The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

好中球は、インフォームドコンセントに署名した人の健康なボランティアから単離した。研究が人類の福祉のための制度や国のガイドラインを遵守して行われている。 ヒト臍帯静脈内皮細胞の1めっきとメンテナンス<ol><li>製造業者の指示に従って培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）。フィブロネクチン上のHUVECを育てる（FN）がメディアを使用して（脱イオン水に溶解した10μg/ mlの）料理がコーティングされ（内皮増殖培地（EGM-2）singlequotsを加えた内皮基本培地（EBM-2）培地）。実験のために4-8の通路の間に細胞培養を使用してください。 </li><li> 1日目：37℃で少なくとも2時間、5％CO 2のためにフィブロネクチンを100μl（PBS中10μg/ ml）を有するコート、フローチャンバー。 </li><li> 2日目：細胞を、80〜90％コンフルエンスに達し、RTリン酸緩衝生理食塩水（で慎重に洗浄した後、細胞をトリプシン処理PBS）pH7.4のメディアを使用して、800,000細胞/ mlで800×gで遠心分離し、再懸濁。プレートFNでコーティングされたフローチャンバーのすべての単一のチャネル80,000細胞、ゆっくり上下細胞懸濁液をピペット。 37℃のインキュベーター中、5％CO 2で培養O / N。 </li><li> 3日目：優しく45°の角度でスライドを傾けてフローチャンバースライドでメディアを更新します。 （ 図1Aを参照）。 メモ：のみ貯水池ではなく、チャネル自体のメディアを削除することを推奨します。チャンネル内のメディアの除去が原因ペッティングによって引き起こされるメディアのドラッグ力に内皮細胞の損失と死に至ることがある。 </li><li>内皮細胞単層（ すなわち、100％コンフルエント）を形成した場合、位相差顕微鏡により確認してください。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは100％のコンフルエンスに達するまで、メディアを2回日を変更する。 </li><li>細胞がコンフルエントに達したら、培地で細胞を刺激する（ステップを参照1.1）炎症性メディエーター（TNF-α（10 ngの個/ ml）を含有する）。 、内皮の炎症性表現型をTNF-αの結果とHUVECをO / N（ すなわち、12時間）刺激すなわち 、アップレギュレーションなどのICAM-1およびVCAM-1の13のような細胞接着分子。 </li></ol>パーコール勾配を使用した2。多形核白血球の単離<ol><li>多形核白血球（PMN）を単離する前に：（フローバッファー以下と呼ばれる）、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N&#39;-2-エタンスルホン酸（HEPES）を調製-buffer。フローバッファを単離したPMN及びフローアッセイにおけるバッファとしての洗浄に使用される。フローバッファを準備するには：7.72グラムのNaCl（132 mM）を、4.76グラムのHEPES（20 mM）を、0.45グラムのKCl（6 mM）を、0.25グラムの硫酸マグネシウム•7H 2 O（1 mM）を、K 2 HPO 4•3Hを希釈脱イオン水1L中2 O（1.2ミリモル）と（この在庫が数週間、4℃で保持することができる）pH7.4に調整します。 </li><li>新鮮な100μlの1Mの塩化カルシウム＆＃を追加します。160;が​​200g / Lのストック濃度から（1 mM）を2.5 mlのヒトアルブミン（0.5％v / v）およびフロー緩衝液100ml（w / vの0.1％）、0.1グラムのグルコース。次に、0.45μmのフィルターを用いて、フローのバッファをフィルタリングします。注：このフローバッファは、すべての実験のために新たに調製する必要があります。 </li><li> PMNの単離の前に、10％のクエン酸三ナトリウム（TNC）PBS、pH7.4中の溶液を調製。 </li><li>健康なボランティアからのナトリウムヘパリンのvacuettes全血を20mlを収集します。パーコールの12.5ミリリットル（1.130グラム/ mlの密度で、水中の23％（w / w）のコロイド溶液）の上に慎重に、血液を希釈して50mlチューブとピペット20mlの10％PBS / TNCで1：全血の1に希釈新しい50mlチューブ中。慎重に遠心機でチューブを配置し、低加速し、RTで設定されていないブレークで800×gで20分間スピン。 注：パーコールに希釈した血液を追加する場合は、45度の角度でパーコール含有チューブを傾け、静かにチューブのウィットに希釈血液をピペットH最も遅いピペット男の子の設定。 </li><li>すべての液体を除去し、続いて500ミリリットルに氷冷した赤血球溶解バッファー（4.15グラムのNH 4 Clを[0.155 M]、0.5gのKHCO 3 [0.01 M]及び18.5ミリグラムEDTA（三重III）[0.1 mm]としたチューブを埋める赤血球を溶解するための氷冷H 2 O）である。サスペンションが有効になって休憩して、4℃で5分間の遠心分離500×gで、続いて暗赤色に変わるまで、時折転倒、氷上でチューブのままにしておきます。 注：ペレット画分を一​​緒に赤血球とのPMN（好中球、好酸球、好塩基球）が含まれています。 </li><li>上清を除去し、4℃で5分間500×gで氷冷溶解 - 緩衝液中で2回ペレットを洗浄。 </li><li> RTで流れバッファーでペレットを再懸濁し、血球計または自動細胞カウンターのいずれかを使用してPMNの濃度を決定する。 1×10 6細胞/ mlで、フローバッファ内のPMNをサスペンドし、室温で保管してください。 </li></ol>内皮ジャンクショ​​ンの3ラベリングアルは、VE-カドヘリンおよびPECAM-1 <ol><li> 1でPECAMアレクサフルオロ647抗体（クローンWM59）を追加します。1:50希釈HUVECに、培地で100倍希釈し、カルシウム非依存VE-カドヘリン-FITC抗体（クローン55-7H1）、（ステップ1.1参照）前生理的流れの条件下で好中球遊走の間に内皮細胞の接合動態を可視化するために、フロー実験を開始する30分間インキュベートする。 注：フローチャンバーに直接標識抗体を追加する前に、各チャネルのボリュームは100μLを超えていないことを確認してください。これは、可能な限り低い抗体費を維持するのに役立ちます。 </li></ol> 4 PMN TEMアッセイで流動<ol><li>前のフローシステムにそれらを注入する37℃で15分間水浴中にPMNを配置してください。 </li><li>目を設定する際の気泡の形成を防止する（ステップ4.3参照）、空のフローチャンバーにチューブを接続し、暖かいでいっぱいに（ 例えば、37℃）、フローバッファ電子フローシステム。 </li><li> 20ミリリットルの注射器を含むシリコーンチューブを使用して、シリンジポンプフローシステムに空のフローチャンバーの一方の側を接続し、顕微鏡のステージへの流れチャンバを置く。 </li><li> 37°Cフロー緩衝液（ 図1B）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバの反対側を接続し、フローバッファーですべてのチューブを充填するために、シリンジポンプを起動する。ポンプは、注射器に流動室を通ってリザーバから流れバッファを引っ張ってくる。注：このチューブはまた、PMNの流れを停止させ、気泡を作成せずに実行している実験に針を注入することを可能にする、インラインルアー注入ポートが含まれています。 </li><li>フローチャンバーを含むTNF-αで処理したHUVECを持つ空のフローチャンバーを交換し、フローバッファーを含むチューブを接続し、顕微鏡ステージ（ 図1C）に置きます。切断して再接続する前に、チューブを切っピンチピンチオフしないように、HUVECを含有するチャンバーmは、チューブおよび/またはフローチャンバ内の気泡の形成をもたらすことができる。 </li><li>ポスト毛細管細静脈において生理的流れ速度に応じて、1ダイン/ cm 2の流速を調整する（1-5ダイン/ cm 2）であった。 </li><li>レコード微分干渉コントラスト（DIC）、FITC（488nmの）およびアレクサフルオロ647（647 nm）を同時に共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて。 </li><li> 1ミリリットルの注射器を使用して、インラインルアー注入口（ 図1D） を介して 、フローシステム内にゆっくりのPMN（ステップ4.1）を注入する。 </li><li>数分後、白血球が付着現れ、転生。フローチャンバー内にフローチャンバー及びピペッティング固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）からチューブを外して、任意の瞬間に実験を停止します。 10分間の固定を可能にし、PBSで洗浄した。データは、（材料および機器の表を参照）画像ソフトウェアを用いて分析される。 NOTE：37°C、5％CO 2の恒温及び63X油を目的とした人工気象室を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて彼の実験を実行する。 </li></ol>

<ol>
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Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

このプロトコルについては、これは、細胞アポトーシスおよび破壊単層をもたらすので、フローチャンバー内の気泡の形成を防止することが重要である。これを避けるために、私たちは、チューブをフローチャンバーに接続されている手順4.2および4.5、特に関心を払うように強調したい。プロトコルにおけるもう一つの重要なステップは、前のフローチャンバー（ステップ4.1）にそれらを注入する、37℃で15〜30分間、それらをインキュベートすることにより、室温に保たれているPMNのプライミングである。これは、彼らがそのような内皮でのICAM-1またはVCAM-1などの接着分子に付着させ、白血球インテグリンのプライミングになる。 このプロトコルは、好中球の遊走を研​​究するために限定されるものではない。また、単球またはリンパ球のような他の白血球の型を使用することができる。そのステップ4.1に注意して、 すなわち、白血球をプライミングすると、白血球の型の間で異なる場合があります。また、内皮細胞の他のタイプを使用することができる。このためには、臨界のままで例えば、TNF-αまたはIL-1βのような適切な炎症性刺激による内皮細胞を刺激する。好中球遊出に応答しない場合、人はN-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-L-フェニルアラニン（fMLPの）ペプチド16での好中球の短時間（5分）の治療を検討してもよい。これは内皮に付着し、それらをより受けやすいこと、さらに、それらのインテグリン、特に、好中球を刺激する。 典型的には、1ダイン/ cm 2の流速が用いられる。この流速は、後毛細血管細静脈、大部分の白血球経内皮遊走17を発生する部位で測定される。説明したフローチャンバーを使用して、10ダイン/ cm 2の流速を高めることができる。しかし、さらに剪断力を高めるためにはお勧めしません。これは、フローチャンバーからの細胞のチューブと剥離の不要な漏れの原因となります。 図3に記載した結果は、これらのことを示している抗体を視覚化し、白血球血管外遊出の際に、内皮細胞間結合の動力学を研究するために使用することができる。具体的には、既存のトランスマイグレーションアッセイに加えて、このプロトコルは、リアルタイムでの生理的な流れの条件の下で経移行から傍細胞を識別することができます。抗体は細胞間結合を染色するので、人は/ PECAM-1のサイトカドヘリンVE非正対VE-カドヘリン/ PECAM-1陽性接合を横切る白血球数を獲得することができます。このように、細胞間移行が傍細胞遊走識別することができる。 これは、これらの抗体は、それらが結合するタンパク質の機能を妨害しないことを強調することが重要である：本研究で使用PECAM-1抗体は、第二の細胞外ドメインに対して向けられる。抗体は、少なくともなかったことを示唆して拡散または単分子層を形成する際の欠陥を示さなかった抗体の存在下で播種した内皮細胞は、内皮細胞間同型相互作用を妨害。それに加えて、両方の抗体は、内皮単層を通って移動する好中球の能力を損なわない。さらに、抗体の非存在下または存在下で内皮単層を横切って遊出する好中球の数は変化しない（データは示さず）。重要なことは、共焦点レーザー走査顕微鏡は私たちに、同時に異なる蛍光チャネルおよびDICを記録する可能性を与えます。 好中球は、内皮細胞間の接合部を横断し、白血球が経細胞に対する他の、 すなわち、傍細胞上の1つの経路を選択する理由を理解するのに役立ちますときこのように、このアッセイは、同時に、VE-カドヘリンおよびPECAM-1のダイナミクスを研究することができます。

効率的かつ厳密に制御された白血球経内皮遊走（TEM）は、免疫監視および急性炎症などの生理学的プロセスに極めて重要である。しかし、特定の病態生理学的条件の下で、制御されない過度のTEMは、慢性炎症性疾患（ 例えば、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、喘息）、その結果が観察される。また、腫瘍細胞の転移の間に、経内皮移動の過程は、腫瘍細胞が1-3転移する循環を残すための器械である。具体的には、過剰な白血球または腫瘍細胞TEMを妨害するために、このプロセスの調節の詳細な理解が必要とされる。 これは、TEMプロセスは、異なる工程を経て生じると考えられる。ブッチャーとスプリンガーによって20年前にレビュー精液の研究では、TEM 4,5の処理を説明する多段階モデルにつながった。このモデルは、まだいくつかの広告が、当てはまるditionalの手順は、6が含まれています。アロンらは、内皮7の表面上に固定化されたケモカインの存在の必要性を説明した。最近では、それらは内皮自体が内皮頂端面8に提示されたケモカインを生成することを示した。また、同じグループは、TEM 7時の流れの状態の重要性を提唱。最近、2つの異なるルート白血球に焦点を当てたいくつかの出版物は、TEMの最終漏出段階で取ることができます。彼らは、すなわち 、細胞-細胞間結合を通じて傍細胞移動ルートを行くか、経細胞移動ルート9として知られている内皮細胞体を介して交差することができます。カーマンらは詳細にこれらの経路を研究し、臍帯静脈内皮単層10を横断するときに白血球が優先的に経細胞経路（10％）以上の傍細胞移動ルート（90％）を選択することを結論した。しかし、他の起源からの内皮細胞を用いた場合、 例えば、脳または微小血管系、より白血球は経細胞経路（30％）の11を使用した。 Vestweberグループは、最近、内因性の交換、細胞-細胞間結合は、ノックイン動物モデルを使用して、互いから解離することができなかったときことを示したVE-カドヘリン、VE-カドヘリン、α-カテニンキメラのために、白血球のTEMは、完全に12を遮断した。驚くべきことに、著者は、TEMは、いくつかのすべてではなく、組織において、ブロックされたことに気づいた。全体的に、これらのエレガントな実験は、この決定をトリガー調節シグナルは依然として不明であるが、白血球は、経細胞経路での傍細胞経路を優先することを示した。 白血球の大部分が傍細胞移動ルートを好むにもかかわらず、それは両方の経路を区別することは困難である。それに加えて、いくつかの研究にもかかわらず、内皮細胞 - 細胞JUNCTの役割に焦点を当てイオンは、これらの接合部の力学は、特に接合部のタンパク質は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1、白血球の交差が論争中である時に。私たちは、これら接合分子は蛍光標識された抗体を用いて、生理的流れの条件下で、白血球の血管外遊出中にリアルタイムで監視することができる比較的簡単なアッセイを開発した。これらの抗体は、妨害または標的とするタンパク質の接合部の完全性や移動性を阻害しなかった。このアッセイは、私たちは、傍細胞TEMの過程接合部タンパク質の動態を追跡することができます。さらに、このアッセイはまた、パラ及び経細胞移動ルートとの間の識別を可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

炎症時には、白血球が循環を離れ、下にある組織に侵入する病原体と戦うために内皮を横切る。このプロセスは、白血球の経内皮遊走として知られている。内皮単層を横切る白血球のための2つのルートが記載されている： すなわち 、細胞-細胞間結合および経細胞経路を介して傍細胞経路、 すなわち、内皮細胞体を介し。しかし、パラ - 及び経細胞経路を区別することは技術的に困難であった。私たちは、生理的な流れの条件の下で好中球経内皮移動中およびPECAM-1-カドヘリン、VE内因性の分布を調べるための簡単なin vitroアッセイを開発しました。好中球灌流の前に、内皮細胞は、短時間VE-カドヘリンおよびPECAM-1に対する蛍光標識抗体で処理した。電気細胞substraによって決定したように、これらの抗体は、両方のタンパク質の機能を妨害しなかったTEインピーダンス検出およびFRAP測定。このアッセイを用いて、流動条件下で経内皮移動中およびPECAM-1 VEカドヘリンと内皮を通過する白血球のパラ - 及び経細胞遊走のルートを区別し、内因性の分布に従うことができました。

抗体は、内皮のバリア機能を妨害しなかった場合には、まず試験した。私たちは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング（ECIS）を使用して、内皮単層の抵抗を測定した。詳細については、ヴァンBuul らを参照してください。抗VE-カドヘリン蛍光標識抗体は細胞（ 図2A）に添加した場合の抵抗13全く変化が見られなかった。 VE-カドヘリン機能をブロックすることが十分に認識されている抗VE-カドヘリン抗体は、抵抗を劇的（ 図2A）を減少させた。また、のダイナミクスを変化させないイメージングのために使用される抗体は、VE-カドヘリンの光退色（FRAP）後の蛍光回復を測定することによって評価したように（ 図2B）カドヘリン-GFPをVE。 1-2分後、好中球はDICチャンネル（ 図3A）で可視化することができるように活性化内皮単層に付着した。 5-30 SEのクロール後、C、好中球の大半はPECAM-1に対する抗体で標識し、VE-カドヘリンをした細胞間結合を介して内皮単層を通って遊出。漏出の過程の分布は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1は、リアルタイム（ 図3B）に従った。好中球の血管外遊出の部位に、VE-カドヘリンが局所的に破壊し、PECAM-1以上のリング状の構造を示した。漏出が完了した後、閉じて、接合部は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1は明らかに漏出部位（ 図3C）に移転しました。好中球は、内皮のBASO-側面に到達したら、抗PECAM-1抗体の部分が好中球の表面上で検出されたことに注意してください。しかし、これは内皮を横切るから好中球を防ぐことはできませんでした。の観察されたダイナミクスは、好中球経内皮移動中にリアルタイムでカドヘリンをVEショウらが仕事と一致した共焦点顕微鏡を用いて、示し、VE-カドヘリン-GFP-トランスフェクトVE-カドヘリン-GFPは、白血球が内皮細胞間結合14を横切った際に横方向拡散内皮細胞を、。また蘇によって動作し、共同研究者は、PECAM-1の私たちの観察を強調した。彼らは次の横方向への白血球の通過時に拡散カドヘリンVEは、ことを示した、PECAM-1はローカルに転生好中球15の周りにリングに再配布されました。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> 体外フローチャンバーで 、図1（A）の矢印は、媒体を更新する必要がある、そこからリザーバを示している。 （B）チューブ（矢印）を切断することなくPMNのを注入するために用いたインラインルアー注入ポートとフローチャンバーを接続するシリコンチューブ。 （C）コーン37°Cフローバッファー（矢頭）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバーのと接続。 （D）フローバッファーを含むチューブに、TNF-αで処理したHUVECを有するフロー· ​​チャンバーの接続および顕微鏡ステージ（矢頭）に入れた。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> 図2は、VE-カドヘリン接合ダイナミクスまたは機能を妨害しない抗体。（A）内皮細胞単層のインピーダンスは、ECISを用いて測定される。 Y軸は、オームにインピーダンスを表し、x軸は、時間単位の時間を表す。インクルード抗体CL75（黒線）をブロックカドヘリン、VEのに対し、Alexa647の（青線）またはアイソタイプのIgG-Alexa647の制御で標識された抗体クローン55-7H1、（赤線）は、内皮細胞単層インピーダンスを変化させないカドヘリンは、VEのインピーダンスを減少させた。 （B </stro&gt;）、共焦点顕微鏡を用いてHUVECおよびFRAP分析において発現させたカドヘリン-GFPはVE ngのは、VE-カドヘリン55-7H1抗体の存在下または非存在下で蛍光回復の変化を示さなかった。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> 図3は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1の分布をリアルタイムで好中球のTEM中に（A）好中球が内皮に付着したとの分布に影響を与えることなく、細胞間の接合部を横切る（白線でマーク）VE-カドヘリンおよびPECAM -1。 （B）好中球は、細胞-細胞間結合を介して内皮単層を横切る。好中球は、細胞 - 細胞接合部を通って突出するとき、VE-カドヘリンおよびPECAM-1の局所分散を観察することができる。白線は内皮の上にまだ好中球の存在感を示している。黄色の線は、好中球膜THAを示していますtは内皮の下に既にある。 （C）好中球が完全に内皮単層を超えました。 VE-カドヘリンおよびPECAM-1は、漏出部位に再配置されます。黄色のラインが遊出し、好中球の境界を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

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Immunology and Infection

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Cell-Cell Interactions

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19.4K ビュー.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam. 白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。 

ビデオ: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

ロイコトリエンBのリアルタイムイメージング 4介在細胞の移行とβ-アレスチンとBLT1の相互作用

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

免疫・感染学

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

ノーマルCNSのリアルタイムPCRによると神経炎症時のミクログリアにおけるマイクロRNAの検出

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

分離、拡張、および CD31 cd34 陽性 + + ひと大網と皮下脂肪組織から血管内皮細胞の脂肪分化誘導

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...