著者らは、プロトコルの開発を支援するためにA.ベンハムに感謝します。この作品は、BABにNIHの助成金NS06747によって賄われていた

1。イメージングのためのワームの準備プロトコルのこのセグメントは、公開C.に基づいています虫培養技術1,2、 図1に概説されています。 <ol><li> NA22 E.高ペプトンNGM寒天プレート（10cm）のシードにワームを育てる大腸菌ほぼ餓死するまで。免疫染色した場合、1プレートが確実に（パート2を参照）アカウント道に沿って損失、およびイメージングのためのワームを選択するために使用する厳密な基準を考慮して、染色1個人のための十分なワームが生成されます。 </li><li>プレートにDDH 2 0の数mlを注ぐことによって収穫のワーム、簡単に渦巻く、15 mlのコニカルチューブ（チューブにワームのほとんどを転送するために必要に応じて繰り返し）に液体を注ぐ。 3分、1000Xグラムの臨床遠心分離機でペレット。上清までのddH 2 Oで洗浄し、ペレット1-3Xは、残留細菌を除去することが明らかである。ワームは、ガラスに付着として、上清を除去するためにポリプロピレン転送ピペットを使用して、（このステップ以降は、それは卵の生存率の損失を避けるために、ステップ間の時間を最小限に抑えることが重要です）。 </li><li>最後の洗浄後、ワーム、およびリリースの卵を溶解する5ミリリットルアルカリ性次亜塩素酸溶液中で再懸濁しワームペレット。優しくロック、1分あたり約解剖顕微鏡下でチューブを調べます。ワームの約50％が（彼らが曲がって開いて壊れて表示されます）を溶解させたときに、卵·バッファ、反転数回で一番上にチューブを充填し、3分、1000X gのペレット化による溶解を終了します。溶解時間が5分を超えてはなりません。 </li><li>転送ピペットで上清を除去し、卵Bufferでペレットを3倍に洗浄する。 </li><li>破片から卵を分離するため、DDH 2 Oの30％ショ糖のクッションの上にフロート：ステップ1.4から最後の洗浄後、慎重に5ミリリットルのddH 2 0で上清とペレットを再懸濁しを削除します。のddH 2 O 5 mlの滅菌60％ショ糖を追加して、よく混ぜる。臨床遠心分離機6分、1000X gでスピン。卵は（それらは、HAますメニスカスで収集します。破片ペレットますが、）曇った外観を簡単お好み検索。 </li><li>プラスチック製のピペットを使用して、最小限のボリュームで卵を吸うと非シードNGM寒天プレートに移す。チューブの側面に付着した卵はそっとすすぎと同様に転送することができます。分析した菌株ごとに10センチメートルシーディングプレートで十分です。 </li><li> 20一晩卵（〜16時間）℃でシーディングプレートをインキュベート数時間のために少し蓋を残して、それを乾燥させるために、最初の数時間のためにプレートを大気開放しますが、一晩をカバーするようにしてください。 </li><li>孵化した後、基底Sの15 mlコニカルチューブ（プレートに数ml S基礎を追加し、渦巻、チューブに注ぐ）にL1幼虫を転送します。臨床のS基礎最小限のボリュームで再懸濁し、遠心（3分間、1000Xグラム）と、NA22細菌を接種した10 cmのNGM寒天平板への転送のペレット。ステップ1.1から各原版はここ2プレートを使用しています。ワームは、希望する年齢に達するまでインキュベートします。 </li><li> 1日に1回または2回ごとに文化を監視します。彼らは危険Oである場合飢えfは、新鮮なNA22プレートに移す。野生型N2のワームについては、飢餓、動物が離れて食糧枯渇ゾーンから一斉に移行するようにプレートを横切って移動するワームのラインや波の形成によって先行されています。このフォームの後、食品は完全に数時間以内に枯渇する。 </li><li>ワームは、現在、免疫染色やライブイメージングのための準備が整いました。そのままワームの大規模な番号が容易に撮像することができるので、懸濁液中にワームを固定して染色することが最適です。ワームは、多数のイメージングのために必要されているため、フィニーとRuvkunはプロトコル3月6日に基づいて、染色手順は、凍結クラック手順に好適である。 </li></ol> 2。共焦点像<ol><li>共焦点イメージングのためのスライド上でワームをマウントします。マイクロリットルあたり数百にワームの密度を調整します。 （カットオフ25ゲージ針を備えた3 mlの注射器を介して印加される）は、撮像時の蒸発を防ぐためにワセリンの細いリングで囲まれたS-基底の2％アガロースのパッドを作成します。ピペットカバースリップの上にワームの懸濁液を数マイクロリットル（イメージングライブワームであれば麻酔を使用します）、カバースリップの上にアガロースパッドを下げて、パッドに均等にワームを拡散。 </li><li>イメージングのためのワームを選択します。 ±45°（0°は、直接目的志向を意味する）よりも興味のあるシナプスがこれ以上の半径方向の変位と、対物レンズに向かって配向しているワームを選択してください。退色を避けるために（数秒）すぐにこの評価を行う。初期の文化の規模は十分なワームは、これらの幾何学的な基準を満たすことを確実にするために最適化されています。 </li><li>標本の共焦点イメージングを完了します。 0.4約14μmの厚さのセクション内に包含することができ、比較的平坦な試料は、最良の結果を生成します。高速、低解像度画像（512×512ピクセル）迅速で正確なデータ収集のために十分である。これは蛍光の過小評価の原因となりますので、飽和の過剰な信号強度を持つ検出器を避ける信号。 </li></ol> 3。個々のシナプスClustersの自動識別と分析<ol><li> Volocity 4.0（またはそれ以降）ソフトウェア（パーキンエルマー）を用いた共焦点顕微鏡からのオープンマルチTIF出力ファイルを作成します。 </li><li>作物離れて興味のある構造が含まれていない画像の領域（画像- &gt;拡張フォーカス- &#39;フリーハンドROI &quot;ツールを使用して、興味の&gt;範囲選択- &gt; [アクション- &gt;作物の選択に、 図2A）。 （注）、拡張焦点は、分析を支援するためのコンピュータの画面上でz-平面の投影を生成しますが、基になるデータには影響しません。同じことが、必要に応じて）の明るさとコントラストの調整にも当てはまります。 </li><li>ラインツールを使用して解析領域の長さを測定します。線の長さを計算し、データテーブル（ 図2B）に追加されます。 </li><li>フィルタ（測定モード） &#39;強度によるオブジェクト &quot;を使用してオブジェクトを識別します。シナプスのクラスタがあるようなしきい値を指定します。強調表示と非シナプス背景には、（ 図2C）ではありません。別の色で標識された独立したシナプスのマーカーを含めることは、シナプスを識別明確に助けるかもしれない。典型的なシナプスは、数から数百ボクセルに及ぶ。コントロールサンプルを使用して一度しきい値を設定し、後続のすべてのサンプルのためにそれを使用しています。それは実験者のバイアスの可能性を紹介しますので、各サンプルを閾値と別々に受け入れられません。オブジェクトが選択された（ 図2D）を自動的に集計されています。 </li><li>アレンジとデータをエクスポートします。これらは通常、バックグラウンドの斑点であるため、2つまたはより少ないボクセルのオブジェクトを排除します。これらは、さらにフィルタリングすることによって、以降の解析時に除去することができます。 &quot;オブジェクトのサイズ&quot;によってそれらの除去の下流、再ソートデータファイルを容易にするために、彼らはすべてのグループが一緒になります。 Microsoft Excelや他のスプレッドシートプログラムで開くことができるCSV形式でデータをエクスポートします。各画像は1つの出力ファイルを生成します。 </li><li> Volocityソフトであればウェアが使用できない、代替のメソッドが3次元情報が失われているが（説明を参照してください）（例参照。7、またはImageJを使用して手動で分析）を利用することができる共焦点顕微鏡データのZ平面投影を分析することです。 </li></ol> 4。代表的な結果提示定量法は、さまざまな明るさと異なるボリュームのクラスタの集団を区別することができるはずです。 図3に示す代表的な画像と対応する定量的データは、これらのパラメータに基づいて差別化の例を示しています。一般的なルールとして、結果は目に明らかであるものに準拠する必要があります。 Cの腹側神経索を免疫染色、UNC-49 GABA A受容体の場合elegansは 、すべての動物は、通常サイズと成熟度に非常に似て登場し、5ワームのグループ（分析神経コードの長さに正規化）の合計シナプスの蛍光値は標準誤差を示した<html>平均4の約10％の値。遺伝子変異や他の実験的な治療（例えば、薬剤曝露）量と強度の値とシナプスのクラスタの頻度分布だけでなく、変更するかもしれませんが、おそらく、時間経過やワームの同期の発達は、より高い変動性につながる。しかし、定量的な結果は常にエラーが発生し、再しきい値またはartefactualオブジェクトの除去などの是正措置を示唆しているどこに明らかにする必要がありますVolocityによって識別された画像やオブジェクトの検査、視覚的にない場合は理解できるものを反映する必要があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> 図1。同期での準備線虫の培養。同期文化は、このプロシージャから取得されますので、C. elegansの開発逮捕や食品の非存在下でのL1幼虫、食品が導入され再開されます。 <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> 図2。シナプスの涙点の定量。 <ol class="ualpha"><li>画像の余分な領域は、ファイルサイズを削減し、特異性を高めるためにトリミングされます。左側のパネルが起動イメージを示し、中央のパネルが選択された領域を示し、右側のパネルには、トリミング後の画像を示しています。赤の信号がUNC-49 GABA受容体の免疫ですが、緑の信号は、シナプス前GABAニューロンが4で表されるシナプトブレビン-GFP（シナプスマーカー）です。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 </li><li>行が分析する神経コードセグメントの長さを描かれ、その長さは自動的に結果表に記録されています。この情報は、ワームは染色中に断片化している場合、いくつかの倍を変えることができる解析可能な神経コードの長さに起因するシナプスのデータを正規化する必要があります。www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。 </li><li>しきい値は、個々のシナプスのクラスタを識別するために適用されます。左側のパネルには、しきい値の前にイメージを示し、異なるしきい値レベルの例は、別のパネル（緑色の信号は省略）に示されています。識別された各オブジェクトは、着色された領域として画像上に描かれています。一番左のパネルで、視覚的に明らかシナプスクラスタと一番右のパネルに着色された地域間の対応関係に注意してください。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 </li><li>識別された各オブジェクトは、結果テーブルに個別に記載されています。個々のオブジェクトを選択することができ、必要に応じて検査のために画像上で強調表示されます。オブジェクトがあったので緑のチャネル情報は、潜在的に紛らわしいのですが表が赤（ &#39;ローダミン&#39;）と緑（ &#39;EGFP&#39;）チャネルの情報が含まれていることに注意してください。厳密には赤色の蛍光に基づいて同定した。この分析は、単一カラー画像上で実行される可能性があります。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> 図3。代表的な結果、野生型C.からの代表的な顕微鏡写真elegansは前に（）とムシモール、受容体は長時間露光した後にダウンレギュレートになるようになりGABA受容体アゴニスト（B）と治療後のUNC-49 GABA受容体のために染色した。パネルは、前（左）と（右）しきい値と小さなバックグラウンドのしみを除去した後のトリミング画像を表示します。 （C）に示すように、標本の定量的なシナプスのパラメータのプロット（A）と（B）：総個々のシナプス蛍光コンテンツの神経コードの長さ（左）と累積確率のヒストグラム（中央）に正規化蛍光とシナプス量（right）は、アゴニスト曝露（ムシモール処理のための治療は、n = 115シナプスのn = 60シナプスによって誘発されるシナプスの内容とボリュームで統計的に有意な減少を示す、P &lt;0.001、コルモゴロフ-スミルノフ検定試験<a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu /統計/ KS-test.htmlという</a> 。）

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介するメソッドは、Cのシナプスの大集団の定量的なマルチパラメータデータを抽出するように設計されていエレガンス 、試験治療グループ内の一貫性を最大化しながら。三つの特徴は、これらの目標に貢献しています。最初に、免疫染色はすべての動物が同じ年齢であることを確認し、同期ワーム集団で実行されます。発現レベルの開発規制が実験的治療の効果を不?...

<table border="1"><tbody><tr><td> ソフトウェアの名前 </td><td> 会社 </td><td></td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Volocity v4.0以上</td><td>パーキンエルマー/ Improvision </td><td></td><td>このソフトウェアにアクセスするためのローカルイメージングのコア機能を確認してください。デモ·ソフトウェアは、パーキンエルマー社のウェブサイトで入手できます。このメソッドは、Volocityの唯一の定量モジュールが必要です。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2特異的試薬および装置。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 卵バッファ </td><td> NaClを 塩化カリウム CaCl 2を MgCl 2を HEPES （7.3にpHを調整する） </td> &lt;TD&gt; 118 mMの 48 mMの 2mMの 2mMの 24 mMの</td></tr><tr><td> アルカリ性次亜塩素酸（5ミリリットル用） </td><td>新鮮な家庭用漂白剤（30日開封後ボトルを破棄します） 10 N NaOHで DDH 2 O </td><td> 1.0ミリリットル0.25ミリリットル 3.75ミリリットル</td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1。ソリューション。 </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

シナプス強度が前シナプス神経伝達物質の放出イベントへのシナプス応答の振幅を表し、全体的な神経回路の機能に大きな影響を与えます。シナプスの強さは批判的にシナプス後膜上のシナプス部位でクラスタ化された神経伝達物質受容体の量に依存。受容体レベルは、発達が確立され、シナプス可塑性と神経調節の重要なメカニズムを表す表面ローカライズされ、シナプス、細胞内プールの間に受容体の輸送によって変更することができます。シナプスにローカライズされた神経伝達物質受容体の存在量を定量化する厳密な方法は、シナプスの開発と可塑性を研究するために不可欠である。それは非シナプスプールからシナプスを区別し、シナプスの種類に応じてローカライズされた受容体の個体の間で区別する、空間情報を維持するために蛍光顕微鏡では、最適なアプローチです。遺伝的モデル生物線虫elegansは特に無傷の動物のネイティブシナプスの検査を可能にする、小型サイズとその神経系の相対的なシンプルさ、透明性、および強力な遺伝学的手法の利用に起因するこれらの研究に適しています。 ここでは、Cで蛍光標識されたシナプスの神経伝達物質受容体を定量するための方法を提示エレガンス 。その主な特徴は、マルチプレーン共焦点顕微鏡の出力ファイル、集計の位置、ボリューム、蛍光強度と、各シナプスの総蛍光の三次元の個々のシナプスの自動識別と分析である。このアプローチは、共焦点のデータをz平面投影の手動分析上の2つの主要な利点があります。共焦点のデータセットのすべての面が含まれているため、まず、データは通常、ピクセル強度の平均値または最大値に基づいて、z-平面投影を介して失われることはありません。第二に、シナプスの識別は、自動化されていますが、元で検査することができますシナプスの多数からのデータの迅速かつ正確な抽出を可能にするデータ分析が進むにつれてperimenter、。サンプルあたりのシナプスの数百〜数千を容易に得ることができる、大容量のデータを生成する統計的検出力を最大化するために設定します。 Cを調製するための考慮事項分析、および治療 ​​グループ内の動物間のばらつきを最小限にするために共焦点イメージングを行うための線虫についても説明します。 Cを分析するために開発がelegansのシナプス後受容体は、このメソッドは、通常、実際にシナプスにローカライズされたタンパク質、または、離散的なクラスタ、涙点、または細胞小器官に局在化されている任意の蛍光シグナルの任意のタイプのに便利です。 手順は、次の3つの手順で実行されます。1）試料2の製造）は共焦点イメージング、3）画像解析。ステップ1と2 は 、Cに固有のものです線虫は、ステップ3は、一般的に共焦点顕微鏡写真内の任意の点状の蛍光シグナルに適用された。

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する<em&gt; C.エレガンス</em&gt;、シナプスの数百人が急速にz-平面の投影によって導入された歪みがなく、単一試料内で特徴づけることができるようになります。

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K ビュー.  University of Toledo. シナプスでクラスタ化された神経伝達物質受容体の存在量は強くシナプス強度に影響を与えます。このメソッドは、の単シナプスの分解能で三次元的に蛍光標識された神経伝達物質受容体を定量化する C.エレガンス、シナプスの数百人が急速にz-平面の投影によって導入された歪みがなく、単一試料内で特徴づけることができるようになります...

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

トランスジェニックを用いてアッセイするβ-アミロイドの毒性 C.エレガンスモデル

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

神経科学

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegansの追跡と行動計測

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

中に神経芽細胞細胞質分裂を可視化する<em&gt; C.虫</em&gt;胚

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

の自動解析<em&gt; C。エレガンス</emセレストソフトウェアを使用&gt;スイム挙動

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...