エキノコッカス顆粒症のストロビレート形態の一過性トランザクション。我々は、第3世代レンチウイルスベクターを用いたエキノコッカス顆粒症のさまざまな発生段階における迅速な一過性形質導入技術について記載する。嚢胞性エキノコックス症または包虫症は、犬の腸内に生息する小さなサナダムシであるエキノコッカス・グラニュローサスによって引き起こされる最も重要な人獣共通感染症の1つである。
病因や疾患の制御・予防のメカニズムを理解するための応用遺伝子研究が急務となっています。しかし、効果的な遺伝子評価システムの欠如は、エキノコッカス種を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈を妨げる。寄生性扁平虫における遺伝子導入の進歩は、原生動物寄生虫と比較して依然として制限されている。
ウイルス送達システムの使用は、過去20年間に導入遺伝子送達および遺伝子/タンパク質調査のための不可欠なツールとして浮上してきた。そこで我々は、エキノコッカス・グラニュローサスのプロトスコレーシスおよびストロビレーテッドワームへのGFPレポーター遺伝子のレンチウイルス一過性形質導入を評価した。図1は、エキノコッカス・グラニュローサス段階のための研究プロトコールの概略的提示を示す。
1つは、包虫嚢胞の収集である。食肉処理場で日常的に屠殺された自然に感染した羊から肝臓の胞子嚢胞を集める。プロトスコレーシスを吸引する前に、滅菌ガーゼと70%アルコールを使用して嚢胞表面を完全に滅菌する。
20 ~ 50 mL の包虫液を吸引して、滅菌した 50 mL の円錐形チューブに入れます。排水後、鋭い刃で嚢胞を拭き取り、胚層を滅菌した50mL円錐形チューブに移し、短期間振ってプロトスコレックスの収集を増加させる。プロトスコレーシスをPBS緩衝液で3~5回洗浄する。
0.1%エオジン中のプロトスコレースを5分間観察し、光学顕微鏡下でプロトスコレースの生存率を決定した。培養に少なくとも95%の生存率を有するプロトスコレースを使用する。プロトスコレース沈殿物を2mLのペプシンで15〜20分間処理する。
個々のプロトスコレースを単離するには、プロトスコレース堆積物をPBSに再懸濁し、2層の滅菌ガーゼを通して新しい滅菌50mL円錐形チューブに通す。2つは、エキノコッカス・グラニュローサスのプロトスコレーシスの二相性培養で成虫を得た。10 mLの液相培地を各25センチメートル四方の培養フラスコに加える。
約5, 000個のプロトスコレックスを培養フラスコに加え、CO2インキュベーターに移します。24〜48時間後、プロトスコレーシスを固相を有する新しいフラスコに移し、フラスコあたり同じ新鮮な液相培地を1mL加える。フラスコをインキュベーター、摂氏37度、5%CO2に移します。
5〜7日ごとに、培地を新鮮な液相培地と交換する。3つは、エキノコッカス・グラニュロサスのプロトスコレースの単相栽培である。単相培養が形質導入の24〜48時間前に行われることを確認してください。
RPMIおよび10%FBSを有する25センチメートル四方の培養フラスコ中で約5,000個のプロトスコレーシスを培養する。使用時までフラスコをCO2インキュベーターに移します。第四に、ウイルス産生のための細胞培養および調製物。
500, 000 個の HEK 細胞を、10%FBS、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを含む 5 mL 個の DMEM を含む 25 cm 四方のフラスコに移します。HEK2細胞を摂氏37度で5%CO2中でインキュベートし、48時間ごとに完全な培養培地に通液する。最後に、形質導入のために低継代HEK細胞を使用する。
5つ目に、第3世代レンチウイルスベクターを用いたウイルスの生産および調製。1日目、6ウェル培養プレート中のHEK細胞をトリプシン処理した後、10%FBSを含む新鮮な抗生物質フリーDMEMで1ウェルあたり70,000個の細胞をシードする。リン酸カルシウム法による形質導入のために50〜60%のコンフルエント度の細胞を使用する。
2日目、実験の2〜3時間前に細胞培養培地を2%FBSを含む新鮮な抗生物質フリーDMEMと交換する。1.5mLチューブに、7マイクログラム/マイクロリットルpCDH513b転写ベクター、4マイクログラム/マイクロリットルPLPII、4マイクログラム/マイクロリットルPLPI、および2マイクログラム/マイクロリットルPMD2Gヘルパーベクターを含む第3世代レンチウイルスプラスミドを混合する。HEPES緩衝液を混合物に加え、422マイクロリットルの容量に達する。
混合物に16マイクロリットルの1%TE緩衝液を加える。チューブに62マイクロリットルの2.5mL塩化カルシウムを加え、よく混ぜる。混合物に500マイクロリットルの2x HBSバッファーを加え、パスツールピペットを用いて1〜2分以内に滴下する。
半不透明な溶液が得られるまで穏やかに混合し、混合物を室温で20分間インキュベートする。最後に、混合物を各プレートにゆっくりと加え、ゆっくりと円を描くように分配します。プレートを5%CO2インキュベーターで摂氏37度でインキュベートし、4〜6時間後に培地を10%FBSを含む抗生物質フリーDMEMと交換します。
3日目に、倒立蛍光顕微鏡を用いて成功した一過性形質導入および細胞生存率を確認する。4日目、各ウェルの上清を採取して培養液からウイルスを採取し、使用時まで摂氏マイナス70度で保存した。6つの、ウイルスによるエキノコッカス顆粒症の異なる段階の一過性形質導入。
1日目は、遺伝子導入のために12ウェル培養プレートを使用する。培養物5、000〜50,000個のHEK細胞を内部基準として完全DMEM培地を用いて3連に培養する。培養 150 新鮮なプロトスコレースを RPMI および 10% FBS で 3 連で。
培養物30匹のストロビレートワームをDMEMおよび10%熱不活化FBSに3連で培養する。100万個のウイルスと4マイクログラム/mLのトランスフェクション試薬の混合物を調製し、HEK細胞およびワームの異なる段階を形質導入する。混合物を各プレートにゆっくりと加え、ゆっくりと円を描くように分配する。
プレートを CO2 インキュベーター (摂氏 37 度、5%CO2) で 4 ~ 6 時間インキュベートします。各サンプルの培地を同じ完全な培養培地に交換して、トランスフェクション試薬の毒性の影響を最小限に抑えます。2日目に、前の2つのステップを繰り返して、HEK細胞、プロトスコレース、およびストロビレーテッドワームの一時的な形質導入の効率を高めます。
細胞培地の種類に基づいて同じ培養条件でCO2インキュベーター内ですべてのプレートを24〜48時間インキュベートします。3日目に、蛍光顕微鏡を使用して形質導入が成功したことを確認してください。代表的な結果。
ここでは、第3世代レンチウイルスベクターを用いたエキノコッカス顆粒膜における迅速かつ効率的な一過性形質導入技術について説明します。我々は、以前の研究に従ってストロビレートされたワームを得るために、二相性培養培地中でプロトスコレースを培養した。プロトスコレセスは、6週間のインビトロ培養後にストロビレーテッドワームに発達する。
エキノコッカス顆粒膜の異なる段階が、浸食プロトスコレーシスを含む二相性培養培地中で観察され、図2A、エバジネーションプロトスコレシー、図2B、および第1および第3プログロチッド形成を有するストロビレートワーム、図2Cを介してE.プロトスコレースおよび単相性および二相性培養から得られたストロビレーションワームを、それぞれ、GFP発現レンチウイルスによってトランスフェクトした、図3。HEK細胞は、一過性形質導入プロセス制御としてGFPを明確に発現した。成虫のワームは、外皮層で最も明確にGFPを発現した。
しかしながら、プロトスコレースは、48時間後にGFP発現の幾分低いレベルを実証した。プロトスコレースの周囲のいくつかの嚢胞液残基およびまたは胚層破片は、トランスフェクトされた試料中にいくらかの蛍光バックグラウンドを引き起こした。HEK細胞およびストロビレートワームにおける蛍光の強度は、24時間および48時間後に増加した。
線虫とプラティヘルミンテス生物学の分子基盤を理解することは、人獣共通感染症寄生虫の病原性において最も重要なフロンティアの1つです。効果的な遺伝子評価システムの欠如は、エキノコッカス種を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈に対する大きな障害である。この研究の主な目的は、将来のエキノコックス症研究において重要となるレンチウイルスベクター形質導入のプロセスを説明することでした。
結果は、ストロビレーテッドワームがプロトスコレースよりも遺伝子の一過性形質導入に対してより応答性が高いことを示しており、これはストロビレーテッド形態の広範な外皮構造の結果である可能性がある。しかしながら、レンチウイルス形質導入の性質上、多細胞プロトスコレークおよびストロビレーテッドワームにおける蛍光強度は、典型的には単層HEK細胞よりもはるかに低い。エキノコッカスのゲノムおよびトランスクリプトームレベルでの応用遺伝学的研究、ならびに多種多様な寄生および自由生活扁平虫モデル系が緊急に必要とされている。
したがって、サナダムシへの遺伝子導入プロセスの開発は、ウイルスベースの遺伝子マッピングやCRISPR-Cas9媒介遺伝子編集などの新しい技術の潜在的な使用への道を開くものです。この研究は、サナダムシモデルにおけるレンチウイルスの形質導入を提示し、扁平虫生物学に潜在的な意味を持つ有望な結果を実証している。さらに、方法を改善し、将来の実験へのこれらの技術の適用可能性を開発するには、より詳細な研究が必要です。
