エイメリア種のトランスフェクションプロトコルの確立は、遺伝子機能の研究を進め、新しいワクチンを開発し、エイメリアの新しい薬物標的をスクリーニングするのに役立ちます。この技術を用いて、我々は、エイメリアのいくつかの種のトランスフェクションを達成し、核の切除は、有腸寄生虫の遺伝子操作の適用を容易にする有用なツールである。Eimeriaの核分裂は、インビトロで培養できない他の寄生虫のトランスフェクションの参照を提供し、その遺伝子操作の研究を加速させる。
このテクニックを初めて試す場合は、実験中のスクランブルを避けるために、トランスフェクションの開始前に試薬とその器具を十分に準備する必要があります。この方法の実現は、エイメリアのトランスフェクションに焦点を当てた人々がこの実験の複雑な詳細を見るのに役立ちます。スポロシストの放出から始めて、遠心分離機は2、300回gの2分間のジクロメートカリウム溶液中の7つの胞子に10回10回。
PBSで3回洗います。ペレットをPBSの1ミリリットルで再懸濁し、混合物を15ミリリットルのチューブに移します。直径1ミリメートルのガラスビーズを同量に加え、渦ミキサーを使用してオーシストサスペンションを振動させ、胞子嚢胞を放出します。
毎分、顕微鏡でスポロシストの放出を監視する。90%以上の卵嚢胞が壊れている場合は、渦を止める。新しい1.5ミリリットルチューブにスポロシストサスペンションを移し、遠心分離機を1,600倍gで5分間移動します。
沈殿物を50%の濃度勾配溶液の1ミリリットルで再懸濁し、遠心分離機を10,000グラムで1分間再懸濁する。スポロゾイトを放出するには、排泄バッファーで沈殿物を再懸濁し、42°Cの水浴中で40〜60分間インキュベートして、スポロゾイトを放出する。除電中に5分に1回チューブを振ります。
90%以上のスポロゾイトが放出されたら、インキュベートを中止する。600回gで遠心分離機を10分間。55%密度勾配溶液の1ミリリットルで沈殿を再懸濁し、10,000倍gでチューブを1分間遠心分離します。
1ミリリットルのPBSで沈殿を再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いてスポロゾアイトを数える。エイメリア・ネカトリクスの第二世代のメロゾアイトを採取するには、黄身の茎からイレオセカールオリフィスに長手持ちの鶏腸を切り、ペトリ皿でPBSまたはHBSSで3回そっと洗う。腸を粉々に切り、消化バッファー付きの円錐形フラスコに入れます。
フラスコを37°Cの磁気ミキサーに置き、30〜60分間攪拌バーを置き、メロゾアイトを放出します。30分のインキュベーションの後、5分ごとに顕微鏡検査によってメロゾイトの放出を監視する。メロゾイトを精製するには、消化したメロゾイトを含む懸濁液を4層のガーゼに注ぎ、50ミリリットルのチューブにフィルターをかけ、チューブを600倍gで10分間遠心分離します。
遠心分離後、腸内の破片を含む上清を捨てる。精製されたメロゾウトを用いて沈殿物を1.5ミリリットルのチューブに移します。1ミリリットルのPBSで沈殿を再中断し、ヘモサイトメーターを使用してメロゾアイトを数える。
まず、スポロゾイトまたはメロゾイト懸濁液を600回gで10分間遠心する。その後、上清を捨てます。以下の順番で、85マイクロリットルの核トランスフェクションバッファー、10マイクログラムのプラスミド、および25単位の制限酵素を、スポロゾイトまたはメロゾイトを含む1.5ミリリットル管に加える。
サスペンションを核トランスフェクションカップに移します。カップを核移動溝に入れます。電源ボタンを使用して核の切除装置をオンにし、トランスフェクション手順U-033を選択します。
プログラムが終了したら、核のXボタンを押すと、画面がOKと表示され、核の切開が成功したことを示す。核の核のカップにダルベッコの修正されたイーグルの媒体の1ミリリットルに0.5を加えて、反応を止めます。軽く混合した後、1.5ミリリットルのチューブに懸濁液を移します。
核感染した寄生虫を7日前の鶏に接種する。エイメリア・ネカトリクスのメロゾイテまたはクロースカルルートを介してエイメリア・テネラのスポロゾイテスを接種するが、静脈注射を介してエイメリア・アセルヴリナ・スポロゾイテスを接種する。便から卵子を採取した後、フルオレセイン活性化細胞選別と1キログラム当たり150ミリグラムのピリメタミンを使用して、トランスジェニック集団比を高める。
このプロトコルは、アイムリア寄生虫をトランスフェクトするために使用されています。本研究では、エイメリア・ネカトリクスの第二世代のメロントとメロゾアイト、ならびに密度勾配溶液を使用した後のアイメリア・テネラの胞子嚢および胞子虫がここに示されている。核感染した胞子類に感染した後の、核感染したメロゾイトとエイメリア・テネラの卵巣に感染した後のエイメリア・ネカトリクスのオースト胞の画像は、核の欠核化に成功したことを示している。
この手順を試みている間に最も重要なことは、スポロゾイトとメロゾアイトの精製が成功していることを確認し、50%密度の勾配溶液を使用してOS2を除去し、スポロシストとスポロゾアイトがより精製されていることを確認することです。この手順に従うと、このプロトコル(子宮内胞子または胞子嚢胞など)を最適化して、将来のエイメリア寄生虫のトランスフェクション手順を簡素化することができます。Eimeriaのトランスフェクションの開発に伴い、EimeriaのCRISPR-Cas9技術は、エイメリアの慎重な遺伝子操作を大幅に推進し、適切なワクチンデリバリービークルとして適用することが期待されます。
