وأيد هذا البحث من قبل مكتب العلوم (ديسمبر) ، وزارة الطاقة الأميركية ، أي الاتفاق التعاوني. دي FC02 - 02ER63453 ، المؤسسة الوطنية للعلوم في تسلسل الجينوم الميكروبي برنامج (أرقام 0626826 و 0731916 الجائزة). نشكر جون زجاج لخبرته الفنية والمشورة وK. Wommack اريك لمساعدته في جمع العينات البيئية.

1. إعداد حلول قبل تنفيذ هيدروكسيباتيت اللوني ، يجب أن تكون مستعدة مخازن الفوسفات وهيدروكسيباتيت يجب أن يكون رطب بشكل صحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1M الحل الفوسفات ، ودرجة الحموضة 6.8 : في قارورة 1L حل 119.98g فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة في 1L من العقيمة ، DEPC المعاملة O. 2 H يعد ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم 1M الحل في قارورة 1L بحل 141.96g من الصوديوم فوسفات ثنائي القاعدة في 1L من العقيمة ، DEPC المعاملة O. 2 H الجمع بين والحلول أحادية ثنائي في نسبة 1:1. دورق مكان على طبق من ذهب ويحرك المزيج باستخدام شريط مغناطيسي. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم (زيادة الحموضة) أو حامض الفوسفوريك (لخفض درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.12M العازلة الفوسفات : في القارورة 500ml ، والجمع بين 30ml من محلول فوسفات 1M ، ودرجة الحموضة 6.8 ، 2.5ml من 10 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، و5ml من 0.5M EDTA. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H2O إلى حجم 225ml. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة إلى H2O 250ml. الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.18M العازلة الفوسفات : في القارورة 500ml ، والجمع بين 45ml من محلول فوسفات 1M ، ودرجة الحموضة 6.8 ، 2.5ml من 10 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، و5ml من 0.5M EDTA. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O إلى حجم 225ml. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O ل250ml. الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.20M العازلة الفوسفات : في القارورة 500ml ، والجمع بين 50ml من محلول فوسفات 1M ، ودرجة الحموضة 6.8 ، 2.5ml من 10 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، و5ml من 0.5M EDTA. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O إلى حجم 225ml. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O ل250ml. الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.40 العازلة الفوسفات M : 500ml في قارورة ، والجمع بين الحل 100ML من الفوسفات 1M ، ودرجة الحموضة 6.8 ، 2.5ml من 10 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، و5ml من 0.5M EDTA. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O إلى حجم 225ml. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O ل250ml. الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;الفوسفات 1.00M العازلة&quot; (تركيز الفعلي للفوسفات في هذا الحل هو 0.91 م) : في القارورة 500ml ، والجمع بين 30ml من محلول فوسفات 1M ، pH6.8 ، 2.5ml 10 ٪ من الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) ، و5ml من 0.5M EDTA. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H2O إلى حجم 225ml. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.8. إضافة عقيمة ، DEPC المعاملة H 2 O ل250ml. الأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب هيدروكسيباتيت : وزن خارج 1g من هيدروكسيباتيت وإضافة إلى أنبوب 50ml. إضافة 6ml العازلة من الفوسفات 0.12M إلى هيدروكسيباتيت وعكس إلى المزيج. قبل استخدام جلب الحرارة إلى 60 درجة مئوية وتخلط جيدا. تخزين لفترات طويلة من الوقت في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الاستخدام ، يوازن جميع مخازن الفوسفات وهيدروكسيباتيت رطب في 60 درجة مئوية. </li></ol> 2. إعداد فندق Econo عمود <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق محبس. الشطف مرات عدة مع العمود منزوع الأيونات O 2 H بواسطة عمود عكس مرارا وتكرارا والصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة محبس من العمود ، وفندق Econo الأوتوكلاف العمود لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وإغلاق محبس. إضافة 1ml من Sigmacote إلى العقيمة فندق Econo عمود ومعطف جميع الواجهات الزجاجية. فتح محبس وصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق عمود إلى حمام الماء المتداولة وضبط درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية. einsure لأقل قدر من فقدان الحرارة عبر التفاف العمود العمود في عامل العزل مثل رقائق الألومنيوم أو رغوة العزل الأنابيب الموصى بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف فندق Econo عمود مرتين مع ريبونوكلياز عقيمة خالية من O 2 H ثم مرتين مع ريبونوكلياز عقيمة خالية من الفوسفات 0.12M العازلة. </li></ol> 3. Hydroxypaptite Chromotography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التأكد من إغلاق محبس ، إضافة ببطء 2ml من هيدروكسيباتيت ، معدة سلفا معلق على الجزء السفلي من العمود فندق Econo باستخدام ماصة معقمة 2ml المصلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للهيدروكسيباتيت الى تسوية في إطار قوة الجاذبية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف العازلة من العمود ومحبس وثيق. الجمع بين الأحماض النووية مع العازلة الفوسفات 0.12M في الحجم النهائي من 500 ميكرولتر واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة أو حرارة حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأحماض النووية بسرعة تطبيق أعد العازلة الفوسفات 0.12M إلى هيدروكسيباتيت باستخدام ماصة 2ml المصلية التأكد من عدم الإخلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الأحماض النووية لربط هيدروكسيباتيت لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب تحت العمود 15ml ، فتح محبس وجمع العينات الأولية التي تحتوي على ssDNA. إغلاق محبس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6ml العازلة من الفوسفات 0.12M هيدروكسيباتيت الى التأكد من عدم الإخلال العمود ، فتح محبس ، وجمع المفرد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي في أنبوب 15ml من الخطوة السابقة. إغلاق محبس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 حجم من الفينول : كلوروفورم : الكحول isoamyl (25:25:1 V / V / V) حل للأنبوب ، ومزيج بقوة الطرد المركزي في 3500 x ج لمدة 15 دقيقة. نقل طاف ssDNA تحتوي على أنبوب 15ml جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكرر 3.76 3.87 باستخدام 6ml العازلة من الفوسفات 0.20M إلى البريدالعود وتنقية RNA من العمود التأكد من استخدام أنبوب جديد لجمع 15ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكرر 3.76 3.87 باستخدام 6ml العازلة من الفوسفات 0.40M لأزل وتنقية dsDNA من العمود التأكد من استخدام أنبوب جديد لجمع 15ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكرر 3.76 3.87 باستخدام 6ml العازلة من الفوسفات 1.00M لتجريد أي عمود dsDNA المتبقية مع التأكد من استخدام أنبوب جديد لجمع 15ml. </li></ol> 4. تحلية عينات الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 4 - 5ml من العينة إلى Amicon الترا - 4 جهاز الطرد المركزي فلتر تجهيزه مع الوزن الجزيئي 30000 قطع غشاء Ultracel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على عينة &lt;500μl من خلال الدوران في XG 6000 ، و 30 درجة مئوية ، و 5 دقائق (أو حتى يتحقق حجم مركزة) في الدوار زاوية ثابتة. تتدفق من خلال تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما تبقى من العينة (ق) الى الترا - 4 Amicon جهاز الطرد المركزي تصفية واعادة ما يصل الى حجم 5ml - 4 مع الخطوط العازلة ريبونوكلياز TE 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على عينة &lt;500μl من خلال الدوران في XG 6000 ، و 30 درجة مئوية ، و 5 دقائق (أو حتى يتحقق حجم مركزة) في الدوار زاوية ثابتة. تتدفق من خلال تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 - 5ml الحرة ريبونوكلياز الاحتياطي TE 1X إلى الترا - 4 Amicon تصفية جهاز الطرد المركزي. التركيز على عينة &lt;500μl بواسطة الطرد المركزي في 6000 XG و 30 درجة مئوية ، و 5 دقائق (أو حتى يتحقق حجم تتركز) في الدوار زاوية ثابتة. تتدفق من خلال تجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.5 إضافي إلى 5 مرات تماما desalt عينة حمض النووي (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات المتبقية (ق) إلى أنبوب العقيمة إيبندورف 1.7ml. إضافة 1/10th خلات الصوديوم 3M الحجم ، ودرجة الحموضة 7.0 ، مجلدين من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و1μl من Glycoblue. مزيج جيد من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 28000 XG ، 4 درجات مئوية ، و 60 دقيقة. صب التأكد من عدم تعكير صفو بيليه. إضافة 300μl من الايثانول 70 ٪. تدور في درجة الحرارة XG 28000 غرفة ، لمدة 10 دقيقة. صب جاف وresuspend كل جزء في حجم مناسب لTE ريبونوكلياز عازلة خالية. </li></ol> 5. ممثل النتائج : الشكل 1 يلخص أساليب تقديمها للاستخدام اللوني هيدروكسيباتيت الى ssDNA يجزئ ، dsDNA والأحماض النووية RNA فيف من فيروسية متفاوتة. هذا الأسلوب يستغل التفاعل بين المسؤول العمود الفقري الفوسفات سالبة الشحنة من الأحماض النووية والكالسيوم الموجبة الشحنة 2 + الأيونات الموجودة في هيدروكسيباتيت ويسمح للتجزيء كفاءة فرعية الحمض النووي (ssDNA ، وdsDNA RNA) مع زيادة تركيزات الفوسفات عازلة 12. وتجزيء هيدروكسيباتيت لفي &quot;المجتمع&quot; المختبر ssDNA المعروفة (M13mp18) ، dsDNA (لامدا) والحمض النووي الريبي (MS2 وphi6) ويتضح الجينوم الفيروسي في الشكل 2. تم الجمع بين الأحماض النووية في تركيزات متساوية ، تطبق على العمود هيدروكسيباتيت وكانت eluted باستخدام زيادة تركيز الفوسفات عازلة. كل سلالة الحمض النووي elutes مستقلة عن الآخرين مع أقل من 9 ٪ المرحل من جزء لآخر. ويظهر تطبيق هذه التقنية على الأحماض النووية معزولة عن المجتمع الفيروسية التي تم جمعها من خليج تشيسابيك في الشكل 3. طبق مجموع العائد الحمض النووي الفيروسات المعزولة من المنقى إلى العمود هيدروكسيباتيت. وكان eluted مستقلة تتكون من مواد الجينومية ssDNA ، RNA وdsDNA مع 0.12M ، 0.20M وتركيزات الفوسفات 0.40M/1.00M من العازلة على التوالي. هو eluted الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في تركيزات الفوسفات من 0.40M 1.00M وو في هذه الحالة ، يهيمن على هذا المجتمع الفيروسية مقارنة الحمض النووي الريبي ssDNA والمورثات. هذه الملاحظة بما يتفق مع تركيبة المجتمع الفيروسية المتوقعة من البيئات البحرية ومصبات الأنهار حيث الغالبية من الأحماض النووية القابلة للاسترداد وdsDNA 13. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> رسم تخطيطي للتدفق الرقم 1. الأسلوب اللوني هيدروكسيباتيت للتجزئة من الأحماض النووية. يتم تسخين مزيج من ssDNA ، والجيش الملكي النيبالي dsDNA أعد العازلة الفوسفات 0.12M إلى 60 درجة مئوية ، وتطبيقها على عمود هيدروكسيباتيت حافظت على 60 درجة مئوية ثابتة باستخدام حمام ماء المنتشرة. وeluted الأحماض النووية (ssDNA ، RNA وdsDNA) من هيدروكسيباتيت مع زيادة تركيزات الفوسفات عازلة المحتوية. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من الجمعية الأميركية لعلم الأحياء المجهرية وكانت واردة أصلا في اندروز ، وآخرون Pfannkoch. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. فصل الأحماض النووية الفيروسية المعروفة باستخدام اللوني هيدروكسيباتيت. تم الجمع بين تركيزات متساوية من ssDNA M13mp18 ، ssRNA MS2 ، والرنا المزدوج الجديلة phi6 امدا dsDNA (الممرات 2-5 ، على التوالي) (حارة 6) وتطبيقها على عمود هيدروكسيباتيت. Singlوeluted مستقل ه الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (M13mp18) ، رنا (MS2/phi6) وdsDNA (لامدا) من العمود هيدروكسيباتيت باستخدام 0.12M (حارة 8) ، 0.18M (ممر 9) و0.40M/1.00M (ممر 10) . واستخدمت سلم 1KB (حارات 1 ، 7) لتأكيد أحجام الجينوم. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من الجمعية الأميركية لعلم الأحياء المجهرية وكانت واردة أصلا في اندروز ، وآخرون Pfannkoch. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. فصل الأحماض النووية الفيروسية المعزولة من المجتمع داخل خليج تشيسابيك. وقد تم عزل الأحماض النووية وتطبيقه على عمود هيدروكسيباتيت. وeluted مستقل ssDNA (حارة 0.12M) ، رنا (حارة 0.20M) وdsDNA (حارات 0.40M/1.0M) باستخدام تركيزات الفوسفات عازلة لل0.12M ، 0.20M و0.40M/1.00M ، على التوالي. واستخدمت مرحبا سلم DNA قداس (حارة L1) وسلم 1KB (حارة L2) لتأكيد بصريا الوزن الجزيئي التقريبي والشامل من الأحماض النووية. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من الجمعية الأميركية لعلم الأحياء المجهرية وكانت واردة أصلا في اندروز ، وآخرون Pfannkoch. 2010 12.

<ol>
	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

منهجية اللوني هيدروكسيباتيت المقدمة هنا هي أداة فعالة للغاية وقوية للتجزئة من الأحماض النووية من تجمعات مختلطة الفيروسية ، عندما يكون الهدف هو دراسة التركيب مجموع الحمض النووي للمجتمع. عموما ، سوف ssDNA ، RNA وdsDNA أزل من العمود تركيزات الفوسفات العازلة بو أكبر من م?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم المادة </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> رقم كتالوج </th></tr><tr><td> فندق Econo عمود </td><td> الحيوي راد </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm الحزمة رقم / 2 </td></tr><tr><td> هيدروكسيباتيت </td><td> الحيوي راد </td><td> 130-0520 </td><td> الحمض النووي الصف بيو جل جل HTP ، 100g/td&gt; </tr><tr><td> فوسفات الصوديوم ، أحادي القاعدة </td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td> مونوهيدرات ، كريستال 500G </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدة </td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td> اللامائية ، مسحوق 500G </td></tr><tr><td> DEPC المياه المعالجة </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10 ٪ SDS الحل </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> عالى النقاء ، 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> سيغما الدريخ </td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml المصلية pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> البوليسترين ، العقيمة </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي فالكون دينار بحريني </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml ، العقيمة </td></tr><tr><td> الفينول : الكلوروفورم : كحول أيزو أميلي (25:24:1 V / V / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> عالى النقاء ، 100ML </td></tr><tr><td> Amicon الترا - 4 جهاز الطرد المركزي </td><td> ميليبور </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel غشاء - 30 </td></tr><tr><td> 20X TE الاحتياطي ، ريبونوكلياز مجانا </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ML </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

الفيروسات والبكتيريا وخاصة (phages) ، هي الأكثر عددا الكيانات البيولوجية على 1،2 الأرض. فيروسات تعدل الخلية المضيفة وفرة وتنوع ، والمساهمة في تدوير المغذيات ، وتغيير النمط الظاهري الخلية المضيفة ، والتأثير في تطور الخلية المضيفة والمجتمعات على حد سواء عن طريق نقل الفيروس من الجينات الوحشي 3. وقد أبرزت دراسات عديدة للتنوع مذهل الوراثية للفيروسات وإمكاناتها الفنية في مجموعة متنوعة من البيئات الطبيعية. وقد استخدمت تقنيات Metagenomic لدراسة التنوع التصنيفي والإمكانات الفنية للتجمعات الفيروسية المعقدة التي تحتوي على احد الاعضاء الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) ، الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA) والتراكيب الوراثية RNA 4-9. البروتوكولات الحالية بناء مكتبة تستخدم لدراسة الحمض النووي التي تحتوي على الحمض النووي الريبي البيئية أو التي تحتوي على الفيروسات تتطلب علاجا nuclease الأولية من أجل إزالة القوالب nontargeted 10. ومع ذلك ، فهم شامل لتكملة الجين الجماعية للمجتمع والتنوع الفيروس الفيروس يتطلب معرفة جميع الأعضاء بغض النظر عن تركيبة الجينوم. تجزيء من المنقى فرعية الحمض النووي يوفر آلية فعالة يمكن من خلالها دراسة تجمعات الفيروسية دون التضحية مجموعة فرعية من توقيع المجتمع الجينية. واستخدمت هيدروكسيباتيت ، شكل بلوري من فوسفات الكالسيوم ، في فصل الأحماض النووية ، فضلا عن البروتينات والميكروبات ، ومنذ 11 من 1960s. من خلال استغلال التفاعل بين المسؤول كا المشحون إيجابيا 2 + الأيونات من هيدروكسيباتيت والعمود الفقري الفوسفات سالبة الشحنة من الأنواع الفرعية الحمض النووي ، فمن المحتمل أن كل سلالة تفضيلي أزل الحمض النووي مستقلة عن الآخرين. نحن العاملين في الآونة الأخيرة لهذه الاستراتيجية في الجينوم يجزئ مستقل عن ssDNA ، dsDNA والفيروسات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في إعداد تسلسل الحمض النووي 12. هنا ، فإننا نقدم وسيلة للتجزيء والتعافي من الأحماض ssDNA ، والحمض النووي الريبي النووي dsDNA الفيروسية من تجمعات مختلطة الفيروسية باستخدام chromotography هيدروكسيباتيت.

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography at JoVE.com

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

نحن تصف وسيلة فعالة لفصل واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وجزيئات الحمض النووي الريبي الفيروسي من المجتمعات البيئية. الأحماض النووية هي مجزأة باستخدام اللوني هيدروكسيباتيت مع زيادة تركيزات الفوسفات التي تحتوي على مخازن. هذا الأسلوب يسمح للعزل جميع أنواع الحمض النووي الفيروسي من العينات البيئية.

فصل واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والحمض النووي الريبي من جالية الفيروسية البيئة باستخدام الكروماتوغرافيا هيدروكسيباتيت

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

separation-single-stranded-dna-double-stranded-dna-rna-from-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

31.4K Views.  The J. Craig Venter Institute. نحن تصف وسيلة فعالة لفصل واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وجزيئات الحمض النووي الريبي الفيروسي من المجتمعات البيئية. الأحماض النووية هي مجزأة باستخدام اللوني هيدروكسيباتيت مع زيادة تركيزات الفوسفات التي تحتوي عل?...

Video: Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

تطوير خلية من نوع معين الأبتامرات gp120 المضادة لفيروس الإيدز لتسليم سيرنا

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

متوسط ​​الفيروسية مغلف جلايكوبروتين المسامير من الكترون Cryotomography إعادة بناء باستخدام Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

تطوير نظام تسليم الاقتصادية DNA من قبل &quot;Acufection&quot; وتطبيقه لبحوث الجلد

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.