我々は電子顕微鏡のためのウィスコンシン大学マディソン電子顕微鏡施設の大学からBKアウグスト感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金R01 - DA026067とP30 - HD03352（JSMへ）によってサポートされていました。

1。準備1月4日 <ol><li>で、2.5 Mのショ糖のスラリー50mLを、1Mトリス - 塩酸2.5mLを、pH7.5株式、および0.5 M EDTA 0.1 mLを混合してpH8.0のストックを勾配培地（GM）バッファーを500mLを準備ミリボリュームへのQ水。凍結溶液、分注して店を滅菌フィルタします。 </li><li>ミリ- Q H 2 Oで1 mM溶液を作ることによってテトロドトキシン（TTX）の1000倍の株式を準備TTXのアリコートを-20℃で保存することができます</li><li>ミリQ水に100mMトリス（pH7.5）で、中の5 mMののNa 2 HPO 4、4mMのKH 2 PO 4、40mMのNaHCO 3水溶液 、および800 mMのNaClを加えることにより10倍刺激のバッファを準備します。株式は、4℃で保存することができます</li><li>プレクール遠心分離機に4℃ </li><li> Milli - Q水で2.5 Mのショ糖（2 mL）を1ボリュームにパーコール（18 mL）を9ボリュームを追加することにより、等張パーコール（SIP）のストック溶液を調製し、よく混ぜる。 </li><li> GMのバッファへのSIPのそれぞれの金額を追加し、それぞれを混合することにより、3、10、15、および23％の勾配層を準備します。 </li></ol><img alt="テーブル0" src="/files/ftp_upload/3196/3196table0.jpg" /><ol start="7"><li> P1000ギルソンPipetmanを使用してキャップでベックマンの遠心チューブに2ミリリットル23、15、10のそれぞれ、3％等張パーコール溶液をピペッティングにより、グラデーションのレイヤーを注ぐ。レイヤ間のインタフェースは、層のないミキシングと明確に識別できるはずです。使用前に少なくとも20分間、4℃で勾配を保管してください。同じ日の使用が推奨されていますが勾配は24時間まで保存することができます。 [経験の浅い研究室の担当者は、層のインタフェースの視覚化のためのisomoticパーコールソリューションに青色色素を加えることによって準備勾配を実践している可能性があります。] </li></ol> 2。マウスの解剖1 <ol><li>すべてのマウスの飼育と安楽死の手順はNIHや大学のガイドラインに従って行われていることを確認します。二酸化炭素の窒息により又は動物のプロトコルでの承認された方法による仔（年齢P13へP21）を安楽死させる。 </li><li>解剖ボードにマウスを固定し、エタノールで首と頭の後ろをスプレー。頭蓋底で脊髄を切って切れるはさみを使用して、頭頂骨と頭頂間骨の間、または大脳と皮質領域間の横方向に頭蓋骨を切断、頭蓋骨の上から皮を取り除く。その後、ベースから鼻（矢状縫合に沿って）に頭蓋骨を切断、慎重側に各半球を引いて、ソフト頭頂骨を削除し、スパチュラで皮質を削除します。小脳上記の脳の中にヘラを挿入し、皮質をかき出すと、氷冷GMのバッファに置きます。均質化のステップに進んで。皮質はこれが悪影響をSNの形成に影響を与えるので非常に長いために、氷冷緩衝液中で座ってはいけない。 </li></ol> 3。ホモジネートやSNS 1-4の準備<ol><li>氷冷GMバッファに皮質をすすぎ、冷たいGMの緩衝液5 mLを含むガラスDounceホモジナイザーに2つの皮質を転送する。 </li><li>優しく緩み乳棒の5-10ストロークと皮質を均質化（乳棒&quot;A&quot;）、タイト乳棒（すりこぎ&quot;B&quot;）の5〜10ストロークで続いた。ストロークは、迅速かつ気泡が生じないように十分に遅くする必要があります。均質化後のホモジネートの写真は、 スキーム1になります。ストロークの数は、個々のホモジナイザーとそれに付随する乳棒に依存して変化します。勾配が強いSNのバンドを与える必要が終わったら、、ストロークの数を調整する場合ではない。 </li><li>ペレット、細胞残渣および核に4で15 mLコニカルと10分間1000xgで遠心°スイングバケットローターでC（アレグラ6KR遠心分離機）にホモジネートを転送します。紡糸ホモジネートの写真は、スキーム1になります。 </li><li> 4でパーコール-スクロース勾配、キャップチューブ、および5分間32500 × gで遠心当たり上澄みの層を2mL ·固定アングルローター、適切なアダプタを使用して（ベックマンJ2 - 21遠心、JA - 17ローター）（でC 試薬と機器表 ） を参照してください。 </li><li>オフピペットとガラスパスツールピペットを用いてSNのバンド、上記の液を捨て。 23分の15％の界面でのSNのバンドからピペット、氷の上に円錐とストアに転送する。各勾配または1つの皮質は、SNの0.9から1.1 mLを生成します。 </li><li> 12nmの最終濃度に1000倍のCaCl 2を追加し、非特異的な励起を抑制するために1μMの最終濃度を1 mMのTTXの株式を追加、10倍の刺激のバッファの十分の一のボリュームを追加することにより、SNの塩濃度を調整します。 （それが下流のSNのアプリケーションに干渉する場合CaCl 2の添加は任意です）。 </li><li>マイクロBCAタンパク質アッセイキットを用いてSNのタンパク質濃度を決定する。 （ブラッドフォードタンパク質アッセイは、理由パーコールからの推論では推奨されません。） </li><li> SNをはタンパク質並進のために直接かつ迅速に使用することができます。る研究。他のアプリケーションではSNライセートは、クリーンアップまたはピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて濃縮することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果： マウス皮質が不連続パーコール-スクロース勾配（ スキーム1）、6つのバンドまたは分数で均質化し、分離されたとき（ 図1）が見られた。それは、以前は高分子量バンドの成分が膜とミエリンを破壊し、ペレット化材料が（ 表1）ミトコンドリアや細胞小器官が含まれていることされている大脳皮質3,5ラットが示された。 23パーセント/ 15％インターフェース（バンド5）豊富なSNを含んでいた。 無傷のSNを含む23パーセント/ 15％インタフェース、、でのバンドは、前述した電子顕微鏡（EM）によって削除され、調べられた。2,6 - EMはそのままシナプス小胞の存在とシナプス前及びシナプス後要素の保全（ 図を示した2）。プリとシナプス後コンパートメントの分離は、シグナリングおよび両方のコンパートメントで発生するタンパク質の合成を、調べるために重要です。7-13パーコール-ショ糖密度勾配は、我々はSNの画分にマイナーな携帯電話、核とオルガネラの混入を見たように、原油精製ですが全体的な分離は良好であった。 ウェスタンブロット法によって調べたところ、パーコール分画は、SNのバンド（ 図3、表2）におけるシナプス純度の増加に伴って予想されるタンパク質マーカーが含まれていました。シナプスとニューロンのマーカーは、濃縮されたSNのバンド（バンド5）中で維持したが、他のマーカーの存在量が有意に減少した。構造とシナプスのマーカーが維持または強化された一方、特に、GFAP、グリア由来の星状膠細胞と腫瘍細胞のマーカー、およびラミン- B1、核マーカー、の存在は、無視できる程度であった。さらに、タンパク質合成の役割を果たすようなミトコンドリアとゴルジなどの細胞小器官、、のためのマーカーの保持があった。 BCAタンパク質アッセイによって決定されるSNのバンドのための典型的な収量は、μLあたりのタンパク質の250〜500 ngのでした。 SNを、50μMglutamate/10μMグリシンで刺激したときにSNの活性は、de novoのタンパク質合成量によって決定された[35S] - Metの取り込み（ 図4）によってモニターを提示2基礎翻訳活性は1.56倍に増加した（GLU）またはPin1の阻害剤のjugloneで活性化倍5.12。 Pin1の阻害は、[35S] - Metの取り込みの増加は、de novoのタンパク質合成のために行われたことを確認するために増加するタンパク質合成2に生じることが知られている、我々は、40μMのアニソマイシン、タンパク質合成阻害剤を追加し、そして定款の著しい減少を見た基底レベルと比較してGluの存在下および不在下インチまた、2％加えてSNの整合性を破壊するトリトン- X 100、によって、基底の変換は75％減少した。2はさらに、ほとんどのシナプスマーカーの濃縮を示したバンド（B4 - B6）を調べるときに、 SNをまたはバンド5 は 、de novoタンパク質合成（ 図5）の最大の活性を有していた。このように、不連続パーコール-スクロース勾配は、迅速にタンパク質の翻訳を研究するために使用できる高活性と濃縮されたSNのバンドを生成する。 機械的損傷が過酷な条件によって引き起こされているため、不連続パーコール-ショ糖勾配の手順は、他の方法よりも有利である。皮質ホモジネートをクリアする濾過法、と比較するとサイズの減少は、3,14-15パーコール法は、大きな活性をより多くのSNを形成する一連のフィルタを通過させる。としてろ過の方法によって調製されたSNのアリコートを23分の15％の界面ではるかに少ないSNSや壊れた膜のより多くの量が存在するパーコール-ショ糖勾配上を通過した図6に見られる。 de novoのタンパク質合成は、S35 - METの取り込みを経由して測定したところ、ろ過法により調製したSNは（ 図7）はるかに活動的であった。翻訳活性を最大化するために我々は、年齢P14とP18の間にあるマウスを使用してください。 SNは、成体マウスから調製、しかし我々は幼若マウス（ 図8）から調製したSNと大幅に増加翻訳活性を観察することができます。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3196/3196table1.jpg" /> 表1。均質化したマウスの皮質の不連続パーコール勾配分画からのバンドの成分。3,5 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/3196/3196table2.jpg" /> 表2。不連続パーコール-ショ糖勾配のバンド成分の西部ボルトの分析の要約。バンドの画分のそれぞれの相対濃度のタンパク質は、不連続Percolを用いて単離されたL -糖勾配は、ウエスタンブロットによって測定した。なしに存在するタンパク質（ - ）、0≥0.2（+）、0.2≥0.8 (++),または&gt; 0.8 (+++)倍のnの上清（S、大脳皮質ホモジネートを遠心分離）、代表的な中に存在​​するタンパク質より大きい= 3。 <img alt="スキーム1" src="/files/ftp_upload/3196/3196scheme1.jpg" /> スキーム1：不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてSNの準備の模式マウスの脳の皮質は、解剖均質化、および非ホモジナイズした組織を削除するには、低速で遠心分離し、細胞が、そのような核や膜などの全体の小器官。。不連続勾配は、明確に定義された層を持つ必要があります。はめ込み画像は、レイヤーを視覚化するために、説明のみを目的として、青色染めされている層、の例を示しています。上清は、不連続パーコール-ショ糖勾配の上に重層し、中速で遠心分離する。 SNのバンドは、その後、勾配から取り出され、使用することが可能です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig1.jpg" /> 図1。不連続パーコール-ショ糖密度勾配上でホモジネート分画 。マウス皮質が均質化し、6つのバンドや分数を生じさせる不連続パーコール-スクロース勾配で分離した。精製、アクティブなSNを（*）がバンド5で発見された。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig2.jpg" /> 図2。 SN製剤は、シナプス前及びシナプス後要素を保持するSNの混在を与える。C57BL / 6マウス（年齢P13へP21）から調製したSNの準備の電子顕微鏡写真は、前述のように実行すると、保存シナプス前及びシナプス後要素とSNを示していた。2 6赤の矢印はシナプス後密度を指している。スケールバーは1μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig3.jpg" /> 図3。 SN製剤のウエスタンブロット解析では、シナプスとニューロンのマーカーを精製SNS（バンド5）で維持されたが、他のマーカーの存在量が著しく減少したことを示した。上清の免疫ブロット（S、皮質ホモジネートを遠心分離）とバンド不連続1-6パーコール-スクロース勾配は、β-アクチン（構造、コントロールをロードする）、GFAP（星状）、GP73（ゴルジ）、HSC70（細胞質と核）、ラミン- B1（核）、Prohibitin（ミトコンドリア）、PSD95（シナプス後密度のためにプローブした）、SNAP25（シナプス）、シナプトフィジン（シナプス）とβ3-チューブリン（ニューロン特異的）。バンドは、n = 3の代表、ストーム860 Phosphorimagerを使用して可視化した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig4.jpg" /> 図4。 SNはアクティブになっていて、[35S] - Metの取り込みを経由してde novoタンパク質合成を示す。SNは℃で10分間37に予め平衡化した。その後、SNは3740μmのアニソマイシンまたは1μMのjugloneで15分間未処理または前処理された° C ° CのプラスまたはマイナスのGlu - Metは、20μlのエクスプレスProのラベルS35簡単タグをミックス[35S]は、を加え、37℃で30分間。サンプルは、ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて調製15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、乾燥し、分子動力学ストーム860 phosphorimager、n = 3の代表、± SEMを用いて定量した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig5.jpg" /> 図5。不連続パーコール-ショ糖勾配からバンド5は、de novoのタンパク質合成の最高レベルを含んでいた 。バンド4、5、6、上清を（S、皮質ホモジネートを遠心分離）℃で10分間〜37予め平衡化した。その後、[35S] - Metと、エクスプレスProのラベルミックスS35簡単タグは、追加、プラスまたは37マイナスのGlu℃で30分間した。サンプルは、ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて調製15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、乾燥し、分子動力学ストーム860 phosphorimager、n = 3の代表、± SEMを用いて定量した。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig6.jpg" /> 図6。ろ過法から調製したSNは不連続パーコール-ショ糖密度勾配法から調製したSNをより多くの壊れた膜と少なく、全体のSNが含まれています 。 SNを、以前説明したように細孔径を小さくすると、一連のフィルタを介して均質化した皮質を渡すことによって調製した。ろ過の方法によって調製されたSNの3,14-15アリコートを、不連続パーコール-ショ糖勾配上の遠心分離と同等の量と比較した不連続パーコール-ショ糖密度勾配法を用いて材料の。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig7.jpg" /> 図7。ろ過法から調製したSNはSNはあちこちに用意さよりもde novoタンパク質合成活性が含まれていますメートル不連続パーコール-ショ糖勾配法。 SNを、以前説明したように減少し、孔径フィルター、3,14-15の一連と不連続パーコール-ショ糖密度勾配法により均質化した皮質を渡すことによって調製した。両方の製剤からSNは37に予め平衡化された℃で10分間。その後、[35S] - Metと、エクスプレスProのラベルミックスS35簡単タグは、追加、プラスまたは37マイナスのGlu℃で30分間した。サンプルは、ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを用いて調製15％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、乾燥し、分子動力学ストーム860 phosphorimager、n = 3の代表、± SEMを用いて定量した。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3196/3196fig8.jpg" /> 図8。若いマウス（P14）からSNはそれ以上の年齢のマウス（P85）を超える翻訳活性を持っている。SNは37 preequilibrated、不連続パーコール-ショ糖密度勾配法を用いて別の老齢マウスから調製された区でGluに治療または未治療の10分、のためのCを[35S]の存在は、- Metは、スナップ凍結、30分間（エクスプレスProのラベルには、S35簡単タグをミックス）と、後ピアースSDS - PAGEのサンプル前処理キッ​​トを使用してクリーンアップ。 SNをその後、12％SDS -ポリアクリルアミドゲル上で実行乾燥し、n = 3、± SEMの分子動力学ストーム860 phosphorimager、代表的に画像化した。 P14マウスからのSNはP85マウスよりも少なくとも3倍以上の活性であった。

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptors+trigger+postsynaptic+protein+synthesis.">Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+An+electron+microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J. Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+Presynaptic+and+Postsynaptic+Markers+by+Size-Based+Gating+Analysis+of+Synaptosome+Preparations+From+Rat+and+Human+Cortex.">Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex.</a> Cytometry A. 60, 90-96 (2004).</li><li>Haj&#243;s, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+the+preparation+of+synaptosomal+fractions+in+high+purity.">An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity.</a> Brain Res. 93, 485-489 (1975).</li><li>Bai, F., Witzmann, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptosome+Proteomics.">Synaptosome Proteomics.</a> Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).</li><li>Rao, A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+protein+constituents+of+postsynaptic+membrane+specializations+are+locally+synthesized:+analysis+of+proteins+synthesized+within+synaptosomes.">Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes.</a> J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).</li><li>Pertoft, H., Laurent, T. C., Catsimpoolas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopycnic+separation+of+cells+and+cell+organelles+by+centrifugation+and+modified+colloidal+silica+gradients.">Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients.</a> Methods of Cell Separation. , 25-65 (1977).</li><li>Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+affinity+uptake+of+L-glutamate+and+&amp;gamma;-aminobutyric+acid+in+Drosophila+melanogaster.">High affinity uptake of L-glutamate and &amp;gamma;-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster.</a> J. Biosci. 11, 119-135 (1987).</li><li>Munteanu, L. S., Dinu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+granulocytes+from+whole+human+blood+by+centrifugation.+Practical+hints.">Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints.</a> Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).</li><li>Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+composition,+kit+and+method.">Cell separation composition, kit and method.</a> US patent. , (1997).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに記載さ不連続パーコール-ショ糖勾配の準備は、シナプス伝達の実験の様々な使用することができるアクティブなSNを、分離するために迅速、信頼性の高い方法です。 Dunkleyら、3,4によって開発された方法に基づいてこの勾配法は、互いに関連付けられている両方の前およびシナプス後膜由来の小胞を分離した細胞内脳分画の手順です。さらに精製することなくこれらのSNは免疫?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>マイクロBCAタンパク質アッセイキット</td><td>ピアース</td><td> 23235 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2で </td><td>フィッシャー</td><td> C79 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2ガス</td><td> Airgasの（UW - MDS） </td><td> CD 50 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> RPI </td><td> E57020 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー</td><td> A407SK - 4 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー</td><td> A142 - 212 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>フィッシャー</td><td> P285 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> PierceSDS - PAGEサンプル前処理キッ​​ト</td><td>ピアース</td><td> 89888 </td><td></td></tr><tr><td> NaClの</td><td> RPI </td><td> S23020 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3の </td><td>フィッシャー</td><td> BP328 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>のNa 2 PHO 4 </td><td>フィッシャー</td><td> S381 - 500 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> RPI </td><td> S24060 </td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td> RPI </td><td> T60040 </td><td></td></tr><tr><td>テトロドトキシン</td><td>シグマ</td><td> T5651 </td><td></td></tr><tr><td>エクスプレスProのラベルには、S35簡単タグをミックス</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEG772 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th>機器の</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>解剖ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダウンスホモジナイザー、7 mLの（二枚のガラスに付属する&quot;A&quot;と&quot;B&quot;とラベルされた乳棒） </td><td>ホイートン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> P1000ギルソンPipetman </td><td>ギルソン</td><td> F123602 </td><td></td></tr><tr><td>アレグラ6KR遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td> 366830 </td><td></td></tr><tr><td> GH 3.8ロータ、スイングバケットローター</td><td>ベックマンコールター</td><td> 360581 </td><td></td></tr><tr><td>ベックマンJ2 - 21遠心</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャップ付きベックマンチューブ</td><td>ベックマン</td><td> 355672 </td><td></td></tr><tr><td>白壁のアダプタ</td><td>ベックマン</td><td> 342327 </td><td></td></tr><tr><td>青い壁のアダプター</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> JA - 17ローター、固定アングルローター</td><td>ベックマン</td><td> 369691 </td><td></td></tr></tbody></table>ウエスタンブロットのために使用される抗体の表： <table border="1"><tbody><tr><th>抗体の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>宿主動物種</th><th>希釈係数</th></tr><tr><td> β-アクチン</td><td>シグマ</td><td> A5441 </td><td>マウスを</td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 65343 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> GP73 </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 134509 </td><td>ウサギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> HSC70 </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 7298 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Laminβ </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 6261 </td><td>ヤギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> Prohibitin </td><td>サンタクルス</td><td> SC - 28259 </td><td>ウサギ</td><td> 1:200 </td></tr><tr><td> PSD95 </td><td>ミリポア</td><td> MAB1596 </td><td>マウスを</td><td> 5μgの/μL </td></tr><tr><td> SNAP25 </td><td>アブカム</td><td> ab5666 - 100 </td><td>ウサギ</td><td> 1:2000 </td></tr><tr><td>シナプトフィジン</td><td>ミリポア</td><td> MAB368 </td><td>マウスを</td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> β- 3 -チューブリン</td><td>サンタクルス</td><td> SC - 80016 </td><td>マウスを</td><td> 1:200 </td></tr></tbody></table>

preparation of synaptoneurosomes from mouse cortex using a discontinuous percoll-sucrose density gradient

Synaptoneurosomes（SNS）は、マウス脳皮質の均質化と分別の後に得られる。彼らは、小胞または皮質組織が均質化されたときに軸索末端からの脱却孤立端末が再シールされています。 SNはシナプス伝達の研究に有用になる前と後シナプスの特性を、保持する。彼らは神経シグナリングで使用されている分子機構を保持して取り込み、ストレージ、および神経伝達物質の放出が可能です。 アクティブなSNの生産と分離は、細胞毒性になるとSNの機械的損傷に起因する低活性につながる可能性の拡張、高密度のために遠心分離し、ろ過と遠心分離の方法を、必要とすることができるフィコール、のような問題に使用してマスコミのすることができます。しかし、SNを分離するために、不連続パーコール-ショ糖密度勾配の使用は、並進アクティブSNの良好な収率を生成するために迅速な方法を提供する。パーコール-ショ糖密度勾配法では、等張性の条件を採用して、迅速かつ穏やかであり少ないと短い遠心分離スピンを持っており、ペレット、SNSとは、機械的損傷を引き起こすことに遠心操作を避けることができます。

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

preparation-synaptoneurosomes-from-mouse-cortex-using-discontinuous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.2K ビュー.  University of Wisconsin. マウス脳皮質から翻訳後のアクティブな、無傷のsynaptoneurosomes（SNS）を準備する方法について説明する。方法は、アクティブなSNの迅速な作成を可能にする不連続パーコール-ショ糖密度勾配を使用しています。

ビデオ: Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

神経科学

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Investigating the Function of Deep Cortical and Subcortical Structures Using Stereotactic Electroencephalography: Lessons from the Anterior Cingulate Cortex

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure involves the chronic placement of multiple depth electrodes into regions of the brain typically inaccessible via subdural grid electrode placement. SEEG thus provides a unique opportunity to investigate brain function. In this paper we demonstrate how SEEG can be used to investigate the role of the dorsal anterior cingulate cortex (dACC) in cognitive control. We include a description of the SEEG procedure, demonstrating the surgical placement of the electrodes. We describe the components and process required to record local field potential (LFP) data from consenting subjects while they are engaged in a behavioral task. In the example provided, subjects play a cognitive interference task, and we demonstrate how signals are recorded and analyzed from electrodes in the dorsal anterior cingulate cortex, an area intimately involved in decision-making. We conclude with further suggestions of ways in which this method can be used for investigating human cognitive processes.

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is an operative technique used in epilepsy surgery to help localize seizure foci. It also affords a unique opportunity to investigate brain function. Here we describe how SEEG can be used to investigate cognitive processes in human subjects.

定位脳波を使用して、ディープ皮質の機能と下構造の調査：前帯状皮質からの教訓は、

Stereotactic Electroencephalography (SEEG) is a technique used to localize seizure foci in patients with medically intractable epilepsy. This procedure ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...