Este estudo foi financiado em parte pelo Programa do Governo vitoriana do OIS, o National Health and Medical Research Council de bolsas da Austrália de programas e projetos (JPF Chin-Dusting) e bolsa de pós-graduação (D Michell).

1. Isolando artérias carótidas <ol><li> Euthanase10 semana de idade ratos Sprague Dawley através de CO 2 / O 2 asfixia. </li><li> Excise esquerda e direita artérias carótidas comuns com aorta e coração assegurar alongamento mínimo dos vasos. </li><li> No gelo tampão Krebs frio separado das artérias carótidas e da aorta do coração e realizar dissecção perto. </li><li> Manter os vasos isolados em Krebs no gelo antes da montagem. </li></ol> Aprox. tempo = 45 minutos 2. Escorva da câmara de navios <ol><li> Nos conectores proximal e distal da câmara de descarga de navios tampão Krebs mantida em pH fisiológico, infundindo carbogênio de gás (95% O 2, 5% CO 2) através do tampão a 37 ° C. </li><li> Garantir tubos e cânulas são liberadas completamente e estão alinhados. </li><li> Lave tampão Krebs através do P1 (proximal) e (distal) P2 transdutores. Torneiras a fim de garantir que nenhuma bolha de ar no transdutores. </li><li> Conecte os transdutores para os conectores correspondentes e, novamente, lave mais tampão Krebs garantindo que não haja bolhas de ar. Fechar as torneiras para a câmara. </li></ol> Aprox. tempo = 15 minutos 3. Pressurização da câmara de navios <ol><li> Ligue equipamentos sob pressão: servo de pressão, monitor de pressão, bomba peristáltica (Figura 1). </li><li> Com a bomba peristáltica sobre a pressão ea pressão sobre servo automática tampão Krebs executado através do tubo de 20 mmHg (dial em 1), garantindo que não haja bolhas de ar. </li><li> Conecte a tubulação para o transdutor P2 fechado. Pressão vai se tornar estável. </li><li> Abrir torneira P2 para a câmara de navio para expulsar as bolhas, em seguida, fechar. </li><li> Encha a banheira com Krebs buffer (5-7 mL). </li></ol> Aprox. tempo = 10 minutos 4. A montagem do navio <ol><li> Sob um microscópio de dissecação lugar laços de poliéster preto em cada cânula (Figura 2). </li><li> Mova cânulas e detentores cânula além e montar ¼ navio (aórtica final arco) para a cânula P1. Garantir para não rasgar o navio. </li><li> Usando uma seringa cheia de Krebs tampão suavemente lavar o excesso de sangue para fora da embarcação através de transdutor P1. Fechar P1 para a câmara. </li><li> Navio seguro para a cânula P1 com o empate de poliéster. </li><li> Mova cânulas / titulares cânula mais perto para montagem sobre a cânula P2. </li><li> Monte extremidade distal do vaso (~ ¼ do comprimento) para cânula distal. Seguro com empate de poliéster. </li></ol> Aprox. tempo = 20 minutos 5. Pressurizar o navio <ol><li> Ajustar os detentores cânula para garantir que não dobrar ou esticar no vaso. </li><li> Com P1 e P2 fechado para a câmara de mudar o servo pressão de automático para manual. Verificar a pressão servo não há uma diminuição contínua da pressão dentro de 10 segundos. Se houver, um vazamento está ocorrendo e as conexões e transdutores devem ser assegurados no lugar. </li><li> Ajustar o servo pressão de volta para P2 em seguida, abra automática para a câmara. Sob o microscópio observar o navio se dilatam quando a torneira é aberta para a câmara. </li><li> Mudar o servo pressão para manual. Novamente verificar se há diminuição contínua da pressão dentro de 10 segundos. Se houver um vazamento, então o sistema não é a pressão apertado e não é provável que seja um furo na embarcação. </li><li> Voltar para P1 aberto automática para a câmara. Na configuração manual verificar que a pressão se mantém estável. </li><li> Se nenhum vazamento, na definição de discagem manual aumentar para 2 (40 mmHg). </li><li> Ajuste automático para o navio e observar ao microscópio. Se necessário, ajuste o titular cânula para garantir que nenhum curva do vessel.Check de vazamentos sobre a configuração manual. </li><li> Repita os passos 5,6-5,7 aumentar o discagem para 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) e assim por diante até que a pressão desejada seja atingida. </li></ol> Aprox. tempo = 15 - 30 mins 6. Incubando a recipiente pressurizado <ol><li> Conecte o conjunto controlador de temperatura para 37 ° C. </li><li> Com uma segunda bomba peristáltica perfundir Krebs buffer (1 mL / min) para o banho de câmara de navio. </li><li> Conectar aspirador de câmara garantindo apenas a camada superior do banho é removido. </li><li> Incubar recipiente pressurizado a 37 ° C por 1 hora com a pressão definido como automático. </li><li> Verifique a pressão não está vazando (mudar para o manual) periodicamente. </li><li> Os efeitos de várias intervenções farmacológicas podem ser observados com a simples adição do composto para o banho durante a incubação. </li></ol> Aprox. time = 1 hora 7. Irrigando o recipiente pressurizado com sangue total <ol><li> Durante a incubação obter pelo menos 7,5 mL de sangue humano inteiro / navio coletados em 40 heparina U / mL de sangue. Incubar em uma falcon 50 ml a 37 ° C. </li><li> 10 minutos antes do final de tele sangue de incubação etiqueta com VybrantDil (1:1000) por 10 minutos a 37 ° C no escuro. </li><li> Após 10 minutos, coleta de sangue em uma seringa clearing as bolhas e anexar em uma bomba de seringa com um casaco de calor a 37 ° C. </li><li> Fechar transdutor P1 para a câmara / navio e conectar seringas e tubos de resíduos. </li><li> Sangue purgar a 1000 mL / min através do tubo de resíduos para remover todas as bolhas. </li><li> P1 aberto para a câmara. O servo de pressão ajusta automaticamente para manter a pressão desejada. </li><li> Perfundir de sangue a 100 mL / min. </li><li> Usando um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera digital gravar dois campos do navio perfundidos por 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 e 10 minutos. </li><li> Integridade pós-perfusão ea função endotelial pode ser avaliada através de técnicas farmacológicas, como myograph e expressão de moléculas de adesão pode ser determinado por imunohistoquímica para validar ainda mais a resposta inflamatória. </li></ol> Aprox. tempo = 15 minutos 8. Resultados representativos: Um diagrama esquemático da instalação de câmara de pressão é mostrado na Figura 1. Com uma câmera digital acoplada a um microscópio de fluorescência resultados podem ser visualizados instantaneamente por meio de gravações de vídeo ao vivo. Imagens de vídeo representativas são vistos na Figura 3, onde os leucócitos são considerados aderentes ao endotélio se manteve parado por 10 segundos. Com gravações de vídeo em loop contínuo células aderidas pode ser contado como um campo médio por. Embora ambos baixa (Figura 3A) e alta pressão (Figura 3B) fará com que uma certa quantidade de aderência um aumento significativo na adesão de leucócitos na maior pressão intraluminal é visto e isso também é demonstrada quantitativamente (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> Figura 1. Pressurizada vivo ex esquemática câmara navio. Um navio canulados conectado a um transdutor (P1) proximal e um distal (P2) que permite que os transdutores de pressão arterial a ser manipulado dentro do vaso. Perfusão é através do transdutor de pressão P1 e é mantida por meio de transdutor de P2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> Figura 2. Cannuala com laços. Laços de poliéster preto são anexados a cada cânula. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens de vídeo representativas. Adesão celular dinâmico (seta vermelha), sob a fluorescência a 80 mmHg (A) e 120 mmHg (B) após 10 minutos de perfusão. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> Figura 4. Adesão de leucócitos em ratos Sprague Dawley das artérias carótidas após 1 hora de incubação em baixa (80 mmHg) e de alta pressão (120 mmHg). *** P &lt;0,001, como analisado por 2-way ANOVA medidas repetidas com teste post hoc de Bonferroni.

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	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Medical Research e Alfred Delegacia Educação animais Comitê de Ética e da Comissão de Ética Alfred Hospital.

Este é um método modificado para estudar a adesão de leucócitos ao endotélio intacto em vasos sanguíneos isolados, em condições pressurizadas em tempo real. Perfusão da câmara de navio só permite uma validação rápida de pró-inflamatórias linhagens de camundongos e grandes vasos de ratos. Manipulação de pressão permitindo que permite interações célula dinâmica a ser observado a partir de baixo a muito altas pressões intraluminais, assim, melhor imitar-ing fisiológicos e condições fisiopatológicas. Diâmetro dos vasos também pode ser medida usando um programa de imagens de células-suficiente e, portanto, o fluxo de cisalhamento e velocidade pode ser determinada e, portanto, manipulados. Com as suas capacidades de myograph, intervenções farmacológicas colocado no banho acrescentar uma outra dimensão para as condições experimentais possível com esse modelo permite estudos de vias mecanicista e sinalização. Enquanto preservação endotelial não pode ser confirmado durante a manipulação de pressão, as respostas a ACh e PE podem ser conduzidas de perfusão pós 9. Deve-se notar que essa configuração demonstra os efeitos da pressão intraluminal em célula a célula não interações dos efeitos do fluxo sangüíneo pulsátil nem sistólica ou diastólica. Além disso, enquanto as alterações de pressão aguda sobre a adesão de leucócitos foram observados, esta configuração pode ser também utilizada para analisar os efeitos da pressão crônica (ou seja, aumentando os tempos de incubação e utilizando um modelo animal crônica de pressão). Sprague Dawley artérias carótidas comuns são demonstradas neste conjunto para cima, mas outras linhagens e espécies podem ser usadas com ajustes apropriados para o tamanho da cânula. De fato, é importante notar que a idade eo peso dos animais afetam o tamanho do navio e, portanto, que a criação precisa ser individualizado para cada navio. Dissecção próxima e cuidadosa do tecido conjuntivo pode melhorar a visualização de leucócitos imensamente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Microscópio </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> SteREO Descoberta V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD bomba de seringa 2000 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera Digital e controlador </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescência Sistema de Iluminação </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara navio </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de pressão Servo e bomba peristáltica </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de Pressão de perfusão </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Transdutor de Pressão </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Vivendo Instrumentação Sistemas </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil solução da célula-rotulagem </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Use 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Hipertensão, em todo o mundo é relatado para ser em aproximadamente um quarto da população e é o principal fator de risco para mortalidade no mundo biomédico. Na vasculatura hipertensão está associada com disfunção endotelial e aumento da inflamação levando à aterosclerose e várias doenças, tais como doença renal crônica 2, 3 derrame e insuficiência cardíaca 4. Um passo inicial na inflamação vascular levando a aterogênese é a cascata de adesão que envolve o rolamento, tethering, a adesão ea transmigração de leucócitos subseqüentes através do endotélio. Recrutamento e acúmulo de leucócitos ao endotélio é mediada por uma regulação alta de moléculas de adesão, como a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), molécula de adesão celular intracelular-1 (ICAM-1) e E-selectina, bem como aumentos nos citocinas e quimiocinas libertação e uma regulação alta de espécies reativas de oxigênio 5. Os métodos in vitro, tais como testes de aderência estática ajudar a determinar os mecanismos envolvidos na adesão célula a célula, bem como a análise de moléculas de adesão celular. Métodos utilizados nos anteriores estudos in vitro demonstraram que aumentos agudos de pressão sobre o endotélio pode levar a adesão de monócitos, um upregulation de moléculas de adesão e de marcadores inflamatórios 6 no entanto, semelhante a muitos ensaios in vitro, esses achados não foram realizados em tempo real sob condições de fluxo fisiológico, nem com sangue total. Portanto, em ensaios in vivo são cada vez mais utilizados em modelos animais para demonstrar inflamação vascular eo desenvolvimento de placa. Microscopia intravital é agora amplamente utilizados para avaliar a adesão de leucócitos, migração, rolamento e transmigração 7-9. Ao combinar os efeitos da pressão sobre os leucócitos para a adesão endotelial estudos in vivo são menos extensas. Um desses estudos examina os efeitos em tempo real do fluxo e cisalhamento sobre o crescimento arterial e marcadores inflamatórios remodelação, mas só foram avaliados através de imuno-histoquímica 10. Aqui apresentamos um modelo para a gravação de adesão leucocitária em tempo real no intacta vasos sanguíneos sob pressão de perfusão utilizando sangue total. A metodologia é uma modificação de um navio vivo ex-modelo de perfusão câmara 9, que permite a análise em tempo real das interações leucócito-endotélio adesivo em vasos intactos. Nossa modificação permite a manipulação da pressão intraluminal até 200 mmHg permitindo estudo não somente sob condições de fluxo fisiológico, mas também condições de pressão. Enquanto os sistemas Miografia pressão tenham sido previamente demonstrado para observar parede do vaso e do lúmen diâmetro 11, bem como a contração este vaso é a primeira vez demonstrando interações leucócito-endotélio em tempo real. Aqui nós demonstrar a técnica usando artérias carótidas de ratos colhidos e canulada a uma câmara de fluxo custom-made acoplado a um microscópio de fluorescência. A câmara de embarcação está equipada com uma lamela grande fundo permitindo uma lente objetiva de grande diâmetro, com distância de trabalho de curto para a imagem do navio. Além disso, agonista selecionados e / ou antagonistas podem ser utilizados para investigar os mecanismos que controlam a adesão celular. Vantagens deste método sobre microscopia intravital não incluem o envolvimento de cirurgia invasiva e, portanto, um maior rendimento pode ser obtido. Este método também permite o uso de tratamento inibidor localizada ao navio desejado enquanto intravital só permite o tratamento sistêmico inibidor.

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

Imagem adesão leucocitária ao endotélio vascular na pressão intraluminal de alta

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K visualizações.  Monash University. Este é um método para visualizar a adesão de leucócitos ao endotélio em vasos pressurizados colhidas. A técnica permite estudar de adesão vascular sob fluxo de cisalhamento com diferentes pressões intraluminal até 200 mmHg, assim, imitam-ing as condições fisiopatológicos da pressão arterial elevada.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...