SSはウェルカムトラストプログラムグラントウェルカムトラスト中間臨床フェローシップ、CWによって資金を供給される。

1。マイクロスライドの準備<ol><li>プレコートラット尾コラーゲンI型（220μg/ mlのの作業希釈を与え、PBSで1:100に希釈したRTC）と6チャンネルマイクロスライド。これは、直接チャネルに希釈されたRTCの溶液30μlを注入し、PBSで3回洗浄し、続いて37℃で2時間、インキュベートすることによって行われる。 </li></ol> 2。マイクロスライド内の細胞を播種<ol><li>トリプシン-EDTAで（前に13説明されているように、肝臓組織から単離された）培養ヒト肝類洞内皮細胞の融合T75フラスコ（HSEC）を解離する、完全なメディア（ヒト内皮中3×10 6個/ mlのPBSで洗って、再懸濁基本培地は、2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン、10％熱不活性化ABヒト血清、血管内皮増殖因子の10 ng / mlのおよび肝細胞増殖因子の10 ng / mlの）を補充した。悲惨な細胞懸濁液30μLを注入CTLY各チャンネルに。 </li><li> 37の加湿インキュベーター中で1時間付着させた細胞を残す スライドラック上の5％のCO 2雰囲気でC°。細胞を、完全培地（ 図1）、各チャネルの両側のポートを埋める付着させた。 </li></ol> 3。細胞のサイトカイン刺激<ol><li> 24時間培養器内の細胞を残す。倒立位相差顕微鏡を用いて細胞増殖を評価する。従来接着アッセイ24時間、腫瘍壊死因子αおよびインターフェロンγによって補充した完全培地、10 ng / mlの少なくとも両方で成長培地を置き換えることによりサイトカインと内皮単層を刺激。 </li></ol> 4。末梢血リンパ球を単離する<ol><li>最初に800で25分間、適切な細胞遠心分離媒体を介して密度勾配遠心分離によって単核画分を精製することによって、全血から末梢血リンパ球を単離するXグラム。単球の接着を可能にするために1時間プラスチック上の細胞をインキュベートします。 </li><li>プラスチック吸引するために遵守以下のリンパ球は、上澄みを濃縮。リンパ球を洗浄し、流動媒体中で（典型的には1×10 6細胞/ ml（内皮細胞基本培地は、0.1％（v / v）のウシ血清アルブミン（BSA））で再懸濁します。 </li></ol> 5。インヒビターを有する内皮や白血球の前処理<ol><li>内皮media/0.1の％（V / V）BSA中に抗体または小分子阻害剤をブロックする機能が推奨される希釈液を準備します。 30分前にアッセイを流れるように選択したマイクロスライドチャネルで抗体/阻害剤溶液をブロッキング完全培地を交換してください。 </li><li>リンパ球上のケモカイン受容体の前処理が計画され、（v / v）のBSA、0.1％を含有するRPMI溶液中で単離された白血球を再懸濁し、ケモカイン受容体のGタンパク質共役受容体活性をブロックするために百日咳毒素200ngの/ mlでインキュベートする場所、あるいは特定の希機能推奨される希釈で抗体またはケモカイン受容体の小分子阻害剤を遮断する。次いで、流動媒体中で洗浄し、再懸濁し、30分間37℃で白血球をインキュベートする。 </li></ol> 6。フローアッセイシステムのセットアップ<ol><li> 37にサーモスタット制御透明チャンバーを予熱し ℃、チャンバーはほとんどないデッドボリュームで細胞とメディアの間で切り替えることができる電子ソレノイドバルブ用のシリコンチューブと電子の供給を挿入するためのポートを持っている必要があります。チャンバは、位相差顕微鏡法を可能にするために倒立顕微鏡に装着されている。 図2は、顕微鏡ステージ上に載置されたフローチャンバーアッセイ、顕微鏡およびマイクロスライドを示す。 </li><li>滅菌蒸留水10mlとルアーロックで50mlのガラスシリンジにあらかじめ、シリンジ口25センチメートルシリコーンチューブの長さを取り付ける。シリンジポンプに挿入します。に係るシリンジポンプの取出し速度を変化させる0.05 Paで（0.5ダイン/ cm 2、 図3）のせん断応力を維持するために、マイクロスライドの製造元の説明書。 </li><li> 、2 5ミリリットルの注射器を取るプランジャーを破棄して、シリコンチューブを用いた電子ソレノイドバルブの2の流入ポートに樽を添付します。 <ol><li>アウトフローバルブにシリコンチューブ12センチ取り付けます。弁は、無細胞洗浄緩衝液（内皮media/0.1の％（v / v）のBSA）およびリンパ球懸濁液の間の交替を可能にする。 </li><li>両方のシリンジバレル内の洗浄緩衝液を挿入し、バッファ一バレルからバルブを通って流出するシリコーンチューブに流入されたことを確認することによって、電子ソレノイドバルブをフラッシュする。 </li><li>他のバレルへの代替、バッファが流れると、すべての気泡がシステムから削除されていることであることを確認するために、バルブスイッチを使用します。樽の1から洗浄バッファーを削除し、リンパ球のサスペンション図4aと交換してください。 </li></ol></li><li>シリコンtubinを接続マイクロスライドのアダプタを介して選択したマイクロスライドチャネルの1ポートにシリンジポンプからのG。そして、マイクロスライドのアダプタを介して反対側のポートに流出弁からシリコンチューブを接続してください。シリコンチューブやアダプタは気泡がシステム（ 図4b）を入力することを防ぐために、接続前に、洗浄緩衝液で満たされていることを確認します。 </li><li>フローシステムに接続されると、顕微鏡のステージ上のマイクロスライドを配置し、動きを防ぐために、クリップやテープで取り付けます。適切な位相設定と一緒に10倍の対物レンズを顕微鏡を設定します。内皮単層を接眼レンズを使用して可視化し、焦点が合っていることを確認してください。確保画像は、画像をモニタに中継し、記録することができる顕微鏡に取り付けられたカメラを介して撮像することができる。 </li></ol> 7。分析のためのフローアッセイ技術と接着の記録<ol><li> withdrawaを開始することによって2分間洗浄緩衝液で内皮層を潅流破片または未結合のブロッキング抗体を除去し、次いで0.05 Paの一定の壁せん断応力における白血球溶液を5分間ボーラスを可能にするためのバルブを切り換えるシリンジポンプlの</li><li>白血球ボーラスの最後の2分の間に、マイクロスライドの長さに沿って10のランダムなフィールドの値を記録。これは内皮単層上のリンパ球の転がり/テザリングのオフライン解析が可能になります。次の移動する前に、約10秒間、各フィールドを記録し、記録が立て続けに二度同じローリング細胞を記録避けるために、流れの方向に対して行われていることを確認。 </li><li>そのスタート位置にバルブを返すことで、洗浄バッファーの5分のボーラスと白血球ボーラスに従ってください。このボーラスの最後の2分間でマイクロスライドの長さに沿って少なくとも10個の無作為に選択したフィールドを選択することによって、第二の記録段階を実行する。次の移動する前に、約5秒間、各フィールドを記録していることを確認し内皮単層、付着leucocytesは明確な焦点である。これは接着のパターンのオフライン解析が可能になります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していない

首尾フローアッセイを実施するための最も重要なステップは、内皮細胞の健康でコンフルエント単層が前に流れ接着アッセイする準備ができていることを保証することである。初代内皮細胞は、培養が困難と培養方法の変化に敏感であることができる。それは、1）フローチャンバーが適切にかつ均一に単層の内皮細胞で被覆されることが重要である。HSECために、我々は、ラット尾部コラーゲンタイプIを使用するが、これは他の内皮集団について異なる場合があり、2）、培養培地は、細胞のタイプに適したHSEC私たちは、プロトコルのセクションで私達の完全培地を記載している。他の重要なステップは、せん断応力の生理学的レベルを反映するために適切な速度でシリンジポンプを設定することを含む。 フローアッセイ中には、内皮細胞単層に損傷を与えたり、内皮表面から免疫細胞を除去することができる流れ回路内の気泡を防止する必要がある。これは、英語を防止することができるすべてのシリコンチューブとアダプターは、すべての気泡が除去されることを、接続前に、洗浄緩衝液で灌流し、メディアは使用前に温めておいていることをしていることをジューリング。マイクロスライド上のポートにアダプタを接続する場合、接続時の液/液界面が存在することが非常に重要である任意の空気がある場合、これは、シリンジ離脱中の内皮単層を破壊するシステム内の空隙を形成するステップ。シリンジバレル内の白血球溶液は、細胞がこのようにして、実験を通して一定の細胞密度を維持し、沈降しないことを保証するために定期的な攪拌を必要とする。 記録工程の間には、内皮層の画像が適切に焦点を合わせ、正確なオフライン分析を可能にするためにクリアされていることを確認することが重要であり、それはフローアッセイ（ポスト白血球ボーラス）の第二ステップの間に十分な時間を、洗浄緩衝液中に残っている記録前相は、次のことを確認するために再開されるすべての非付着白血球が削除されます。同様に、狭い毛細血管内の流れパターンを妨害し得る細胞の損失を防止し、また位相差顕微鏡下でより大きな付着性の白血球から区別するのは難しいことができ、適切な濃度の単層の内皮細胞を使用することが必須である。我々はヒト肝類洞内皮細胞に最適な播種密度を記載しているが、これは別の内皮人口や種間で異なる場合があります。 著しい進歩が生体顕微鏡を用いて動物モデルにおける白血球動員を研究してなされたものである。流量接着アッセイ法の主な利点は、白血球動員が、初代ヒト内皮細胞を用いて二成分系で研究することができることである。さらに、これらの相互作用は、ずり応力の生理学的に適切なレベルの下で研究することができる。 differencがあるかもしれないとして、それは人間のセルラーシステムとの動物で生体内の研究の調査結果を確認することは重要である種間の内皮性質のES。フローアッセイの制限の1つは、白血球の動員は、内皮単層の単細胞環境において検討されていることである。白血球が内皮を通過付着し転生したらまた彼らは孤立し、下流の処理が施されるのに十分な数で存在していなくてもよい。 流量接着アッセイが習得された後、これらの制限にもかかわらず、白血球接着カスケードのさらなる分析を実行するために開発され、多細胞環境を再現するように構成することができる。単一フィールドおよびトラッキングソフトウェアの使用の延長記録が白血球のクロールの動作を分析するために使用することができる。さらにフローアッセイの完了時にマイクロスライドをより詳細に接着および遊走を研究するためにレーザー走査共焦点顕微鏡法および免疫蛍光標識を用いて調べることができる。さらに、我々は以前に開発してきた流れる白血球が肝細胞の存在によって調整肝内皮と相互作用することができるin vitroモデルを編このアッセイはまた、白血球の亜集団を研究するために開発することができる：私達のグループは、調節性T細胞、B細胞、および肝臓浸潤白血球などのサブセットを使用して研究を行った。 これらの研究は、フロー接着アッセイは、人間システムにおける一般的および臓器特異白血球動員を研究する強力なツールであることの証拠である。

それが現在では一般的には白血球の募集は多段階の接着カスケード1のパラダイムに従っていることが確立されている。これは、血管壁を裏打ちする内皮細胞によって血液を流すの白血球の捕捉を伴う。最初に、白血球は、受容体または免疫グロブリンスーパ​​ーファミリーのメンバーセレクチンにより媒介される圧延工程を経る。これは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、内皮糖衣上に提示ケモカインによって活性化される白血球の表面上で発現を可能にする。これは白血球表面上の「高親和性」状態にインテグリン確認の変更につながり、逮捕し、内皮への強固な接着。強固な接着は、その後、容器に白血球の形状変化とクロールが続いている。最後のステップは、傍細胞または経細胞経路を介して発生する可能性が内皮単層を介して、輪廻です。 多段階の接着カスケードは説明しながら、S本体内の白血球募集の一般的な機構は、器官特異的な違いがあります。肝臓では白血球の動員の大多数は募集は一般的に後毛細血管細静脈2内で発生した他の臓器とは対照的に肝類洞内で発生します。肝類洞は低剪断環境であり、白血球は、セレクチン依存しない2で接着を会社に前に簡単なテザリング段階を経る。これらのチャネルは、不連続であるとfenestraの複数形が含まれ、肝正弦内皮によって並ぶ直径開孔100〜200 nmであり、基底膜3を欠いている。ヒト肝正弦内皮を通過する白血球動員を仲介する分子機構を解明することは、炎症性肝疾患のための臓器特異的な治療標的を同定できた。 フロー接着アッセイは、白血球動員を研究する上で欠かせないツールです。彼らは、白血球の再構築を可能にするrecru明確に定義された力の下での密着性を分析するためのせん断応力の存在下でitment。アッセイのための最も頻繁に使用すると、培養内皮単層または精製された基材への研修白血球接着です。市販のフローチャンバーは、2つの平坦面との間の層流の条件下で細胞を灌流し、次いで顕微鏡4上に接着の動的なプロセスを視覚化するために使用される。以前のグループは、特定の接着相互作用しか流れの下で行われることが実証されていると、静的アッセイ5,6において研究することができない。 我々は、肝の正弦波を再現し、低せん断応力の条件下での白血球動員を研究するためにこの手法を使用している。初代ヒトHSECマイクロスライドおよび白血球で培養し、肝臓の洞様の中にせん断応力を再現するために計算された流量で、この単層の上に灌流することができます。せん断応力は、OPP等の表面に対して平行または接線方向の印加される応力である垂直な垂直応力にosed。境界に沿って移動している任意の流体は、その境界にせん断応力を発揮します。せん断応力は、リンパ球遊出7の必須成分であることが示されている。これらの条件下で接着カスケードの各ステップは、位相差顕微鏡によって可視化することができる。この方法は、従来の接着分子の研究8、ケモカインおよびケモカイン受容体9から11の役割、およびそのような血管接着タンパク質-1（VAP-1などの非定型接着分子を含む肝臓内白血球のリクルートに重要な洞察を可能にした）8,12および共通リンパや血管内皮受容体-1（CLEVER-1）13。このアッセイは、当社グループの出版物のいくつかに言及してきたが、その説明は簡潔されており、我々は、トラブルシューティングに役立つ技術的なエラーを防ぐためのステップガイドでは、詳細な手順を提供するために、この機会を取ったときの試みアッセイをING。さらに、我々は最近、せん断応力で正確な変更を可能にするマイクロスライドチャンバの調達を変更しました。我々は、これが他の内皮および免疫細胞へのアッセイの適用可能性を広げると信じています。以下の方法は、ヒト肝臓類洞内皮細胞および末梢血リンパ球とフローベースの接着アッセイを実施するための調製および技術が記載されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

ヒト肝組織への白血球の浸潤は、すべての大人の炎症性肝疾患では一般的なプロセスです。慢性浸潤が肝硬変に線維症および進行の開発を推進することができます。肝臓に白血球動員を仲介する分子機構を理解することは、肝疾患のための重要な治療標的を同定できた。白血球の募集時の重要な相互作用は、せん断応力条件下で内皮と炎症性細胞のことである。肝臓への動員は、肝類洞内皮細胞（HSEC）によって裏打ちされている肝正弦波の低せん断チャンネル内で行われます。肝類洞内の条件は、特定の流量で人間HSEC単層が並んチャネルを通して白血球を灌流によってで要約することができます。これらの条件では、白血球は、内皮を横断クロールステップとその後の転生に続く活性化と強固な接着が続く短時間のテザリング段階を経る層。位相差顕微鏡を用いて、この「接着カスケード &#39;の各ステップは、可視化およびオフライン分析により追跡記録することができる。内皮細胞または白血球は、このプロセス中に特定の分子の役割を決定するために、阻害剤で前処理することができる。

このアッセイは、多段階の流れ接着カスケードを視覚化し、分子阻害剤を用いたものに対照実験の結果を比較することによって根本的な分子機構を解明する能力を有する。様々な血管床は、特定の内皮細胞を組み込み、せん断応力条件を変更することによってで要約することができます。 接着カスケードの各ステップは、プロトコルにおいて概説記録方法に従うことによりオフラインで分析することができる。接着カスケードの第一段階は、総接着細胞のパーセンテージとして表すことができる白血球のローリングである。オフライン解析は、接着細胞の数は、白血球ボーラス中に記録された各分野で列挙することができます。画像の再生がしっかりと付着性と内皮を通過するローリング運動を受けているものである細胞の比較を可能にする。ローリング運動は、この技術を用いて可視化することができ、各フィールドは、少なくとも10秒間記録されている。ローリング細胞は、細胞を流れると比べて内皮表面上のそれらの還元速度で識別されます。この動作は、剥離することなく、少なくとも5秒間立証されなければならない。肝類洞内の接着カスケードは、低剪断環境下で行われ、 インビボ研究だけ短いテザリングステップで最小の圧延を確認した。我々は、フローアッセイは、接着性白血球の10％未満が持続的にこれらのアッセイにおいて過剰HSECを刺激し、ロールすることを実証することにより、肝正弦波の環境を反映していることを確認した。 接着カスケードの次のステップは、強固な接着である。総付着を洗浄緩衝液のボーラス（工程7.3）の間に、記録の第二段階から計算することができる。オフライン分析は、しっかりと接着細胞の総数は、各フィールド（ 図5）で計数することができる。しっかりと接着細胞は、静止または低速クロールの動作とshapechangedある細胞として定義されています。視野当たりの細胞の平均数を計算することができる。この図は、その後の程度を表現するために、リンパ球（典型的には1×10 6細胞/ ml）の濃度および流量を（格子線または同等物を使用して決定）、視野の全表面積に関連して、使用することができる付着細胞/ mmのリンパ球の接着を灌流2月 10 日6細胞。 密着性のパターンを研究することは、形状変更、クロールおよび経内皮移動を含む接着カスケードの最後の2段階の分析を含む。 HSEC単層の上面に付着白血球は、位相の明るい単分子層を介して移動しているものながら、位相暗い（ 図6）が表示され表示されます。次に、細胞を、「静的」な接着（nonmigrated /ラウンド）を示すと分類「形状変更」形態または「移行」と、個々の区分は、その後のパーセンテージとして表すことができます総接着人口。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> 図1。フローチャンバー内で一次ヒト肝類洞内皮細胞の単層。 A）の前流接着アッセイの開始に内皮細胞の単層を含有する培地で満たした。コンフルエント内皮単層のB）位相コントラスト画像マイクロスライドは、内皮細胞は、マイクロスライドに播種されるべきで、これはであるべきであるヒト肝内皮細胞について（プレコートされているラット尾コラーゲンタイプ1）、それは内皮細胞が培養し、コンフルエントに健康であることが不可欠です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; 図2。検定チャンバを流れる。フローアッセイ室セットアップはここで分かるように、倒立顕微鏡に装着されている透明なチャンバからなる。ヒータは、チャンバ内に配置され、サーモスタットで37℃の温度を維持するように制御されるべきである外側に配置されているシリンジポンプに室内のマイクロスライドからシリコンチューブを接続するために利用可能なポートがあるはずです。マイクロスライドを顕微鏡ステージ上に直接配置されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> 図3。シリンジポンプ 。シリンジポンプが接続されフローチャンバにシリコンチューブを介して編。ポンプはアッセイに必要とされる所望のせん断応力に応じて特定の引き出し速度に設定されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> 図4。室を流れるようにバルブを接続する。A）電子ソレノイドバルブは、バルブがフラッシュされ、2つのバレルが設定されると、バルブから、事実上のデッドスペースを用いて細胞またはメディアのいずれかを含む2シリンジバレル。B）のシリコンチューブを切り替えることができますフローチャンバーに接続されている。これは、フローチャンバーのポートにシリコンチューブにアダプターを接続する際に液/液界面が存在することが重要です。 &lt;HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot;ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> 図5。洗浄緩衝液ボーラス工程（プロトコールで概説した）、10個のランダムフィールドの最小値が記録されるべき最後の2分中の総白血球付着の測定 。これらは、オフラインで分析することができ、しっかりと付着細胞の総数は、それぞれのフィールドで計数することができる。白血球の全体付着は、制御チャンバおよびブロッキング抗体で前処理し、それらの間で比較することができ、ここでは対照スライドおよび細胞内接着分子-1（ICAM-1）抗体をブロッキングで前処理したスライドからの代表的なフィールドを示す。矢印はrepresentaで、付着性の白血球を強調するために追加されました対照スライドからTIVEフィールド識別さ25白血球の中の選択肢の一つであり、ICAM-1ブロックスライドで識別された13の白血球の合計があります。スケールバー=100μmとは。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> 図6。記録されたフィールドの位相差顕微鏡による内皮単層上の白血球接着のパターンを分析する。オフライン分析はまた、白血球接着の方向および速度を研究するために使用することができる。接着カスケードの具体的なステップは、可視化し、位相コントラスト撮影を用いて定量することができる。相明るくしっかりと接着しているが、活性化されていない細胞のラウンド &#39;の接着と呼ぶことができる、活性化する細胞Dと位相明るい」形状を変更」と呼ぶことができると位相暗い細胞は内皮移動を経験したし、「移行」と呼ぶことができる細胞である。画像は、接着の各パターンの例を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K ビュー.  University of Birmingham. 肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。 

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

免疫・感染学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...