光のRRP =変化（ΔF）は、30Hzの2秒でトリガ</li><li> RP = 3 × 40 Hzの10秒でトリガさΔFの合計</li><li>総合リサイクルプール= RRP + RP </li></ul></li><li> 7.9に関連する各パラメータに対して、単一の実験のすべての神経の端末上の平均値を計算する。 </li><li>統計分析のために、複数の独立した実験から得られた平均値を平均化することができます。カバースリップの数ではなく、神経終末の数は、STATISTICAとして使用する必要がありますリットルをn </li></ol> 8。代表的な結果： CGNSが同一のロードおよびアンロードの手順を2回施行した対照実験は、図5に表されます。一連の実験を開始するとき、それはこのような対照実験は、S1とS2はS2の間に実験条件を変える前に同等であることを確認するために、毎日実行されることが不可欠です。 この例では、CGNS、80 Hzの10秒の刺激（図5a）を使用して、10μMFM1 -​​ 43を充填した。図5bは蛍光涙点で表されるFM1 -​​ 43 -ロードされた神経末端を示しています。図5cに示すように、ROIは90神経末端を介して定義されていました。 ROIの同じセットはS1とS2の両方に使用されました。両方のアンロード時には、RRPは、最初の3シーケンシャル40Hzの（10秒）刺激（図5a）とアンロードRPで30 Hzの（2秒）刺激でアンロードされました。各刺激時の蛍光低下が明らかに（5D - E図）を観察し、定量することができる。<html>調べたときに、RRP、RPと合計リサイクルのプールに対応する蛍光低下はS1とS2の両方で同等であった。 80％はS1とS2の両方のRPに居住しながら加えて、リサイクルのSV 20％がRRPに住んだ。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" /> 典型的なFM実験の模式図を示します 。 A）SVのエンドサイトーシスは、FM色素（緑色で表される）の存在下でトリガされます。染料はinvaginating膜（単SVはまたはバルクはエンドソーム）に取り込まれている。 B）原形質膜上の非内部化色素は灌流によって洗い流される。 C）蛍光が失われるおそれが原形質膜とリリースのヒューズのために利用可能となっているSVはラベルの付いたアン刺激、の申請により行う。 D）放出というラベルのSV量に比例する蛍光（ΔF）の変更は、定量することができる。 _upload/3143/3143fig2.jpg&quot;/&gt; 可能な実験プロトコルの2の回路図を図 。 A）細胞がFM色素の二回は、（S1とS2）のロードおよびアンロード受ける対照実験のフローチャートは。細胞は様々な刺激の範囲を使用してロードすることができます。 RRPは2秒間の30Hzでアンロードされるという点でアンロードする手順は同じですRPが続く10秒間に3回、40 Hzのを使用してアンロードRRPと予備のプールアンの刺激は30秒で40秒、他のすべての刺激により分離した。細胞は、S1とS2の間に20分間の回復に委ねられている。 B）エンドサイトーシスまたはC上の物質の影響をテストするために実行可能な変更のフローチャート）エキソサイトーシスも表示されます。対応するテストの薬は指示された期間中のチャンバー内に灌流することができます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" /> 画像Jにおけるデータ分析の図3スクリーンショット 。スクリーンショットが表示されますイメージJ.を使用）明るさとコントラストの調整、B）フレームアライメント、C）のROIの選択、およびD）輝度値を抽出するための<img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" /> Microsoft Excelでデータ分析の4スクリーンショットを示します 。スクリーンショットは）イメージJ（第1列から生データをインポートするために示されている=フレーム番号、個々の神経終末からの残りの列は=データ）B）開始時に任意の値（200）S1から基準値（フレーム10）の調整S1に同じプロトコルを使用して、フレーム55でS2ベースライン値の最初の刺激の、C）の調整、およびMicrosoft Excelを使用して蛍光滴のD）を測定。 Dに示すように平均化されたトレースはそれぞれのドロップの前と後の時点を定義するために使用されていることに注意してください。各ROIのための蛍光滴のサイズは、Cに示すように、スプレッドシート上の値から決定されるべきである<img alt="図5" srC =&quot;/ files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg&quot;/&gt; 図5。代表的な制御実験。 CGNSが80 Hzの（10秒）刺激を用いて10μMFM1 -​​ 43を使ってロードした対照実験のA）フローチャート。 S1とS2の位相は同じです。 RRPと予備のプールアンの刺激は30秒で40秒、他のすべての刺激により分離した。 B）神経終末を示す画像は、FM1 -​​ 43を搭載。 C）90番号のROIを示すBと同じ画像が分析のために選択。 D）選択した時点でBの赤いボックスで示されている領域の画像。刺激前の基礎=; 30 Hzの= 30Hzの2秒刺激後、40 Hzの1,2,3 =各40 Hzの10秒間刺激後。これらの画像は、蛍光の変化（右上に表示されるスペクトラムのバー）を説明するために擬似カラーで表示されます。 E）平均± C.個々の刺激に示すように90神経末端から得られたSEMトレースは水平方向の棒で表されます。スケールバーは=10μmである。

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	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

FM染料は広範囲に多くの神経細胞調製物中の神経ターミナルの機能を調査するために使用されます。これらはどちらSVのエンドサイトーシス、SV売上高またはエキソサイトーシス6の動力学の程度を監視するために主に用いられてきた。記述されたプロトコルは、特定のSVのプールのアンロードの差を調べるためにこれらの研究を拡張しています。これは、SVのプールの補充とも動員の彼らの程度に関する追加情報を提供します。 FM染料は同じ神経終末内でSVリサイクルの複数のラウンドにラベルを付けるために使用することができます。我々は、このプロパティを利用し、各端末におけるSV売上高が同じ神経末端に二回監視することができるプロトコルを設計した。これが原因で、並列神経の端子11にSVリサイクルの均質性に不可欠である正確な内部統制を、提供します。内部統制としてS1相の使用を介して、RRP、RPと合計の補充薬剤の存在下でSVのプールは確実にし、直接比較することができます。 リサイクルの絶対的な大きさの情報を提供するだけでなく、RRPとRPプールが異なる刺激条件下では、このプロトコルはまた、以下のデータを提供することができます - 1）リサイクルのプールの関数としてRRPとRP間のSVパーティショニングS1とS2、2用）の合計S1リサイクルのプールとS1の同じプールの関数としてS2内の任意の定義されているSVのプールの3）相対的な大きさの関数としてS2プールの相対的な大きさ（RRPおよびRP）。収集時間が遅すぎるので、この特定のプロトコルは、（速度測定のために収集時間が可能と画像の取り込みに同期を自動的にアンロードと同じくらい急速なはず）、しかし動態をアンロードに関する情報を提供することはありません。 私たちの30 Hzの2秒の刺激は、高張ショ糖8にアンロードRRPの同一の範囲を呼び起こす。 RRPのサイズ導入15アンロード高張ショ糖によって定義され、我々は、海馬ニューロン16の研究と一致し、このプロトコルは、すべてのRRP SVSをアンロードすることを明記することができます。この刺激は、すべての色素標識のSV 95％を枯渇させるパラダイム（50mMのKClを2刺激）に染料の同一量をアンロードするので、予備のプールはほぼ完全に400の刺激（40 Hzの10秒ごと）の三列車が消耗している8,17。 RRPと予備プールの両方のサイズの正確な定量化はまた、CCDカメラのダイナミックレンジ内での情報の取得に依存しています。 この単純なプロトコルは、さらに変更することができます。ローディング刺激の強さはまた別のエンドサイトーシスのモードがSVプールの補充をどのように影響するかを神経活動と決定するために変えることができます。必要に応じてさら​​に、ロードおよびアンロードの3つ以上のサイクルをも行うことができます。このプロトコルは、過剰発現またはどちらかをトランスフェクションした細胞でも使用できます。shRNAベクター。プライマリーニューロン培養の低いトランスフェクション効率のために、発現されたタンパク質は蛍光タンパク質でタグ付けする必要があります。それは、これらの蛍光タグは、FM色素の信号（例えば、シアンまたは赤色のタンパク質を使用）に干渉しないことが不可欠です。このインスタンスでは、ビューの同じフィールドにトランスフェクトおよび非トランスフェクト細胞からの神経終末はまた付加的な制御8として比較することができます。摂動は、両方の負荷の間に存在しているので、そのような実験ではS1とS2の負荷との間でのロードの程度の比較は、ほとんど価値がありません。 SVプールの間に染料のパーティショニングはまだしかし、8視覚化することができます。 遺伝記者はpHluorinsも初代神経培養におけるSVエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを監視するために用いることができると呼ばれる。このようなプローブは、VAMP、シナプトフィジンとVGLUT1 18などのタグ付きSV蛋白質の内腔ドメインのpH環境にpH感受性緑色蛍光タンパク質を使用してください</suP&gt;。水疱性ATPアーゼ阻害剤と組み合わせて使用すると、pHluorinsはSVプール動員19の速度と程度の両方を報告することができます。ここで説明するFM -染料ベースのアプローチがpHluorinの技法に比べていくつかの利点を持って、まず、FM色素は、SVのエンドサイトーシスのモードは、RRPと予備プール8を補充する情報を提供しています。第二に、特定のSVのプールは、20種類のスペクトル特性を持ち、最終的にトランスフェクションの要件がないFM色素で標識することができます。定義SVはで表示されるようにエンドサイトーシス中に色素をロードしなければならないので、FM色素は、（pHluorins 19〜対照的に）しかし、休んでとリサイクルSVプールの間にSVトラフィックに関する情報を提供することはできません。したがって、FM色素とpHluorins両方の長所と短所を持っていると同じ問題に対処するための独立した実験で利用されるときに最も強力です。 高品質の画像は、有効な分析とreproducibのために不可欠です。ルの結果。水平方向のドリフトが簡単に補正することができる一方で、Z軸のドリフトがある実験を回復することはできません。このような理由で、S1とS2のアンロードを開始する前に画像を再集中することが重要です。かなりの蛍光減衰が発生した場合には、減衰補正が（通常は刺激の非存在下でFM -ロードされた細胞から、以前に記録されたトレースを減算すること）が適用されることがあります。しかし、減衰補正のみグラフィカルな表現のために実行され、任意の定量分析に使用されないことが示唆された。

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th></tr><tr><td> AxioCam MRM牧師3デジタルカメラ</td><td>カールツァイス</td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td>アクシオObserver.A1顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td>細胞培養プレート（6ウェル） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 657160 </td></tr><tr><td>遠心機（ユニバーサル32R） </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2インキュベーター</td><td>ヘレウスインスツルメンツ</td><td> 51014042 </td></tr><tr><td>ファルコンチューブ（50分の15 ml）を</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0.75∞/ 0.17目的</td><td>カールツァイス</td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ（Ø25mm） </td><td> VWRインターナショナル</td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット（230 nm）の</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td>イメージング室</td><td>ワーナー</td><td> RC - 21 BRFS </td></tr><tr><td>層流フード</td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td>マッキルウェーンのティッシュチョッパー</td><td>ミクルラボラトリーエンジニアリング株式会社</td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td>水銀ランプ</td><td>カールツァイス</td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStimシステム電気刺激装置（100mVを、1msの単相の幅） </td><td> Digitimer株式会社</td><td> D330 </td></tr><tr><td>注入ポンプ</td><td>ワトソン - マーロウ</td><td> 313S </td></tr><tr><td>血清学的ピペット（5/10/25 ml）を</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td>シャッターコントローラ</td><td>カールツァイス</td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td>注射器（20ml）に</td><td> BD Plastipak </td><td> ST01 - B002 </td></tr><tr><td>シリンジフィルター（Minisart - 0.20ミクロン） </td><td>ザルトリウスStedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC - 6 6チャンネルのバルブコントローラ</td><td>ワーナー</td><td> 64から0135 </td></tr><tr><td> YFP FilteRセット（46セット） </td><td>カールツァイス</td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table>表1。使用される特定の機器および装置<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td> FM1 -​​ 43 </td><td>バイオサイエンスケンブリッジ</td><td> BT70021 </td><td> 10μM </td></tr><tr><td> FM2 - 10 </td><td>バイオサイエンスケンブリッジ</td><td> BT70044 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td>シグマ</td><td> P7886 </td><td> 15μg/ mlの</td></tr><tr><td>シリコーングリース</td><td>シグマ</td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table>表2。使用される特定の試薬<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマ</td><td> A4503 </td><td> 0.3パーセント</td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td>シグマ</td><td> G5767 </td><td> 0.25パーセント</td></tr><tr><td>ミリグラムSO 4 · 7H 2 O </td><td>シグマ</td><td> M2773 </td><td> 1.5mMの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> GIBCO </td><td> 21300 </td><td> 960 mg/100ミリリットル</td></tr></tbody></table>それぞれの準備のための新鮮な100ミリリットルを行う 使用前に、滅菌フィルタ表3。 CGNの準備のためのソリューションB <table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>ソリューションB </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19ミリリットル</td></tr><tr><td>トリプシン（5 mg / mlストック、-20 ° C） </td><td>シグマ</td><td> T9201 </td><td> 1ミリリットル</td></tr></tbody></table>表4。 CGNの準備のためのソリューションT <table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>ソリューションC </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3.2ミリリットル</td></tr><tr><td>ソリューションB </td><td align=&quot;センター&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16.8ミリリットル</td></tr></tbody></table>表5。 CGN準備のためのソリューションW <table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ（DNase処理、0.5mlの株式500 U、-20 ° C） </td><td>シグマ</td><td> D5025 </td><td> 0.5ミリリットル</td></tr><tr><td>し、MgSO 4 · 7H 2 O </td><td>シグマ</td><td> M2773 </td><td> 1.5mMの</td></tr><tr><td>ソリューションB </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td>大豆トリプシンインヒビター（SBTI、0.5mlの株式、-20℃あたり0.5ミリグラム） </td><td>シグマ</td><td> T9003 </td><td> 0.5ミリリットル</td></tr></tbody></table>表6。 CGN準備のためのソリューションC <table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマ</td><td> A4503 </td><td> 4パーセント</td></tr><tr><td>アールの平衡塩類溶液（EBSS） </td><td> GIBCO </td><td> 24010 </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td>し、MgSO 4 · 7H 2 O </td><td>シグマ</td><td> M2773 </td><td> 3mMの</td></tr></tbody></table>表7。 CGNの準備のためのEBSSソリューション<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>シトシンβ- D -アラビノフラノシド（ARA - C）* </td><td>シグマ</td><td> C1768 </td><td> 10μM </td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td> GIBCO </td><td> 10106 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> D -グルコース</td><td>シグマ</td><td> G5767 </td><td> 30mMの</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>シグマ</td><td> G3126 </td><td> 2mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P5405 </td><td> 25 mMの</td></tr><tr><td>最小必須培地（MEM） </td><td> GIBCO </td><td> 21090 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン（P）/ストレプトマイシン（S） </td&gt; <td> GIBCO </td><td> 15140 </td><td> 100 U / mlの（P）、100μg/ mlの（S） </td></tr></tbody></table> *のAra - Cは、1 DIV以降から培地に添加する必要がある表8。 CGNの準備のための文化メディア<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>バージョン</th><th>会社</th></tr><tr><td> AxioVisionのDDBJリリース。 </td><td> 4.8 </td><td>カールツァイス</td></tr><tr><td> ImageJの</td><td> 1.42q </td><td>国立衛生研究所（NIH） </td></tr><tr><td> Microsoft Excelの</td><td> 2003 </td><td>マイクロソフト</td></tr></tbody></table>表9。使用される特定のコンピュータソフトウェア<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>ないカタログはありません。 </th><th>濃度</th></tr><tr><td>のCaCl 2 · 2H 2 O </td><td>シグマ</td><td> C7902 </td><td> 1.3mmの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td> G5767 </td><td> 5mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P5405 </td><td> 3.5 mmの</td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> P9791 </td><td> 0.4mMの</td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td>シグマ</td><td> M0250 </td><td> 1.2 mmの</td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フルカ</td><td> 71378 </td><td> 170 mMの</td></tr><tr><td>飽和NaHCO 3 </td><td>フルカ</td><td> 71627 </td><td> 5mMの</td></tr><tr><td> Na 2 SO 4で </td><td> BDH研究室用品</td><td> 10264 </td><td> 1.2 mmの</td></tr><tr><td> TES </td><td>シグマ</td><td> T1375 </td><td> 20 mMの</td></tr></tbody></table>表10。生理食塩水液（pH7.4）

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

中枢神経終末における神経伝達物質の放出の後、SVSは迅速にエンドサイトーシスによって取得されます。 SVSは、その後、神経伝達物質を充填し、エキソサイトーシスの1,2で使用可能なSVSなど定義されているリサイクルのプールを、再度参加している取得。容易に放出できるプール（RRP）と予備プール（RP） - リサイクルプールは一般的に2つの別個のプールに分割できます。その名前が示すように、RRPはRP SVSを強烈な刺激の1,2の間にのみリリースされている間の融合のために即座に使用できるようSVSの構成されています。 1）を理解するためにこれらのSVのプールの差動補充を報告する信頼性の高いアッセイを持つことが重要ですどのよ​​うにSVSのエンドサイトーシスの異なるモード後のトラフィック（たとえば、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよび活動依存バルクエンドサイトーシスなど）と2）のメカニズム別の刺激に応答してRRPとRPの両方の動員を制御する。 FM色素は、日常的に採用されていますedは定量的に中枢神経端末3-8のSV売上高を報告する。彼らは、膜を横切って脂質二重層で可逆パーティショニングを可能にする疎水性の炭化水素の尾部、および親水性のヘッドグループをブロックの通路を持っている。色素は水溶液中ではほとんど蛍光持っているが、膜9でパーティション化されたときに、その量子収率が飛躍的に増加する。したがって、FM色素は積極的にSVSをリサイクル追跡するための理想的な蛍光プローブである。 FM染料の使用のための標準プロトコルは、次のとおりです。まず、彼らは、神経細胞に適用され、エンドサイトーシス（図1）中に取り上げられている。非内部化染料の後、原形質膜、リサイクルのプール内でリサイクルされたSVSの再配布から洗い流される。これらのSVSはその後、アンロードの刺激（図1）を使用して消耗している。のSV FM色素のラベリングは、量子10であるので、結果として得られる蛍光の低下が放出小胞の量に比例します。このように、SVSのリサイクルと融合はPRから生​​成エンドサイトーシスのeviousラウンドは確実に定量することができる。 ここで、我々は、情報の2つの追加要素を取得するために変更されているプロトコルを示す。まず、シーケンシャルアンロードの刺激は、特定のSVのプールの補充の定量化を可能にするために、差RRPとRPをアンロードするために使用されます。第二に、それぞれの神経終末は二回プロトコルを受ける。従って、S1の同じ神経終末の応答は、内部統制を提供し、S2の位相（図2）における被験物質の存在と比較することができます。異なる神経端子間SVリサイクルの程度は11非常に可変であるため、これは重要です。 どんな接着初代神経培養はこのプロトコルのために使用されるかもしれない、しかし播種密度、ソリューションと刺激条件は、小脳顆粒ニューロン（CGNS）12,13用に最適化されています。

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。 SVリサイクルの2つのラウンドは、内部統制を提供する同じ神経終末に監視されます。

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K ビュー.  University of Edinburgh. 中枢神経終末で補充し、特定のシナプス小胞の動員（SV）のプールを定量化するために、ライブ蛍光イメージング技術が記載されている。 SVリサイクルの2つのラウンドは、内部統制を提供する同じ神経終末に監視されます。

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

スチリル染料の光変換を使用して、シナプス小胞プールの勉強

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

神経科学

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

L-ロイシンメチルエステルを使用した小脳顆粒細胞培養物からのミクログリアの選択的枯渇

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...