この研究は、サンパウロ・カルロス3世大臣（SAF2014-55700-P、PCIN-2013-019-C03-03およびPIE14 / 00034）、カタリナ・デ・レクレッサー・エスティス・アバナッツ（ICREA Academia-2010）また、X. M、VF-D。、およびFCは、「神経薬理学および疼痛」認定研究グループ（Catalunya Generaletat de Catalunya、2014 SGR 1251）に属しています。 。この作品はまた、CAPES（ブラジル）からFCへの &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciênciasem Fronteiras&quot;

全ての動物実験手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドライン11および欧州共同体に従ったガイドライン86/609/5に記載されているガイドラインに従って、バルセロナ大学動物実験委員会（CEEA） CCE、FELASA、およびARRIVEのガイドライン。したがって、マウスを標準的なケージに入れ、食物および水を自由に摂取させ、制御された標準条件下（7時間30分、22℃の温度および66％の湿度から始まる12時間の暗/明サイクル）で維持する。 1.不連続なスクロース勾配を用いたマウス脳シナプトソームの取得注：この方法は以前に報告された10 。 <ol><li>新鮮な分離バッファー（IB）、pH 7.4を調製する。 2Mスクロース; 1Mショ糖/0.1mM CaCl 2 ; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。 </li><li> Sa子宮頸管脱臼により5匹のマウスを裂く。各動物の脳を断ち切って迅速に除去する。目的の脳領域（すなわち、海馬、新鮮な組織0.25~0.35g）を摘出し、1mLのIBを含む氷上の5mL Potter-Elvehjemガラス管に入れる。 </li><li>ホモジナイジングスターラー（1分間に700〜900回転で10ストローク）を使用して、好ましくは氷浴中で組織をホモジナイズし、サンプルの加温を防止する。 </li><li> 4℃で2Mスクロース6 mLと0.1 mM CaCl 2 2.5 mLを含む15 mLチューブにホモジナイズした組織（1 mL）を入れます。チューブを逆さにしてゆっくりと混合する。 注：カルシウムの添加は、オルガネラ間の接着相互作用を維持し、それによって異なる「密度」の構造を維持するために不可欠です。 </li><li>溶液を12mLの遠心チューブに入れ、スクロースグラジエントを形成するために各チューブの上に2.5mLの1Mショ糖/0.1mMのCaCl 2をゆっくり加える。 注：ラベルの位置o恒久的なマーカーを用いて遠心チューブ上の勾配界面。 </li><li>対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを100,000× gおよび4℃で3時間遠心分離する。すべてのスチールサポート（必要に応じて空の場合もあります）でロータを完全に充填します。 </li><li>ミエリンを含む最上層を捨てる。パスツールピペットで、シナプトソーム画分に対応する1.25-Mと1-Mスクロース間期の間に白いリングを集める。 </li><li>遠心管内でIBを用いてシナプソームを9倍に希釈する。 </li><li>対応するスチールサポート内のIB溶液と閉鎖蓋で遠心チューブを計量して平衡させます。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して15,000 x g 、4℃で30分間チューブを遠心分離する。 </li><li>上清を捨てて再懸濁する1.1mLのIB溶液を添加した。このシナプトソーム溶液100μLを集め、11,000 x gと4°Cで5分間遠心します。 </li><li>シナプトソームペレットを5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に再懸濁し、-20℃で保存します。 注：このサンプルは、さらなるウェスタンブロット解析のための総シナプトソーム画分に対応します。残りのシナプトソーム画分（〜1 mL）は、使用するまで-20℃で凍結するか、その後のシナプス後分画のために処理することができます。シナプトソームまたは精製されたシナプスは、総海馬体積の1〜2％を占める。 </li></ol> 2.前シナプス後シナプスおよび後シナプス間の分離<ol><li>新鮮な可溶化緩衝液（pH6.0）を2倍調製する; 1×可溶化緩衝液、pH6.0;可溶化緩衝液、pH8.0; 0.1mM CaCl 2 （ 表1を参照のこと）。溶液を氷上で冷やす。 注：これらの溶液のpHは正確でなければならない良好な亜シナプス分画を達成するように調整した。 </li><li> 1mLの再懸濁したシナプトソーム画分（ステップ1.12参照）を5mLの0.1mM CaCl 2でゆっくり希釈する。 </li><li>同じ容量（5mL）の氷冷2倍可溶化緩衝液（pH6.0）を添加し、氷上でビーカー内で高攪拌しながら氷上で50分間インキュベートする。 注意：pH6.0のTriton X-100の1％はすべての原形質膜タンパク質を可溶化しますが、シナプスの接点または接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス後）にタンパク質を保存します4 。 </li><li>溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じたふたの中で、0.1mMのCaCl 2および2倍の可溶化緩衝液pH6.0の等容量の試験管を秤量し、平衡化する。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000 x gで4℃で30分間遠心します。得られた上清は、シナプス外画分を表し、ペレットはシナプス接合部（ すなわちシナプス前およびシナプス分画）に対応する。 </li><li> 4000 xgと4℃で遠心分離した15 mL 10Kフィルターチューブを使用して、シナプス外分画を含む上清を最終200μL容量に濃縮する。 </li><li>得られた濃縮シナプス外画分（200μL）を予冷（-20℃）アセトン5倍量（1mL）で-20℃で一晩沈殿させる。 </li><li>翌日、シナプス外画分を18,000× gおよび-15℃で30分間遠心する。遠心分離後、アセトン上清を捨て、ペレットを乾燥させてアセトンの痕跡を除去する。 </li><li>最後に、シナプス外タンパク質を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。必要であればペレットを超音波処理する。 </li><li>それを混乱させることなく、前及びシナプス後画分を含むペレットを2mLの1×可溶化緩衝液、pH6.0で注意深く洗う。バッファを破棄します。 </li><li> Resuspendガラス製パスツールピペットを用いて、10mLの1×可溶化緩衝液（pH8.0）でペレットを洗浄する。 注：pH 8.0のTriton X-100の1％はシナプス前特殊化を可溶化しますが、不溶性のシナプス密度4を維持します。 </li><li>氷上でビーカー内で高攪拌下、懸濁液を氷上で50分間インキュベートする。 </li><li>溶液を遠心管に入れる。それらの対応するスチール支持体内およびそれらの閉じた蓋で、チューブを1x可溶化緩衝液（pH8.0）で計量して平衡化する。 </li><li>スイングバケットローター遠心分離機を使用して、チューブを40,000× gおよび4℃で30分間遠心分離する。得られた上清はシナプス前分画に対応し、ペレットはシナプス後分画に対応する。 </li><li>ステップ2.6-2.9で説明したように、シナプス前分画を含む上清を処理する。 </li><li>シナプス後画分を含むペレットを200μLの5％SDSで再懸濁する。ペレットを超音波処理する、私はfが必要です。 </li></ol> 3.膜の分画を確認するためにイムノブロットでサンプルを分析する。 <ol><li>ビシンコニン酸タンパク質アッセイを用いて、各画分中のタンパク質の量（ すなわち、全シナプス、シナプス前およびシナプスの画分）を決定する。 </li><li>各画分から20μgのタンパク質を取り、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）サンプルバッファーで50μLの最終容量に希釈します。 100℃で5分間沸騰させる。 </li><li>還元条件下で4％濃縮ゲルを用いてSDS-PAGE電気泳動により10％のタンパク質を分離する。色素が下部ゲルに入り、電圧を120Vに上昇させるまで、80Vの定電圧で電気泳動する。 </li><li>タンパク質をPVDFメンブレンに移し、IBブロッキング溶液で45分間、室温で連続的に振盪しながらブロックする。 </li><li>示された一次抗体（ すなわち、抗SNAP-25、抗PSD-95、抗シナプトフィジン、または抗GPR37）を、IBブロッキング溶液中で希釈して、連続的に振とうする。 </li><li>結合していない一次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。 </li><li>示された二次抗体と一緒に、連続的に振とうしながら暗所で室温で90分間インキュベートする。 </li><li>結合していない二次抗体を除去するために、IB洗浄液で膜を3回（それぞれ10分間）洗浄する。 </li><li>メンブレンを化学発光基質とインキュベートする（暗条件下で、溶液Aと溶液Bの1：1の割合でメーカーが提供する）。 </li><li>化学発光検出装置で膜を分析する。 </li></ol>

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	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

シナプス伝達はシナプスの物理的完全性に依存しており、これはフォスターとシェリントンによって1897年に早期に構想された概念である。したがって、重要な神経伝達成分（ 例えば、イオンチャネル、受容体など ）の分布を理解することは、正常状態および病理学的状態の両方におけるシナプス機能を解明するために不可欠である。電子顕微鏡（EM）は、プロトタイプの中枢神経系（CNS）シナプスの現在の超微細構造の概念に非常に貢献している。そのようなやり方で、EMは、プレ・シナプス密度とシナプス後密度との間の差異を細かく確立しており、これはかなり均一な距離（約25nm）の裂け目で分けられている。興味深いことに、シナプス後の装置は、その原形質膜の下に比較的連続した電子密度の高い肥厚、いわゆるシナプス後密度、すなわちPSD2を示す 。逆に、シナプス前の装置では、不連続細胞マトリックスネットワークは原形質膜のすぐ下に配置され、シナプス小胞の細胞膜活性ゾーン3への整列およびドッキングに必須である。したがって、EMは、構造的に保存されたCNSシナプス内のタンパク質の分布を調査するための黄金実験アプローチを構成する。しかしながら、電子顕微鏡写真によって提供される情報は静的である。事実、蓄積する証拠は、in vivoシナプスが非常に動的であることを示し、したがって、持続的なシナプス伝達に劇的な構造変化を経験する。さらに、シナプスの形態および組成は、様々なCNS領域の全体にわたって、ならびに発達、成熟、老化および神経病理学的状態の発生によって変化し得る。全体として、生理学的条件における異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離することに焦点を当てたプロトコルは、シナプス機能のより包括的な研究のための貴重なツールである。 らによって最初に記載されたこの膜分画法は、 （2001） 4は、シナプス前およびシナプス後の装置内で生じる接着相互作用を弱めるpHシフトに基づいている。第1に、pH6.0の中性洗剤を用いることにより、シナプス前および後シナプスの装置を保持し、可溶化されてシナプス接触から抽出されるシナプス外膜ドメインから維持される付着接合を識別することが可能である。続いて、中性洗剤の存在下でpHを6.0から8.0に上げると接着結合の強度が弱まり、シナプス前活性領域がシナプス密度に強く結合した状態に保たれる。したがって、シナプス前区画は、潤滑され、シナプス密度から分離することができ、これは使用される界面活性剤の濃度がその可溶化を促進しないためにほとんど保存される4 。興味深いことに、最終的に90％より高い分画効率は、異なるシナプス後マーカーによって確認することができる： i ）シナプス前活性ゾーンからのシナプトソーム関連タンパク質25（SNAP-25）; ii ）シナプス間隙画分（ すなわち、活性領域の外側およびミクロソームを含む）からのシナプトフィジン。およびiii ）シナプス密度からのシナプス後密度タンパク質95（PSD-95）。特に、この脳膜分画法はうまく使用されています。したがって、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）受容体5 、アデノシンA 1受容体（A 1 R） 6 （AMPA）受容体などの様々な受容体の副シナプスの局在を正確に決定することが可能であった。 、アデノシンA 2A受容体（A 2A R） 7 、アデノシン三リン酸（ATP）P2受容体8 、ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニット9 、およびパーキンソン病関連受容体GPR37 10 。しかしながら、多くの制限が、特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の適切な評価を妨げる可能性がある。したがって、この手順では、プロトコール全体を完全に記述するだけでなく、必要とされる組織の量が多量であること、タンパク質の収量が低いこと、およびタンパク質の効率を検証するための必須要件など、明確な実験を行う前にそれぞれの分離。

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Non fat dry milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Compact Balance EK-610</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td><td></td><td>Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>Primary antibodies diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:30,000</td></tr></tbody></table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

シナプスタンパク質の組成および機能を評価することは、神経科学において重要な課題である。しかし、シナプス内で起こる神経伝達を動的タンパク質 - タンパク質相互作用およびリン酸化事象によって高度に制御されるので評価することは容易ではない。したがって、シナプス伝達を研究するためにいずれかの方法が使用される場合、主要な目標は、これらの一時的な生理学的修飾を保存することである。ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。換言すれば、プロトコールは、シナプス前、シナプス後およびシナプス外区画からタンパク質濃縮を行うための生化学的方法論を記載している。第1に、シナプトソームまたはシナプス末端は、不連続なスクロース勾配を用いてすべてのシナプスコンパートメントを含むニューロンから得られる。注目すべきは、この初期シナプス膜調製物の品質はc儀式的。続いて、異なるpH条件下で穏やかな界面活性剤を用いて軽度の可溶化を行うことにより、種々の副シナプスコンパートメントの単離が達成される。これにより、勾配遠心分離および等密度遠心分離による分離が可能になる。最後に、様々なシナプスタンパク質マーカー（ すなわち、 SNAP-25、PSD-95、およびシナプトフィジン）を用いたイムノブロット分析により、異なるシナプス後区画（ すなわち、シナプス前およびシナプス後の膜画分）任意の特定のニューロンタンパク質のシナプス分布の直接評価を可能にする。

記載された方法論は、一般に、ニューロンタンパク質の潜在的なシナプス分析、および特にシナプス受容体の単離および生化学的特徴づけのために、主に使用されてきた5,6,7,8,9。興味深いことに、ここに表示された代表的な結果は、オーファンGタンパク質共役受容体、すなわちパーキンソン病関連受容体GPR37 10のシナプス下海馬分布の解析に対する?...

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K ビュー.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat. ここでは、異なるシナプスコンパートメントに属するタンパク質を単離するための堅牢な手順を表す脳膜分画プロトコルを提示します。 

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

神経科学

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS induces generalized tonic-clonic seizures with low mortality and neuronal death and is a widely-used model to screen anti-epileptic drugs. Here, we describe an ECS induction method in which a brief 55-mA current is delivered for 0.5 s to male rats 200 - 250 g in weight via ear-clip electrodes. Such bilateral stimulation produced stage 4 - 5 clonic seizures that lasted about 10 s. After the cessation of acute or chronic ECS, most rats recovered to be behaviorally indistinguishable from sham &#34;no seizure&#34; rats. Because ECS globally elevates brain activity, it has also been used to examine activity-dependent alterations of synaptic proteins and their effects on synaptic strength using multiple methods. In particular, subcellular fractionation of the postsynaptic density (PSD) in combination with Western blotting allows for the quantitative determination of the abundance of synaptic proteins at this specialized synaptic structure. In contrast to a previous fractionation method that requires large amount of rodent brains, we describe here a small-scale fractionation method to isolate the PSD from the hippocampi of a single rat, without sucrose gradient centrifugation. Using this method, we show that the isolated PSD fraction contains postsynaptic membrane proteins, including PSD95, GluN2B, and GluA2. Presynaptic marker synaptophysin and soluble cytoplasmic protein &#945;-tubulin were excluded from the PSD fraction, demonstrating successful PSD isolation. Furthermore, chronic ECS decreased GluN2B expression in the PSD, indicating that our small-scale PSD fractionation method can be applied to detect the changes in hippocampal PSD proteins from a single rat after genetic, pharmacological, or mechanical treatments.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy for severe depression. ECS globally stimulates activity in the hippocampus, leading to synaptogenesis and synaptic plasticity. Here, we describe methods for ECS induction in rats and for subcellular fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in synaptic proteins.

電気けいれん発作になったラットとシナプス後密度タンパク質のてんかん発作による変化を調べることで

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

蛍光抗体法を用いたマウス脳内シナプス蛋白質の不均質分布の定量化

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

機能研究のためのヒトシナプス受容体を再活性化するためのシナプス膜の微小移植

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.

マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

脳膜分画：

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