培養の一日前の準備： <ul><li>無菌解剖ソリューション（DS）を準備する。 </li><li> NBM/B27（B27サプリメントとNeurobasal Mediom）を準備する。 </li><li>オートクレーブのddH 2 O及び必要に応じて、ガラスのcoversilpsを滅菌する。 </li><li>ポリ- D -リジンでコーティングの組織培養皿またはガラス製カバースリップ。 </li></ul>ポリ- D -リジンコーティング： 無菌条件下で培養前日に準備します。 <ul><li>氷上で10倍PDLと場所のアリコートを解凍。 </li><li> PDLの1mlに9 mlの滅菌超ろ過水を追加し、（1X）よく混ぜる。 </li><li>次のように、室温で一晩1X PDLとコートサーフェス： <ul><li>ガラスカバースリップ（Bellcoガラス、株式会社カタログ番号1943から00012まで。）：75μlの/カバースリップ OR </li><li> 24ウェル培養プレート：300μL/ウェル OR </li><li> 35mmの培養皿：1ml/dish </li></ul></li><li>滅菌水で5倍リンス（液体を吸引するために滅菌パスツールピペットを使用）。 </li><li>表面が完全に乾くまで水を取り外します。 </li></ul>培養の手順（無菌条件下で層流フードで行われている） <ol><li>スーパー接着剤を使用してミクロトームVibraslicer（カムデンインスツルメンツ社）の支持ブロックの上に寒天とのり、それのブロックをカット。 </li><li>後期胚のステージ（E17 - 18）マウス胎児、euthaniseダムを使用する場合は、胚性袋から子宮と無料の個々の胎児を削除します。場所は、滅菌シャーレに胎児​​と、下記のとおり継続する。 </li><li>首を切るのマウスの胎児や子犬（あなたの動物実験使用の委員会で承認された以下のガイドライン）。 </li><li>冷たいDSで満たされた60ミリメートルのペトリ皿にワットマン濾紙ディスクに皮膚や頭蓋骨と場所の脳を取り外します。 </li><li>滅菌カミソリの刃を使用して小脳を切り取ります。 </li><li>スパチュラを用いて脳をピックアップし、ろ紙上に余分な水分を排出し、代わりにVibraslicerの支持ブロックと接着剤の脳（尾側を上にして寒天が直面している腹側の部分）に脳を転送する。 </li><li>冷たいDSでチャンバーを埋める。 8-9速度のセレクタを設定します。 </li><li>嗅球から始まる、200から400μmのセクションをカット。 Vibraslicerの刃が皮質に入ると、600μm冠状セクションに切断開始。 P0マウス脳では4月5日使用可能なスライスをもたらす間、E17 - 18マウスの脳は、通常、3-4使用可能なスライスが得られます。 </li><li> 10ミリリットルのガラスパスツールピペットをアンプラグインの逆の端を使ってDS 2とラベル付けさ35ミリメートルのペトリ皿に脳スライスを転送する。 </li><li>大脳皮質を摘出し、キャピラリーチューブから引き出さガラス針を用いて髄膜を除去。 </li><li>小片、長さは0.5〜1ミリメートルに皮質rindsをカット。 </li><li> 0.2μmのフィルターESは、35mmシャーレに5ccのシリンジに接続されたフィルタ。 </li><li>フィルタ処理されたESを含むペトリ皿に皮質組織片を移し。 </li><li> 37℃で30分間インキュベートします。 </li></ol>一方で： <ol><li>フード、Vibraslicerと解剖ツールをクリーンアップします。 </li><li> 60ミリメートルのペトリ皿に暖かいNBM/B27 5 mlを加える。 </li></ol> 30分後。インキュベーション： <ol><li> 10 mlのDSに組織を移す。 1分間のために解決しましょう​​。 </li><li>第一こんにちはチューブの渦に組織を移し、2〜3分のために解決しましょう​​。 </li><li>第二Hiに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>第一リーに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>第二リーに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>第三リチウムに転送する。上記のように繰り返す。 </li><li>メディア60 mmディッシュに組織を移す。 </li></ol>解剖顕微鏡の下で： <ol><li>組織からごみを清掃し、そっとティッシュをほぐすためにプルアップガラスピペット（減少ボアサイズを使用）を通過させることによって、各部分を砕いて粉にする。 </li><li> NBM + B27の残りを含む15 mlのコニカルチューブに細胞懸濁液を移す（24ウェルプレートまたは5の11ミリリットル、13 mlの合計を作る - 35 mmの培養ディッシュ穏やかに混合し、解決するために組織の大部分を待つ）。 </li><li>転送細胞懸濁液（24ウェルプレートあるいは2 ml / 35 mmの培養ディッシュ/ウェル0.5ml）を。 </li><li>ガラス製カバースリップを使用する場合は、カバースリップあたり80μlの細胞懸濁液を追加し、細胞がより多くのNBM/B27メディアでチャンバーをフラッディングする前に付着するための組織培養インキュベーターで1時間を可能にする。 </li><li> 37℃、5％CO 2で培養を維持する。 </li></ol>次の日 24ウェルプレート：（cNBM/B27; cNBM/B27培地の調製のための議定書下に表示される）NBM/B27培地を条件付け0.5ミリリットル非神経細胞の各ウェルをフィード 35ミリメートル料理：cNBM/B27培地に0.5 mlを交換してください。 新鮮なcNBM/B27ごとに2〜3日で培地の0.5ミリリットルを置き換えることにより、文化を維持する。 培養培地は、グリア細胞の増殖を促進しないが、培養は、必要に応じてさら​​にグリア細胞の数を減らすために、文化の日3月5日で5μMFDU（5 - フルオロ-2&#39; - デオキシウリジン、シグマF0503）で処理することができます。 セット<html> - UP解剖と文化のための 70％EtOH中で解剖ツールを殺菌したり、それらをオートクレーブ： <ul><li>はさみ（med.と小）ヘラ（med.と小） </li><li>ピンセット（med.と小）レーザーブレード</li><li> vibraslicerバッファ風呂用ブレード</li><li>脳のためのブレードをサポートするための小さな金属製のくさび</li></ul>その他の材料： <ul><li>ペトリ皿（60 mm）の</li><li>ペトリ皿（35ミリ） </li><li>ろ紙</li><li>ガラスピペット10ミリリットル</li><li>滅菌ディスポーザブルピペット、5,10および25ミリリットル</li><li>シリンジフィルター、0.2μmの</li><li>シリンジ5ccの</li><li>遠心分離チューブ、15ミリリットル</li><li>滅菌パスツールガラスピペット</li><li> PDLコート培養皿またはガラス製カバースリップ</li></ul>ラベルsix 15 ml遠心チューブと準備は、次のとおりです。 チューブ＃1：酵素溶液： を含む5mlのDSにパパイン（ワーシントンLS 03126）の50 Uを追加します。 <ul><li> L -システインの100μL（0.8mg） </li><li> 7μlの0.1N NaOHを</li><li> 50μlのAPV（5mm）で</li></ul>クリアするには、室温でソリューションを残す。酵素溶液は、最初は&quot;曇り&quot;に表示され、使用前にクリアする必要があることに注意してください。 チューブ＃2＆＃3：ハイ酵素阻害薬： 3ミリリットルDS + 300μlのBSA /チタン+30μlのAPV（5mm）で提供されます。 泡を避けるために静かに混和、2つの1.5ミリリットルのアリコートに分ける。 チューブ＃4 - ＃6：低酵素阻害薬： 8ミリリットルDS +80μlのBSA /チタン+80μlのAPV（5mm）で提供されます。 泡を避けるために穏やかに混合、三2.6ミリリットルのアリコートに分ける。 場所チューブは氷上に＃6を介して第2の番号。チューブ＃1（酵素液）、室温で残す。 ソリューション、アリコート<ul><li>ソリューション（緩衝生理食塩水）シグマフォーミュラ重量500ミリリットル[濃] </li><li>塩化ナトリウムNaClのS - 9625 58.45 80.0グラム137mM </li><li>塩化カリウムKClのP - 4504 74.56 4.0グラム5.4mM </li><li>ナトリウム二塩基性リン酸、無水Na 2 HPO 4、S - 0876 142.0 0.24グラム0.17mM </li><li>一塩基性リン酸カリウム、無水KH 2 PO 4、P - 5379 136.09 0.3グラム0.22mM </li></ul> 400ミリリットル超ろ過水で溶解するまですべての食材とミックスを秤量。 500 mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいな瓶とオートクレーブ内の場所。 4℃とラベル&quot;DSソリューション&quot;。 <ul><li>ソリューションB（HEPES）シグマフォーミュラ重量250ミリリットル[濃] </li><li> HEPESヘペスH - 3375 283.3 20.97グラム9.9mM </li></ul> 200mlに超ろ過された水を追加します。溶解するまで混合し、250mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいな瓶とオートクレーブ内の場所。 4℃とラベル&quot;DS B液&quot;。 <ul><li>ワーキング溶液500ミリリットル[濃] </li><li>超ろ過された水400ミリリットル</li><li>ストック溶液25ミリリットル</li><li>ストック溶液B 14ミリリットル</li><li> D（+） - グルコースシグマG - 8270 3.0グラム33.3mM </li><li>スクロースシグマS - 0389 7.5グラム43.8 mMの</li></ul> 1N NaOHで7.4にpHを調整する。超ろ過された水で500 mlに最終的なボリュームをもたらす。きれいなガラスのボトルやオートクレーブにデカント。 4℃で保存します。ラベル&quot;解剖ソリューション&quot;。 ポリ- D -リジンの準備： <ol><li> 1mg/mlで無菌H 2 Oで、ポリ- D -リジン（シグマP - 7280 PDL）の10倍のストック溶液を調製。 </li><li> 1.0mlのアリコートを行います。このソリューションは、3ヶ月間-20℃で保存することができます。 </li></ol> MEDIA <ol><li> 10mlのを追加するB - 27サプリメント（Gibco社17504〜044）500mlのNBMボトル（Neurobasalミディアム、ギブコ21103から049）へ。 </li><li> 4で40 mlのアリコートとストアを行う℃に</li></ol> APV <ol><li> 10 mgのAPV（2 -アミノ-5 - phosphonopentanoic酸、シグマA - 5282）のバイアルに10 mlの滅菌H 2 Oを加えてよく混ぜる。 </li><li> -20℃で180μlのアリコートとストアを準備する</li></ol> BSA / Tiの <ol><li> 10 mlのDSで1グラムBSA（ウシアルブミン。シグマA - 7030）および1gトリプシンインヒビター（Sigma社T - 9253）を溶解する。 </li><li> 1N NaOHで7.4にpHを調整する。 </li><li> 0.2μmのシリンジフィルターを通して濾過することにより滅菌する。 </li><li> -20℃で400μlのアリコートと店に分ける</li></ol> L -システインエッペンドルフチュー​​ブに200μlのDSで0.6 mgのL -システイン（シグマC - 7755）を溶解する。 寒天（4％） <ol><li> 100ミリリットル滅菌水でバクト寒天4gの（ディフコ0140〜01）を溶解する。培養のために必要とされるまで4℃で保管してください。 </li><li>マイクロ波の寒天は、35mmペトリ皿を溶融し、充填する。クールダウンして重合するために座ってみましょう。 </li></ol>パパイン（ワーシントンLS 03126） NUNC培養ボトルIN&quot;&gt;非神経の文化をe_title コー​​ティング培養ボトル（4ヌンクボトル） <ol><li> 1X PDLを作るために10X PDLの3管のそれぞれに9 mLの滅菌水を追加。 </li><li>最初のボトルに30 mlの1X PDLを転送します。 </li><li>すべての成長の表面が覆われるまで若干移動する。 1分間放置します。 </li><li>第二瓶に1X PDLを転送する。 1分間放置します。 </li><li>目と前後のボトルで繰り返します。 </li><li> 150ミリリットル滅菌H 2 Oで2倍、4つのボトルをすすぐ</li></ol>酵素溶液（ES）を準備します。 <ol><li>結晶が溶解するまで0.8 mgのL -システイン（シグマC7755）を0.6ミリリットルの遠心管の重量で、150ミリリットルDSと渦を追加します。 </li><li> 15 mlコニカルチューブに5 mlのDSを転送して、L -システイン150ミリリットルを追加します。 </li><li>パパイン50ユニットを追加。 （ワーシントンLS 03126） </li><li> 7ミリリットル0.1N NaOHを追加します。 </li></ol> PREPARE MEM（GIBCO＃11090〜081） <ol><li> 500mlのMEMのボトルから65 mlを削除します。グルコースを準備するために10mlを保存します。 </li><li> 5ミリリットルペン/連鎖球菌を（Gibco社＃15070から063）を追加します。 </li><li> 10ミリリットル1Mグルコース（シグマG - 8270）（1.8グラム/ 10ミリリットルMEM）を追加します</li><li> 50ミリリットルのウシ胎児血清（ギブコ＃16140から071）または仔ウシ血清（オメガBC - 04）を追加します。 </li><li> 4でよく混ぜ、分注し、店舗℃の</li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27のサプリメント（NBM/B27） NBM、500ミリリットル（ギブコ＃21103から049）、B - 27（50X）、10ミリリットル（ギブコ＃17504〜044） <ol><li> NBMボトルとミックスにB - 27バイアルの全体の内容を追加します。 </li><li> 4℃で分注しストア</li></ol>脳組織の郭清<ol><li>ドライ解剖前の70％EtOHからツールを解剖。 </li><li> 3〜15ミリリットルチューブのそれぞれに10 mlのDSを転送します。 </li><li>仔マウス（P0 - P3）を選択すると、4本に3つの頭脳が必要になります。 </li><li> 35ミリメートルのペトリ皿に冷たいDSを追加。 </li><li>子犬マウスを刎ねると頭脳をばらばらにする。 </li><li>コー​​ルドDSを含むペトリ皿に脳を置きます。 </li><li>ガラスピペットを通過するのに十分小さい部分、に組織を切る。 </li></ol>酵素解離<ol><li>パスツールピペットでシャーレからできるだけ多くのDSを削除します。 </li><li> 0.2μmのフィルターと5ccシリンジを介してフィルタのES。 </li><li>組織と皿の中でESを置きます。 </li><li> ℃のインキュベーター（CO 2フリー）が30分間37℃で組織をインキュベートする。 </li></ol>組織を洗浄<ol><li>できるだけ少ないESとして取得することを確認しながら、最初のDSのチューブにガラスピペットで組織を転送する。 </li><li> 1500rpmで30秒間遠心します。 </li><li>組織と繰り返し手順をさらに2回転送する。 </li></ol>粉砕<ol><li> 50ミリリットル遠心管にMEM / FBSの38 mlを置きます</li><li>このペトリ皿に35mm皿と伝達組織にMEM / FBSの3 mlを追加します。 </li><li>優しく1000μlエッペンドルフピペットチップを介して摩砕することにより、組織を解離する。 </li><li> MEM / FBSの38ミリリットルを含むチューブに細胞懸濁液を移し、よく混ぜる。 </li></ol>めっき<ol><li>各ボトルに細胞懸濁液とメディアの同量を得るために直立培養ボトルスタンド。 </li><li>各培養瓶でMEM / FBSの90 mlを置く。 </li><li>各瓶の細胞懸濁液10mlを追加。 </li><li>ラベル：非神経、イニシャルと日付。 37℃および5％CO 2をインキュベートする。 </li></ol>摂食<ol><li> 3日目または4日に、暖かいMEM / FBS（デカントすべてのメディアとMEM / FBSの100mlでそれを置き換える）とフィード細胞。文化は、コンフルエントになるために7〜10日かかることがあります。 </li><li>デイ7-10 NBM/B27のメディアを変更してください。 </li><li>次の日、メディアを収集する。 0.22μmとフィルタ</li><li> 40mlのアリコートを作成し、MEM / FBSで培養を養う。 </li><li> 2または3日間、次の、NBM/B27ためにメディアを変更する</li><li>翌日、収集し、手順を繰り返します。 </li><li>約のためのメディアを集めておいてください。 2週間。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S9625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibraslicer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassim Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D (+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Media (NBM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invirtogen (Gibco)</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, 1N solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SS266-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0140-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington </td>
<td>LS 03126</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 0.2 &micro;m Syringe Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>DDA02025S0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Coverslips, No1, &#216;12mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bellco Glass Inc.</td>
<td>1943-00012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>11090-081</td>
<td>with Earle's salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>15070-063</td>
<td>for non-neuronal culture</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>16140-071</td>
<td>needed for non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-25</td>
<td>Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass bottom "Imaging dishes"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-10-C</td>
<td>Glass bottomed, &#216;35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures

このビデオでは、後期胚と早期出生後マウス脳から皮質ニューロン培養を生成するためのプロセスをガイドします。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムやナトリウムイメージング、蛋白質および/またはRNA分離など、様々なアプリケーションに使用することができます。これらの文化はまた、後期胚または出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供しています。手順は比較的単純であり、組織培養技術のいくつかの経験を必要とし、あなたが適切に準備されている場合2〜3時間を上回ってはいけません。視床皮質線維路から皮質外皮を慎重に分離が不要な非神経細胞の数が削減されます。上げるには神経細胞の収量は、酵素インキュベーションステップの後に優しく皮質組織片を砕いて粉にする。それが細胞や未熟神経細胞死への不必要な傷害を防ぐため、これは不可欠です。これらの文化は、グリア細胞のフィーダー細胞の非存在下で維持されているので、彼らはまた、神経細胞に富む成長する文化の付加的な利点を提供します。

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

このビデオでは、後期胚と早期出生後のマウス皮質からニューロン培養を生成するための手順を示しています。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムとナトリウムのイメージングに使用され、出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供することができます。

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

43.3K ビュー.  University of California, Irvine (UCI). このビデオでは、後期胚と早期出生後のマウス皮質からニューロン培養を生成するための手順を示しています。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムとナトリウムのイメージングに使用され、出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供することができ?...

ビデオ: Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

生物学

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

げっ歯類の新生児から一次分離した中脳ドーパミン細胞培養

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

コンパートメント文化の後根神経節ニューロンの準備とメンテナンス

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

ニューロンとグリアの開発研究ラットの脳の集計文化の調製

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

の準備アメフラシ感覚運動神経細胞の培養

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.