この研究は、科学（BER）、米国エネルギー省、協力協定がないの局によってサポートされていました。デFC02 - 02ER63453、国立科学財団の微生物ゲノムシーケンシングプログラム（受賞番号0626826と0731916）。我々は、環境サンプルのコレクションを持つ彼の援助のための彼の技術的専門知識とアドバイスとK.エリックWommack用ジョングラスに感謝。

1。溶液の調製ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行う前に、リン酸緩衝液を準備する必要がありますし、ハイドロキシアパタイトは、適切に水和でなければなりません。 <ol><li> 1Mリン酸溶液、pHを6.8：1Lフラスコ中の滅菌、DEPC処理H 2 O 1Lのナトリウムリン酸一塩基の119.98グラムを溶解滅菌、DEPC処理H 2 O 1Lのナトリウムリン酸二塩基の141.96グラムを溶解することによって1Lフラスコに1Mリン酸ナトリウム、二塩基溶液を調製1:1の割合でモノ - 及びジ - ソリューションを組み合わせる。マグネチックスターラーバーを用いて撹拌プレートとのミックスでフラスコを置きます。水酸化ナトリウム（pHを増加させる）またはリン酸（pHを下げるために）追加することで6.8にpHを調整する。 </li><li> 0.12Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlのの30ミリリットル組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理水を追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理水を追加。オートクレーブ。 </li><li> 0.18Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlのの45ミリリットル組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理H 2 Oを追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li> 0.20Mリン酸緩衝液：500ミリリットルのフラスコで、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlの50mlのを組み合わせる。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理H 2 Oを追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li> 0.40 Mリン酸緩衝液：500ミリリットルフラスコに、1Mリン酸溶液、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のpHを6.8、2.5ミリリットル、および0.5M EDTA 5mlの100mlの組み合わせ。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理H 2 Oを追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li> &quot;1.00Mリン酸緩衝液は、&quot;（このソリューションではリン酸塩の実際の濃度は0.91 Mです）：500ミリリットルのフラスコで、10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の1Mリン酸溶液、pH6.8、2.5ミリリットルの30ミリリットル組み合わせ、および5ミリリットルの0.5M EDTA。 225ミリリットルの容積に無菌、DEPC処理水を追加。 6.8にpHを調整する。 250ミリリットルに滅菌、DEPC処理H 2 Oを追加。オートクレーブ。 </li><li>ハイドロキシアパタイト水和：水酸アパタイトの1グラムから重量と50mlのチューブに加える。ハイドロキシアパタイトに0.12Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを追加し、混在させる反転。前の60℃に温度を持って使用して、よく混ぜます。 4で長時間℃で保存</li><li>使用前に、60℃ですべてのリン酸緩衝液および水和ハイドロキシアパタイトを平衡化</li></ol> 2。エコノ-カラムの準備<ol><li>コックを閉じます。繰り返し列を反転し、デカンテーションによって脱イオンH 2 Oでカラムを数回すすいでください。 </li><li>エコノ-カラムから活栓を取り外し、滅菌するためにカラムをオートクレーブ。 </li><li>交換して、コックを閉じてください。エコノ-カラム滅菌とコート、すべてのガラスの表面にSigmacoteの1mlを追加します。コックとデカントを開きます。 </li><li>循環水浴にカラムを取り付け、60に温度を℃に設定このようなアルミ箔または発泡パイプの断熱材などの絶縁剤でカラムをラップ列全体に熱損失の最小量をeinsureすることをお勧めします。 </li><li>滅菌、RNaseフリーの0.12Mリン酸緩衝液で2回その後滅菌、RNaseフリーのH 2 Oで二回エコノ-カラムを洗浄します。 </li></ol> 3。 Hydroxypaptiteクロマトグラフィ<ol><li>コックが閉じていることを確認し、徐々に滅菌2ミリリットル血清ピペットを使用してエコノ-カラムの底部に事前に準備、再懸濁したアパタイトの2ミリリットルを追加します。 </li><li>ハイドロキシアパタイトは、30分間重力の力で解決することができます。 </li><li>列と密接なコックからバッファをドレイン。 60℃ヒートブロックまたは水浴で10分間。における500μlのインキュベートの最終容量に0.12Mリン酸緩衝液と核酸を結合する</li><li>すぐに列を乱さないように確実に2ミリリットル血清ピペットを用いてハイドロキシアパタイトに0.12Mリン酸緩衝液で調製された核酸を適用します。 </li><li>核酸は30分間ハイドロキシアパタイトに結合することができます。 </li><li>列の下に15ミリリットルチューブを置き、栓を開き、ssDNAを含む最初のサンプルを収集する。コックを閉じます。 </li><li> 、列を乱すストップコックを開き、前のステップから15ミリリットルチューブで一本鎖DNAを収集することではないことを確認してハイドロキシアパタイトに0.12Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを追加。コックを閉じます。 </li><li>フェノール：クロロホルム：1容量の追加チューブにイソアミルアルコール（25:25:1、V / v / v）溶液を、精力的にミックスし、15分間3500 × gで遠心。新しい15ミリリットルチューブに上清を含むssDNAを転送する。 </li><li> eに0.20Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを用いて3.76と3.87を繰り返します。リュートとコレクションのために新たな15ミリリットルチューブを使用することを確認して列からRNAを精製する。 </li><li>コレクションのために新しい15ミリリットルチューブを使用することを確認して列から二本鎖DNAを溶出し、精製する0.40Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを用いて3.76と3.87を繰り返します。 </li><li>コレクションのために新しい15ミリリットルチューブを使用して確実に残存するdsDNAの列を除去する1.00Mリン酸緩衝液の6ミリリットルを用いて3.76と3.87を繰り返します。 </li></ol> 4。核酸サンプルを脱塩<ol><li> 3万分子量を装備したアミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスへのサンプルの4〜5ミリリットルの転送はUltracel膜を切断。 </li><li> 6000 × gで、30 °アングルローターでC、5分（または濃縮されたボリュームが達成されるまで）で回転させて&lt;​​500μLにサンプルを集中する。フロースルーを捨てます。 </li><li>アミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスにサンプルの残りの部分（s）を追加し、RNaseフリー1 × TEバッファーで4〜5ミリリットルにボリュームを起動します。 </li><li> 6000 × gで、30 °アングルローターでC、5分（または濃縮されたボリュームが達成されるまで）で回転させて&lt;​​500μLにサンプルを集中する。フロースルーを捨てます。 </li><li>アミコンウルトラ-4遠心フィルターデバイスにRNaseフリー1 × TEバッファーの4〜5ミリリットルを追加。 6000 × gで、30 °アングルローターでC、5分（または濃縮されたボリュームが達成されるまで）で遠心分離することによって&lt;500μLにサンプルを集中する。フロースルーを捨てます。 </li><li>完全に核酸サンプル（s）を脱塩するために、ステップ4.5の追加の5回を繰り返します。 </li><li>滅菌1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに、残りのサンプル（s）を転送する。 10分の1の体積の3M酢酸ナトリウム、pH 7.0の、100％の2倍量のエタノール、及びGlycoblueの1μlを追加します。ボルテックスでよく混ぜる。 </li><li> 28000 × gで、4℃、60分間遠心する。デカントは、ペレットを妨害しないことを確認して。 70％エタノール300μlを追加。 28000 × gで、10分間室温でスピン。 、デカント乾燥およびRNaseフリーのTEバッファーの適切な量で各画分を懸濁します。 </li></ol> 5。代表的な結果： 図1は、混合ウイルスの集合体から分画するのssDNA、dsDNAをし、RNA核酸にハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用するための提示方法をまとめたものです。このメソッドは、核酸の負に荷電したリン酸骨格と正に荷電したのCa 2の間の電荷の相互作用を活用して+イオンがハイドロキシアパタイトに存在すると増加するリン酸緩衝液の濃度で核酸のサブタイプの効率的な分画（ssDNAのは、dsDNAやRNA）を可能に12。 既知のssDNA（M13mp18）は、dsDNA（ラムダ）とRNA（MS2とphi6）ウイルスゲノムの in vitroでの&quot;コミュニティ&quot; でのハイドロキシアパタイト分別を図2に示されています。核酸は、同じ濃度で結合ハイドロキシアパタイトカラムに適用し、リン酸緩衝液の濃度の増加を用いて溶出させたていた。各核酸のサブタイプが9％以下が次の1つの画分からキャリーオーバーで互いに独立して溶出する。 チェサピーク湾から採取したウイルスのコミュニティから単離された核酸にこの技術の応用を図3に示されています。精製ウイルスから単離した全核酸の収量がハイドロキシアパタイトカラムに適用された。 ssDNAは、RNAおよび二本鎖DNAから成るゲノム材料を独立してそれぞれ0.12M、0.20M及びリン酸緩衝液の0.40M/1.00M濃度で溶出した。二本鎖DNAは、0.40Mと1.00Mのリン酸濃度で溶出し、このケースでは、ssDNAはとRNA遺伝子型に比べてこのウイルスのコミュニティを支配している。この観察は、回復可能な核酸の大半はdsDNAを13である海洋および河口環境の予想されるウイルスの群集組成と一致している。 <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="図1"/> 核酸の分画のためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法の図1。フロー図。 0.12Mリン酸緩衝液で調製されたssDNAを、二本鎖DNAとRNAの混合物を60℃に加熱し、一定の60℃に維持ハイドロキシアパタイトカラムに適用されます℃の循環水浴を使用して。核酸（ssDNAは、RNAおよび二本鎖DNA）はリン酸塩を含む緩衝液の濃度の増加とともにハイドロキシアパタイトから溶出される。この図は、微生物学のアメリカの社会からの許可を得て複製されており、もともとアンドリュース- Pfannkochらで紹介されました。 2010 12。 <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて既知のウイルス核酸の分離。 M13mp18 ssDNAは、MS2 ssRNA、phi6 dsRNA及びラムダ鎖DNA（それぞれレーン2-5、）の等しい濃度を組み合わせて（レーン6）およびハイドロキシアパタイトカラムに適用した。 Singl電子本鎖DNA（M13mp18）、RNA（MS2/phi6）とdsDNA（ラムダ）は独立して0.12M（レーン8）、0.18M（レーン9）と0.40M/1.00M（レーン10）を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出した。 1キロバイトラダー（レーン1、7）ゲノムサイズを確認するために使用されていました。この図は、微生物学のアメリカの社会からの許可を得て複製されており、もともとアンドリュース- Pfannkochらで紹介されました。 2010 12。 <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。チェサピーク湾の中でコミュニティから分離されたウイルス核酸の分離。核酸を単離し、ハイドロキシアパタイトカラムに適用した。 ssDNAは（レーン0.12M）、RNA（レーン0.20M）及びdsDNAが（レーン0.40M/1.0M）独立してそれぞれ、0.12M、0.20Mと0.40M/1.00Mのリン酸緩衝液の濃度を用いて溶出した。ハイマスDNAラダー（レーンL1）および1キロバイトラダー（レーンL2）は、視覚的に核酸のおおよその分子量と質量を確認するために使用されていました。この図は、微生物学のアメリカの社会からの許可を得て複製されており、もともとアンドリュース- Pfannkochらで紹介されました。 2010 12。

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	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの手法は、目的は社会の総核酸組成を研究する場合の混合ウイルスの集合体からの核酸の分画のための非常に効率的かつ堅牢なツールです。一般的に、ssDNAを、RNAおよび二本鎖DNAは約〜0and 0.40Mそれぞれより大きい列フォーリン酸塩緩衝液の濃度から溶出されます。それが既知の核酸（耕作ウイルス調製からなど）を使用して?...

<table border="1"><tbody><tr><th>材料名</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>エコノ-カラム</td><td> Bio - Rad社</td><td> 737-0717 </td><td> 0.7センチメートルIDのパッケージ/ 2 </td></tr><tr><td>ヒドロキシアパタイト</td><td> Bio - Rad社</td><td> 130-0520 </td><td> DNAグレードバイオジェルHTPジェル、100g/td&gt; </tr><tr><td>リン酸ナトリウム、一塩基性</td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td>一水和物、クリスタル500グラム</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性</td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td>無水、パウダー500グラム</td></tr><tr><td> DEPC処理水</td><td>インビトロジェン</td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10％SDS溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 24730-020 </td><td>超高純度、1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> AM9262 </td><td> pHは8.0、1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ミリリットル血清学的pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td>ポリスチレン、滅菌</td></tr><tr><td> BDファルコン遠心管</td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ミリリットル、滅菌</td></tr><tr><td>フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、V / V / V） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15593-031 </td><td>超高純度、100ミリリットル</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4遠心装置</td><td>ミリポア</td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel - 30膜</td></tr><tr><td> 20X TEバッファー、RNaseフリー</td><td>インビトロジェン</td><td> T11493 </td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td>インビトロジェン</td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

ウイルス、特にバクテリオファージは（ファージ）、地球1,2上で最も多くの生物学的実体である。ウイルスは宿主細胞の表現型を変更する、栄養素の循環に寄与する、宿主細胞の豊富さと多様性を調節し、そして遺伝子の3の水平伝達を介して宿主細胞とウイルスの両方のコミュニティの進化に影響を与える。多くの研究は、自然環境の様々なウイルスやその機能性の驚異的な遺伝的多様性を強調している。 メタゲノムの手法は、分類学的多様性とメンバー一本鎖DNA（ssDNA）、二本鎖DNA（dsDNA）とRNAの遺伝子型4-9含む複雑なウイルス群集の機能的な可能性を研究するために使用されている。環境DNAを含む研究に使用される現在のライブラリー構築のプロトコルまたはRNAを含むウイルスは、10非標的化テンプレートを除去するために、初期ヌクレアーゼ処理を必要とする。しかし、ウイルスのコミュニティとウイルスの多様性の集団遺伝子の補数の包括的な理解には関係なく、ゲノム構成のすべてのメンバの知識が必要です。核酸のサブタイプの精製分画は、コミュニティの遺伝の署名の一部を犠牲にすることなくウイルスの集合体を研究することによって効果的なメカニズムを提供します。 ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウムの結晶形は、1960年代11日以来、核酸、ならびにタンパク質や微生物の分離に用いられている。ハイドロキシアパタイトと核酸のサブタイプの負に帯電したリン酸骨格の陽性荷電のCa 2 +イオン間の電荷の相互作用を利用することにより、それは優先的に互いに独立してそれぞれの核酸のサブタイプを溶出することが可能です。我々は最近、DNAシークエンシング12の準備にssDNAのは、dsDNAやRNAを含むウイルスの独立画するゲノムにこの戦略を採用。ここで、我々は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィを用いて混合したウイルスの集合体からのssDNA、dsDNAをし、RNAウイルス核酸の分画と回復のための手法を提案する。

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

私たちは、環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分子を分離する効率的な方法を説明します。核酸はリン酸含有緩衝液の濃度の増加とともにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分画する。このメソッドは、環境サンプルからすべてのウイルス核酸の種類の分離を可能にします。

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.5K ビュー.  The J. Craig Venter Institute. 私たちは、環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分子を分離する効率的な方法を説明します。核酸はリン酸含有緩衝液の濃度の増加とともにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分画する。このメソッドは、環境サンプルからすべてのウイルス核酸の種類の分離を可能にします。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Methods Article

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離