このプロジェクトは、E.ジョリーに提供されるケースウェスタンリザーブ大学のスタートアップ資金によって賄われていた。感染したカタツムリは住血吸虫リソースセンター、NIH - NIAID（NIAID契約番号HHSN272201000009I）により提供された。我々はまた、感染した住血吸虫カタツムリを確保し、有用な議論のためのサポートのためにクリスキングとロナルドブラントンに感謝。

安全対策： 住血吸虫セルカリアは直接カットや毛穴のニーズなく皮膚に浸透する、と慢性疾患の住血吸虫症を引き起こす可能性があります。S.マンソンは、バイオセーフティレベル2微生物であり、そのため感染のセルカリアで作業する場合、適切な個人用保護具と適切な安全対策に従う必要があります。住血吸虫の成長と変革するために必要な機材のほとんどは、プロトコルの末尾の表に記載されているいくつかの重要な例外を除いて、標準です。すべてのセルカリアの仕事は、隔離された部屋で行われるべきです。 Schistosomulesは、滅菌、承認されたバイオセーフティフードで培養する必要があります。実験用の上着、靴、穴や涙なしのパンツ、そして手首と腕用の防水スリーブプロテクタの防水ペアが必要として、ニトリルやラテックス手袋の二層は、着用してください。偶発的な流出の場合には、すぐにあなたの人になら、激しくこすり、70％エタノールまたは10％漂白剤で汚染されたエリアをスプレー。これは、寄生虫を無効にして十分ですが、すべての可能な感染症が報告され、真剣に取られるべきである。 schistosomulesが本質的に感染性はないが、制度的なガイドラインは変わる、とBSL2注意が非感染性の生命の段階で必要とされているかどうかを決定するために調べられるべきである。実験が行われ、承認バイオハザード容器に廃棄物を廃棄された後に感染性物質と接触するすべての表面を消毒する。 注記：カバーのカタツムリのホストのビン1〜2日前に捨て、光から保護するために 1。カタツムリのホストからセルカリアを収穫<ol><li>室温に蒸留水で半分フル洗剤の自由なきれいな、500ミリリットルビーカーを埋める。別の日にmiracidiumの複数形に感染したホストのカタツムリで作業する場合、（カタツムリが将来の実験のために再利用される場合、これは特に重要です）それぞれの感染の日付ごとに別々のビーカーを使用してください。ビーカーの大きさはまたユーザーの経験に応じて小さくすることができます。 </li><li>あなたが当てると慎重に、必要に応じて標準的な観賞魚ネットと汎用の鉗子を用いてビーカーにそれらを堆積する感染カタツムリのホストを収集する。 </li><li>緊急時の流出の上に置いてビーカーは白熱光源の下に約8〜12インチをトレイ。光の下で1-2時間放置する。明るい光にさらされるとセルカリアは、カタツムリのホストを終了します。 </li><li>慎重にセルカリアの混合物からカタツムリを除外。混合物は非常に感染であるため、余分な安全予防策を講じる。 忘れないで、セルカリアは直接人間の皮膚に浸透することができます！ </li><li>任意の粒子の廃棄物が解決できるように、約15分間の光源下で混合物を交換してください。 </li><li>ビーカーの底に破片を避け、ピペットを用いてきれいな三角フラスコにセルカリアを転送します。 60分、セルカリアが一角に定着できるようにすること - 45のための暗所で氷上で約45 °の角度でフラスコを置きます。 </li><li>上清の75〜90％を除去し、10％の漂白剤または70％エタノールを入れたビーカーにそれを預ける、水滴がピペットからセルカリアのドリップを含むように注意しながら、50 mLのピペットを使用してください。 </li><li>スワール三角フラスコは、溶液中のセルカリアを再懸濁させる優しくセルカリアを含む。滅菌50 mlコニカルチューブにサンプルを転送するためにピペットを使用してください。暗所で20分間氷上で再びチューブを置きます。セルカリアは暗闇の中でチューブの底に向かって沈殿します。 </li></ol> 2。 schistosomulesにセルカリアの手動変換 作業を始める前に：RPMI 1640で完了（RPMI、5％ウシ胎児血清、1 ×ペン/連鎖球菌）と37℃まで暖かくしてください（これは、住血吸虫は、補完するように注意を払う必要があるとして使用されるウシ胎児血清で1時間インキュベーション56℃で不活性化されていることが重要です）。 <ol><li>バイオハザードフードでは、ピペッターまたは真空装置を使用して、各50 mlコニカルにおけるソリューション5〜10mlにダウン上清を取り除く。 </li><li>適切なサイズのシリンジに22ゲージダブルエンド、ルアーロック乳化針を取り付けます。 </li><li>ゆっくりと注射器に混合物を描く。シリンジ内のすべての50 mlチューブからセルカリアを収集する。滴下の気配りである。 </li><li>慎重にアタッチされていない針の端が上になるように上の注射器を回します。乳化針のこの側面に別のシリンジを取り付けます。 </li><li>セルカリアを変換するために針を通して40倍（20倍前後に）の合計を混合して渡す。 </li><li>混合物が底の注射器に含まれており、トップシリンジが空であることを垂直にそのような注射器を置きます。トップシリンジを外し、70％エタノールで消毒。 </li><li>きれいな高い壁に囲まれた100ミリメートルx 50mmのパイレックスの皿または結晶皿の中にドロップによる預金の混合物をドロップ。 70％エタノールで針と注射器を消毒する。 </li><li> 37℃のRPMI 1640完全なメディアがそのようなこと追加ルリアブロスプレートを注ぐかのようにペトリ皿の底は完全に、覆われている。 </li><li>ペトリ皿の中央にschistosomulesを収集するために穏やかに渦巻く。水はねを避ける。 注：これは、より適切に中央にschistosomulesを視覚化するこのステップのためにボンネットのライトをオフにすると便利かもしれません。 </li><li>直ちに滅菌スポイトを使用しても新鮮な12ウェル細胞培養プレートに集中schistosomulesを入金。 </li><li> schistosomulesが皿の中心（約10倍）で、もはや存在しなくなるまで、2.9、2.10繰り返します。新鮮なだけでなく後続の各コレクションを入金。 </li><li>よく、最大半分（〜1.5 mL）に温めておいたRPMI完全培地でそれぞれを埋める。 </li><li> schistosomulesとセルカリアの不在の存在を確認するために倒立顕微鏡で視覚化する。 </li><li>成長するCO 2インキュベーターでschistosomulesは37に設定されて℃、5％CO 2。 </li></ol> 3。代表的な結果： 培養培地に変換schistosomulesの転送、保留中、反転明視野顕微鏡（例えば、機器の表を参照）の下で可視化は、変換schistosomulesがよく中に存在する1を、図に類似した画像を生成する必要があります。潜在的な汚染物質がそのままセルカリア、切断セルカリア尾、または他の破片を含めることができます。は倒立顕微鏡が利用できない場合は、標準的な顕微鏡あるいは解剖スコープはschistosomulesを可視化するために十分であろう。この手順は常にセルカリアの100％を変換しないことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：変換された幼住血吸虫<img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：セルカリアと断絶された尾

<ol>
	<li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li><li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis+and+water+resources+development:+systematic+review,+meta-analysis,+and+estimates+of+people+at+risk.">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li><li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis.">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li><li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection:+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis.">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li><li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae:+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology.">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li><li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+within+host+tissues:+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration.">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li><li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni.">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li><li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+cercarial+responses+to+irradiance+changes.">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li><li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula,+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum.">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li><li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes.">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li><li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing.">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li><li>Yoshino, T. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+(Bge)+cells.">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li><li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules.">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li><li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll.">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li><li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosoma+mansoni:+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules.">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

いくつかの潜在的な問題は、変換手順の実行中に発生する可能性がありますが、このプロトコルは、これらの問題のほとんどを回避するために設計されています。つの潜在的な危険は、通常、ステップ1.3の収穫から残っている破片のために生じた乳化針の目詰まりです。ステップ1.5で解決すると、ステップ1.6で慎重にセルカリアを転送するすべての粒子状物質は、この問題を回避できるようにしてください。また、のような生物学的安全キャビネット内部の作業、前に説明した、個人用保護具の使用（さえフェイスシールド）と注射器の過度の圧力の回避が望ましい。 切り離されたセルカリア尾は、ステップ2.9の間に貧困層の分離の指標である、メディアで視覚化することができます。尾は、痙攣のような動きを示すと（図2を参照）異なる形状を有し、そしてマンドリーバschistosomulesと簡単に区別できます。尾はschistosomulesが解決できるように完全RPMIを超えるschistosomulesを洗浄することによって除去することができます。尾はフローティングのままとなり、オフバキュームすることができます。 無傷のセルカリアがメディアに存在する場合、ステップ2.5での変換が正しく実行されませんでした。無傷のセルカリアの画像は参考のため図3bに示されている。この問題が発生した場合は、使用されている乳化剤針が適切なサイズであることを保証する。 40倍が一般的に十分なセルカリア尾の100％のせん断にアプローチするよりもはるかに多くのですがまた、セルカリア混合物が針を通過する回数は、増加することができます。 schistosomulesにセルカリアの転換は、最初のコリーとWikel（13）によって1974年に記述されていた。それ以来、schistosomulesの調製は、このプロトコルで説明されているように、針と注射器との併用でもせん断戦略を使用して、またはボルテックスアプローチを使用し、パーコールの勾配（14、15）で区切ったり、本論文で示すように渦巻いて行われてきました。準備schistosomulesのためのこれらの2つのテクニックは、美しくフレッドルイス（16）によって記述されており、長期的な成長のためのschistosomulesのさらなる培養のための詳細については、NIAID住血吸虫リソースセンター（で見つけることができます<a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto - resource.org</a> ）。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> 22グラムX 2-7/8&quot;乳化針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14から825 - 17G </td></tr><tr><td> RPMI 1640培地1X（500ミリリットル） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11835030 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS）熱不活化</td><td>インビトロジェン</td><td> 10082139 </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15070063 </td></tr><tr><td>結晶皿（100ミリメートル） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 08 - 741D </td></tr><tr><td>汎用ピンセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 10 - 316C </td></tr><tr><td>ブラインシュリンプのためのペトコ水族館ネット</td><td>ペトコ</td><td> SKU：1190954 </td></tr></tbody></table>

cercarial transformation and in vitro cultivation of schistosoma mansoni schistosomules

住血吸虫寄生虫は住血吸虫症の原因物質、世界的に2億人以上の人々に影響を与え、公衆衛生と社会経済的インパクト（1-4）の点では寄生虫疾患の中でマラリアに次ぐ慢性的に衰弱させる病気です。住血吸虫寄生虫は自由遊泳性の段階が介在すると軟体動物と哺乳類宿主における寄生生活の間で交換する複雑な生活環を持つ吸虫ワームです。簡単に言えば、自由遊泳性のセルカリアはschistosomulesに変換、セルカリアは彼らの尾を失い、その間、分泌されるプロテアーゼの助けを借りて、皮膚を​​貫通することによって哺乳動物宿主に感染する。 schistosomulesは、宿主免疫システムを回避する赤血球の消化のための腸を開発し、移行する必要がありますしかし、肺および肝門脈系の最終的な宛先に向かう途中門脈循環および最終的に腸間膜静脈（S.マンソン用）ここで、男性と女性のワームのペアとチームメイト、毎日卵の何百もの生産。卵の一部は、自由遊泳miracidiumの複数形（5-10）に卵の孵化新鮮な水、体内から排泄される。 miracidiumの複数形は、特定のカタツムリの種に感染し、順番に、ライフサイクルを完了、感染のセルカリアを生み出す母と娘sporocysts、変身。残念ながら、全体の住血吸虫のライフサイクルは 、in vitro で培養することはできませんが、感染性のセルカリアはschistosomulesに変換することができる、とschistosomulesは、 インビトロまたはマイクロアレイ解析における住血吸虫開発の分析のために週間培養することができます。このプロトコルでは、我々はセルカリア変換とschistosomules の in vitro培養での視覚的な説明を提供します。私たちは、カタツムリのホストビオンファラリア属のglabrataから感染セルカリアを当てると手動で乳化両頭針を使用して尻尾を切り離して、schistosomulesに変換すれば良い。 体外セルカリア変換とschistosomules培養技術で 、住血吸虫の可視化を簡素化し、実験的な分析のために寄生虫の収集を容易に。vitroでの変換と住血吸虫の培養技術で年間行われている哺乳動物宿主、（11の使用を避ける説明12）が、コミュニティ全体で利用できる開発されている視覚的なプロトコル。

Watch this Scientific Journal Video about Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules at JoVE.com

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

我々は、説明<em&gt; in vitroで</em扁形動物寄生虫の培養schistosomulumの複数形のための&gt;方法<em&gt;マンソン住血吸虫</em&gt;、淡水カタツムリ中間のホストビオンファラリア属のglabrataから感染セルカリアの収穫とトランスフォーメーションによる。

セルカリア変換と in vitroで</emの>栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

cercarial-transformation-vitro-cultivation-schistosoma-mansoni

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

18.0K ビュー.  Case Western Reserve University. 我々は、説明 in vitroで方法マンソン住血吸虫、淡水カタツムリ中間のホストビオンファラリア属のglabrataから感染セルカリアの収穫とトランスフォーメーションによる。

ビデオ: Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

から卵を使用して、<em&gt;マンソン住血吸虫</em&gt;として<emインビボ&gt;</em蠕虫によって誘発される肺の炎症の&gt;モデル

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

免疫・感染学

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

質量分離と人間住血吸虫マンソン住血吸虫の Intramolluscan の段階の体外培養

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

発生生物学

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm harbored in the intestine of canines. There is an urgent need for applied genetic research to understand the mechanisms of pathogenesis and disease control and prevention. However, the lack of an effective gene evaluation system impedes direct interpretation of the functional genetics of cestode parasites, including the Echinococcus species. The present study demonstrates the potential of lentiviral gene transient transduction in the metacestode and strobilated forms of E. granulosus. Protoscoleces (PSCs) were isolated from hydatid cysts and transferred to specific biphasic culture media to develop into strobilated worms. The worms were transfected with harvested third-generation lentivirus, along with HEK293T cells as a transduction process control. A pronounced fluorescence was detected in the strobilated worms over 24 h and 48 h, indicating transient lentiviral transduction in E. granulosus. This work presents the first attempt at lentivirus-based transient transduction in tapeworms and demonstrates the promising outcomes with potential implications in experimental studies on flatworm biology.

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

We describe a rapid transient transduction technique in different developmental stages of Echinococcus granulosus using third-generation lentiviral vectors.

エキノコッカス顆粒症のストロビレー化形態の一過性形質導入

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

遺伝学

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of heterogeneous vesicles, whose size range between 40 and 1,000 nm. Accumulated evidence indicated that EVs play important regulatory roles in pathogen-host interactions. A deep understanding of schistosome EVs should provide insights into the mechanisms underlying schistosome-host interactions, enabling development of novel strategies against schistosomiasis. Here, we aim to further study EVs functions in schistosomes by presenting a protocol for the isolation and characterization of EVs from adult Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs were isolated from in vitro culture medium using centrifugation combined with a commercial exosome isolation kit. The isolated S. japonicum EVs (SjEVs) typically possess a diameter of 100 - 400 nm, and are characterized by transmission electronic microscopy and western blotting. The usage of PKH67 dye-labeled SjEVs has demonstrated that SjEVs are internalized by the recipient cells. Overall, our protocol provides an alternative method for isolating EVs from adult schistosomes; the isolated SjEVs may be suitable for functional analysis.

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Here, we present a protocol to describe extracellular vesicles (EVs) isolation in in vitro cultured medium from adult Schistosoma japonicum.

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti. S.&#160;stercoralis is a human-parasitic, skin-penetrating nematode that infects approximately 610 million people, while the rat parasite S.&#160;ratti is closely related to S.&#160;stercoralis and is often used as a laboratory model for S.&#160;stercoralis. Both S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti are easily amenable to the generation of transgenics and knockouts through the exogenous nucleic acid delivery technique of intragonadal microinjection, and as such, have emerged as model systems for other parasitic helminths that are not yet amenable to this technique.
Parasitic Strongyloides adults inhabit the small intestine of their host and release progeny into the environment via the feces. Once in the environment, the larvae develop into free-living adults, which live in feces and produce progeny that must find and invade a new host. This environmental generation is unique to the Strongyloides species and similar enough in morphology to the model free-living nematode Caenorhabditis elegans that techniques developed for C. elegans can be adapted for use with these parasitic nematodes, including intragonadal microinjection. Using intragonadal microinjection, a wide variety of transgenes can be introduced into Strongyloides. CRISPR/Cas9 components can also be microinjected to create mutant Strongyloides larvae. Here, the technique of intragonadal microinjection into Strongyloides, including the preparation of free-living adults, the injection procedure, and the selection of transgenic progeny, is described. Images of transgenic Strongyloides larvae created using CRISPR/Cas9 mutagenesis are included. The aim of this paper is to enable other researchers to use microinjection to create transgenic and mutant Strongyloides.

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

The functional genomic toolkit for the parasitic nematodes Strongyloides stercoralis and Strongyloides ratti includes transgenesis, CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis, and RNAi. This protocol will demonstrate how to use intragonadal microinjection to introduce transgenes and CRISPR components into S.&#160;stercoralis and S.&#160;ratti.

マイクロインジェクションによる ストロンギロイデス 種におけるトランスジェニックとノックアウトの生成

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of Plasmodium deposited by mosquitoes in the skin of vertebrate hosts undergoes a phase of mandatory development in the liver before initiating clinical malaria. We know little about the biology of Plasmodium development in the liver; access to the sporozoite stage and the ability to genetically modify such sporozoites are critical tools for studying the nature of Plasmodium infection and the resulting immune response in the liver. Here, we present a comprehensive protocol for the generation of transgenic Plasmodium berghei sporozoites. We genetically modify blood-stage P. berghei and use this form to infect Anopheles mosquitoes when they take a blood meal. After the transgenic parasites undergo development in the mosquitoes, we isolate the sporozoite stage of the parasite from the mosquito salivary glands for in vivo and in vitro experimentation. We demonstrate the validity of the protocol by generating sporozoites of a novel strain of P. berghei expressing the green fluorescent protein (GFP) subunit 11 (GFP11), and show how it could be used to investigate the biology of liver-stage malaria.

Generating Genetically Modified Plasmodium berghei Sporozoites

Malaria is transmitted through inoculation of the sporozoite stage of Plasmodium by infected mosquitoes. Transgenic Plasmodium has allowed us to understand the biology of malaria better and has contributed directly to malaria vaccine development efforts. Here, we describe a streamlined methodology to generate transgenic Plasmodium berghei sporozoites.

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

Malaria is a deadly disease caused by the parasite Plasmodium and is transmitted through the bite of female Anopheles mosquitoes. The sporozoite stage of ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Echinococcus granulosusからの小さな細胞外小胞の単離と樹状細胞の取り込み

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

生物学

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

セルカリア変換と in vitroで栽培マンソン住血吸虫* Schistosomules*

要約

さらに動画を探す

この動画の章

から卵を使用して、

質量分離と人間住血吸虫マンソン住血吸虫の Intramolluscan の段階の体外培養

エキノコッカス顆粒症のストロビレー化形態の一過性形質導入

使用

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

マイクロインジェクションによるストロンギロイデス種におけるトランスジェニックとノックアウトの生成

遺伝子組換えマラリア原虫ベルヘイ・スポロゾイトの生成

Echinococcus granulosusからの小さな細胞外小胞の単離と樹状細胞の取り込み

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

熱帯熱マラリア原虫人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

セルカリア変換と in vitroで栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

要約

さらに動画を探す

この動画の章

から卵を使用して、

質量分離と人間住血吸虫マンソン住血吸虫の Intramolluscan の段階の体外培養

エキノコッカス顆粒症のストロビレー化形態の一過性形質導入

使用

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

マイクロインジェクションによる ストロンギロイデス 種におけるトランスジェニックとノックアウトの生成

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

Echinococcus granulosusからの小さな細胞外小胞の単離と樹状細胞の取り込み

ニワトリエイメリア寄生虫の核形成と生体内伝播

熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

セルカリア変換と in vitroで栽培マンソン住血吸虫* Schistosomules*

マイクロインジェクションによるストロンギロイデス種におけるトランスジェニックとノックアウトの生成

遺伝子組換えマラリア原虫ベルヘイ・スポロゾイトの生成

熱帯熱マラリア原虫人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染