この研究は、ビクトリア州政府のOIS​​プログラム、国民健康、オーストラリアのプログラムやプロジェクトの助成金の医学研究評議会（JPFチン-塵）と大学院の奨学金（Dミッシェル）によって部分的にサポートされていました。

1。頸動脈を分離<ol><li> CO 2 / O 2窒息経由Euthanase10週齢のSprague Dawleyラット。 </li><li>最小限の血管の伸縮性を確保大動脈、心臓と消費税の左と右の総頸動脈。 </li><li>氷冷クレブス緩衝液中で大動脈と心臓から頚動脈を分離し、緊密な解剖を行う。 </li><li>マウントする前に氷上でクレブスで孤立した血管を保つ。 </li></ol>約。時間= 45分 2。プライミング容器室<ol><li> 37バッファを介し℃、carbogenガス（5％CO 2 95％O 2）を導入することで、生理的pHに維持血管チャンバーフラッシュクレブスバッファーの近位および遠位のコネクタで</li><li>チューブやカニューレが完全にフラッシュされると、整列されていることを確認します。 </li><li> P1（近位）とP2（遠位）変換器を介してクレブスバッファーをフラッシュします。トランスデューサには、気泡のないことを確認するためにタップを閉じます。 </li><li>対応するコネクタにトランスデューサを接続し、再び空気の泡を確実にない、よりクレブスバッファーをフラッシュします。チャンバーにタップをオフに閉じてください。 </li></ol>約。時間= 15分 3。血管の加圧室<ol><li>圧力機器の電源をオンにします。圧力サーボ、圧力モニター、蠕動ポンプ（図1）。 </li><li>圧力は20 mmHgの（1のダイヤル）でチューブを介して自動実行クレブス緩衝液の圧力のサーボで蠕動ポンプと、空気の泡を保証しません。 </li><li>閉じたP2トランスデューサにチューブを接続します。圧力が安定になります。 </li><li>どんな泡を吐き出すのに血管チャンバーにP2のタップを開くには、その後オフ閉じます。 </li><li>クレブスバッファー（ - 7 mLの5）と風呂を埋める。 </li></ol>約。時間= 10分 4。容器の取り付け<ol><li>各カニューレ上に解剖顕微鏡の代わりに黒のポリエステルネクタイ（図2）に基づく。 </li><li>離れてカニューレとカニューレホルダーを移動して、P1のカニューレ上にマウント¼容器（大動脈弓の端）。容器を引き裂くしないことを確認します。 </li><li>クレブス緩衝液で満たされた注射器を使用すると、静かにP1のトランスデューサーを介して血管の過剰な血液を洗い流す。チャンバーにP1をオフに閉じます。 </li><li>ポリエステルのネクタイとP1のカニューレに安全な容器。 </li><li> P2カニューレに取り付けるためのカニューレ/近いカニューレホルダーを移動します。 </li><li>遠位カニューレに容器の先端を（〜¼長さの）マウントします。ポリエステルタイで固定します。 </li></ol>約。時間= 20分 5。容器を加圧<ol><li>容器内に曲げたり、ストレッチを確保しないようにカニューレホルダーを調整します。 </li><li> P1とP2は、チャンバーに閉じた状態で自動から手動に圧力サーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下が存在しない圧力のサーボを確認してください。ある場合は、リークが発生している接続と変換器は、所定位置に固定する必要があります。 </li><li>チャンバーへの自動その後オープンP2に背圧サーボを調整します。顕微鏡下でタップをチャンバーに開いたときに血管が拡張させ観察。 </li><li>マニュアルに圧力のサーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下のためにもう一度確認してください。漏れがある場合、システムはタイトな圧力と容器内の穴になる可能性がありますされていません。 </li><li>チャンバーに自動オープンP1に切り替えます。手動設定で圧力が安定していることを確認してください。 </li><li>ない漏れの場合、手動設定の増加ダイヤルの2（40 mmHgの）へ。 </li><li>自動に調整し、顕微鏡下で血管を観察。必要に応じて、手動設定に漏れがないvessel.Checkには曲がりのないことを確認するためカニューレホルダーを調整する。 </li><li> 5.7所望の圧力に到達するまでに、3（60 mmHgの）を4（80 mmHgの）などのダイヤルを増やす - 手順5.6を繰り返します。 </li></ol>約。時間= 15〜30分 6。加圧容器をインキュベート<ol><li> 37温度コントローラセットを接続℃を</li><li>血管室バスへの2番目の蠕動ポンプ散らすクレブス緩衝液（1 mL /分）で。 </li><li>バスの唯一の最上位層が除去されることを保証室にアスピレータを接続します。 </li><li>自動に設定された圧力で1時間、37℃で加圧された容器をインキュベートする。 </li><li>圧力が定期的に（手動への切り替え）漏洩されていません確認してください。 </li><li>様々な薬理学的介入の効果は、単にインキュベーション中にお風呂に化合物を添加することによって観察することができます。 </li></ol>約。時間= 1時間 7。全血と加圧容器を灌流<ol><li>インキュベーション中に少なくとも7.5 mLのヒト全血/ 40 Uのヘパリン/ mLの血液中に収集された容器を得る。 37℃で50mlファルコンでインキュベート℃の</li><li> tの最後の10分前37彼10分間VybrantDil（1:1000）とインキュベーションのラベルの血·ダークのC。 </li><li> 10分後、気泡をクリアシリンジで血液を収集し、37℃で設定されたヒートジャケット℃でシリンジポンプに取り付けて</li><li>室/容器にP1のトランスデューサをオフに閉じ、シリンジと廃液チューブを接続する。 </li><li>任意の気泡を除去するため廃液チューブを介して1000μL/ minでパージの血液。 </li><li>チャンバーにP1を開きます。圧力のサーボは、所望の圧力を維持するために自動的に調整されます。 </li><li> 100μL/ minの血液を灌流。 </li><li>デジタルカメラのレコード1で15秒間灌流血管の2つのフィールド、3、5、7.5および10分に結合蛍光顕微鏡を使用する。 </li><li>郵便灌流血管内皮の完全性と機能がさらに炎症反応を検証するために免疫組織化学によって決定することができるようミオグラフと接着分子の発現などの薬理学的技術を介して評価することができる。 </li></ol>約。時間= 15分 8。代表的な結果： 圧力室のセットアップの概略図を図1に示されています。と蛍光顕微鏡の結果に結合デジタルカメラは、ライブビデオの録画を経由して瞬時に視覚化することができます。代表的なビデオ画像は、白血球が、彼 ​​らが10秒間静止残った場合内皮に付着すると考えられる図3に見られている。連続ループ接着細胞でのビデオ録画とフィールド当たりの平均としてカウントすることができます。低い（ 図3A）と高い（ 図3B）圧力の両方に密着性のある量の高い管腔内圧における白血球接着の顕著な増加を引き起こすだろうが見られ、これはまた、（ 図4）定量的に実証される。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> 図1。加圧ex vivoでの血管チャンバー概略図。近（P1）変換器と血圧が容器内で操作できるようにする、遠位（P2）変換器に接続されているカニューレ容器。灌流は、P1のトランスデューサーを介して、圧力はP2変換器を介して維持されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> 図2。タイでCannuala。黒いポリエステルのネクタイは、各カニューレに接続されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> 図3。灌流の10分後の代表的なビデオ画像を 80 mmHgの（）で蛍光下。ダイナミック細胞接着（赤矢印）、120 mmHgの（B）。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> 図4。低い（80 mmHgの）と高圧（120 mmHgの）で1時間のインキュベーション後のSprague Dawleyラット頸動脈の動脈における白血球接着。 *** P &lt;0.001、としてBonferroniの事後検定を用いて2方向反復測定ANOVAで分析した。

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	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

治験実施計画書は、アルフレッド医学研究と教育分署動物倫理委員会とアルフレッド病院倫理委員会によって承認された。

これはリアルタイムで加圧条件下では無傷の孤立した血管の内皮への白血球の接着を研究するために修正された方法です。容器室の血流だけでは、大規模なマウスやラットの血管の炎症誘発性菌株の迅速な検証が可能になります。圧力操作を有効にすると、より良い模倣- ING生理学的および病態生理学的状態、動的な細胞間相互作用が非常に高い腔内圧力に低いから観察することができます。血管の直径は、十分な細胞イメージングプログラムを使用して測定することができるため、せん断流れおよび速度を決定し、したがって、操作することができます。 そのミオグラフ機能により、浴室に置かれた薬理学的介入は、このモデルは機械論的とシグナル伝達経路の研究を可能にすると可能な実験条件に別のディメンションを追加します。内皮保存が圧力の操作中に確認することはできませんが、アセチルコリンとPEへの応答がポスト灌流9を行うことができる。 それは、このセットアップは、細胞間の相互作用ではない拍動血流も収縮期または拡張期圧の影響についての管腔内圧の影響を示すことに注意する必要があります。白血球接着に対する急性圧力の変化が観察された一方さらに、、この設定はまた、慢性的な圧力の効果（すなわちインキュベーション時間の増加と慢性的な圧力の動物モデルを用いて）を見に利用することができます。のSprague Dawleyラット総頚動脈は、このセットにまで実証されていますが、他の系統と種は、カニューレのサイズに適切な調整で使用することができます。確かに、動物の年齢と体重がセットアップ船舶ごとに個別化する必要があることをこのように容器のサイズに影響を与えるとことに注意することが重要です。結合組織の密接かつ慎重に解剖は非常に白血球の可視化を向上させることができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>カールツァイス株式会社</td><td>ステレオディスカバリーV.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td> 70から2016 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラとコントローラ</td><td>浜松ORCA - ER </td><td> C4742 - 95 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光照明システム</td><td>ルーメンダイナミクス</td><td> X - Citeの120 </td><td></td></tr><tr><td>血管の商工会議所</td><td>リビングシステムの計装</td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td>圧力サーボコントローラとペリスタルティックポンプ</td><td>リビングシステムの計装</td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td>灌流圧モニター</td><td>リビングシステムの計装</td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 ×圧力変換器</td><td>リビングシステムの計装</td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラ</td><td>リビングシステムの計装</td><td> TC - 01 </td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>インステックラボラトリーズ株式会社</td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil細胞標識溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> V - 22885 </td><td> 1:1000を使用してください</td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

世界中で、高血圧は、人口の約4分の1であることが報告と死亡率、世界中の主要な生物医学的危険因子です。血管性高血圧では血管内皮機能障害とアテローム性動脈硬化症や慢性腎臓病2、脳卒中3心不全4など様々な疾病状態につながる増加炎症に関連付けられています。アテローム発生につながる血管の炎症の初期段階では、内皮を介して白血球のローリング、テザリング、アドヒアランスやその後の転生を含む接着カスケードです。内皮への白血球の動員と蓄積は、血管細胞接着分子-1（VCAM - 1）、細胞内の細胞接着分子-1（ICAM - 1）とE -セレクチンと同様の増加などの接着分子の発現増加によって媒介されるサイトカインとケモカイン放出と活性酸素種のアップレギュレーション5。このような静的な接着アッセイなどのin vitro法では細胞間接着に関与するメカニズムだけでなく、細胞接着分子の解析を判断するのに役立ちます。 in vitro試験前で採用されている手法は、内皮上に圧力の急性の増加が単球接着、6しかし、in vitro試験の多くと同様に、これらの結果がリアルタイムで行われていない接着分子と炎症マーカーの発現上昇につながることができることが実証されている生理的流れの条件下で、また全血を持つ。したがって、in vivo試験では 、ますます血管炎症とプラークの開発を実証するために動物モデルで利用されています。生体顕微鏡検査は現在では広く白血球接着、ローリング、マイグレーションと転生7-9を評価するために使用されます。 in vivo試験内皮接着する白血球に圧力の効果を組み合わせるときには、それほど広範です。そのような研究は、免疫組織化学10を介して評価された動脈の成長とリモデリングが炎症マーカーのフローとせん断のリアルタイムエフェクトを調べます。ここでは、全血灌流を使用して無傷の加圧された血管のリアルタイムで白血球の接着を記録するためのモデルを提示する。方法論は、無傷の血管の白血球-内皮接着剤の相互作用のリアルタイム解析を可能にするex vivoの血管室灌流モデル9の変更です。私たちの修正は、管腔内圧だけでなく、生理的な流れの条件だけでなく、加圧条件下での試験を可能にする最大200 mmHgの操作が可能になります。圧力の筋運動記録法のシステムが以前に血管壁と内腔直径11だけでなく、血管の収縮を観察することが立証されているが、これはリアルタイムで白血球-内皮相互作用を示す初めてのことです。ここでは、頸動脈ラットから採取し、蛍光顕微鏡に結合カスタムメイドのフローチャンバーへのカニューレを使用して技術を実証する。容器のチャンバーは、画像の容器を、短い作動距離と大口径対物レンズを可能にする大規模な底のカバーガラスが装備されています。さらに、選択されたアゴニストおよび/またはアンタゴニストは、さらに細胞接着を制御するメカニズムを調べるために利用することができます。生体顕微鏡に比べてこの方法の利点は、侵襲手術のない関与を含んでいないため、より高いスループットを得ることができます。生体内では唯一の全身阻害剤の治療を可能にするのに対し、この方法はまた、所望の容器にローカライズされた阻害剤の治療を使用できるようになります。

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

これは収穫加圧された血管の内皮への白血球の接着を可視化する方法です。テクニックは、このように高血圧の病態生理学的条件を模倣 - イング200 mmHgに管内の圧力に異なるとのせん断流動下で血管の密着性を研究することができます。

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K ビュー.  Monash University. これは収穫加圧された血管の内皮への白血球の接着を可視化する方法です。テクニックは、このように高血圧の病態生理学的条件を模倣 - イング200 mmHgに管内の圧力に異なるとのせん断流動下で血管の密着性を研究することができます。

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

免疫・感染学

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価する<em&gt;エクスビボ</em&gt; Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

生物工学

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

発生生物学

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Source: Herr, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53077">Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

炎症マウスモデルにおける血球-内皮相互作用を分析するための生体内顕微鏡法

Source: Herr, N. et al., Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. ...

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

要約

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白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで