מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS, הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי מענקים אוסטרליה תוכנית הפרויקט (JPF הסנטר טלק) וכן מלגה לתואר שני (ד מישל).

1. בידוד עורקי הראש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Euthanase10 בן שבוע ספראג Dawley חולדות דרך ה-CO 2 / O 2 מחנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והבלו עורקי התרדמה על ימין ועל שמאל משותפת עם אבי העורקים והלב הבטחת מתיחה מינימלי של הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב חיץ קרח קרבס קר להפריד את עורקי הראש של אבי העורקים והלב ולבצע דיסקציה קרוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על כלי מבודד קרבס על הקרח לפני הרכבה. </li></ol> כ. זמן = 45 דקות 2. תחול הקאמרית כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב המחברים הפרוקסימלית ומ דיסטלי של החיץ קאמרית כלי קרבס סומק שמרו ב-pH הפיזיולוגי על ידי יציקת גז carbogen (95% O 2, 5% CO 2) דרך למאגר ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא צינורות cannulas סמוקות לגמרי מיושרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש חיץ Kreb דרך P1 (פרוקסימלי) ו P2 (דיסטלי) מתמרים. הברזים סגור כדי להבטיח שאין בועות אוויר מתמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מתמרים למחברים המתאימים ושוב סומק יותר חיץ קרבס הבטחת אין בועות אוויר. סגור את הברזים לחדר. </li></ol> כ. זמן = 15 דקות 3. Pressurizing הקאמרית כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ציוד הלחץ: הלחץ סרוו, לפקח על לחץ, משאבת peristaltic (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם המשאבה peristaltic על הלחץ סרוו הלחץ על חיץ אוטומטי קרבס לרוץ דרך צינורות ב 20 מ&quot;מ כספית (חיוג ב 1), הבטחת אין בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינורות כדי מתמר P2 סגור. הלחץ יהיה יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח ברז P2 לתא כלי לשטוף את כל הבועות ואז לסגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את האמבט עם קרבס חיץ (5-7 מ&quot;ל). </li></ol> כ. זמן = 10 דקות 4. הרכבה כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום לנתח תחת מיקרוסקופ קשרים פוליאסטר שחור על גבי כל צינורית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר cannulas ובעלי צינורית בנפרד הר ¼ כלי (סוף קשת אבי העורקים) על גבי הצינורית P1. ודא שלא לקרוע את כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק מלא קרבס חיץ בעדינות סומק עודף דם מתוך כלי השיט באמצעות מתמר P1. סגור את P1 לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי מאובטחת על צינורית P1 עם העניבה פוליאסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר cannulas / מחזיקי הצינורית יותר להרכבה על צינורית P2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוף הר דיסטלי של כלי השיט (~ ¼ אורך) על הצינורית הדיסטלית. מאובטח עם עניבה פוליאסטר. </li></ol> כ. זמן = 20 דקות 5. Pressurizing כלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מחזיקי הצינורית כדי להבטיח שאין לכופף או למתוח את הספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם P1 ו-P2 סגור לחדר להחליף את שרת הלחץ אוטומטית ידנית. בדוק את הלחץ על סרוו אין ירידה מתמדת בלחץ תוך 10 שניות. אם יש, דליפת מתרחש ואת הקשרים מתמרים צריך להיות מאובטח במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את סרוו הלחץ חזרה P2 לפתוח אז אוטומטית לתא. תחת המיקרוסקופ לצפות כלי להתרחב כאשר הברז נפתח לחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את סרוו לחץ ידני. שוב לבדוק ירידה מתמדת בלחץ תוך 10 שניות. אם יש נזילה אז המערכת לא לחץ חזק שם צפוי להיות חור הכלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בחזרה ל P1 לפתוח אוטומטית לתא. על הגדרה ידנית לבדוק שהלחץ נשאר יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין דליפה, על הגדרת חיוג ידני להגדיל ל 2 (40 מ&quot;מ כספית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אוטומטית ולבחון את כלי מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, להתאים את בעל צינורית כדי להבטיח שום עיקול vessel.Check על הדלפות על הגדרה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.6-5.7 הגדלת חיוג ל 3 (60 מ&quot;מ כספית), 4 (80 מ&quot;מ כספית) וכך הלאה, עד הלחץ הרצוי הוא הגיע. </li></ol> כ. זמן = 15-30 דקות 6. דוגרים כלי בלחץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בקר הטמפרטורה מוגדר 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שני peristaltic משאבת perfuse קרבס חיץ (1 mL / min) לאמבטיה קאמרית כלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר aspirator לתא להבטיח רק את השכבה העליונה של האמבט מוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי בלחץ על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם הלחץ מוגדר אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הלחץ לא דולף (מעבר ידני) מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות שונות ניתן לראות פשוט על ידי הוספת תרכובת לאמבטיה במהלך הדגירה. </li></ol> כ. זמן = 1 שעה 7. המרוססת כלי בלחץ דם שלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה להשיג לפחות 7.5 מ&quot;ל דם כל אדם / כלי שנאספו הפרין U 40 / מ&quot;ל ​​דם. דגירה של 50 מ&quot;ל בז ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 דקות לפני תום tהוא תווית הדגירה דם עם VybrantDil (1:1000) במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, לאסוף דם מזרק ניקוי כל הבועות ולצרף על משאבת מזרק עם ז&#39;קט חום נקבע על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את מתמר P1 לחדר / כלי ולהתחבר מזרק צינורות פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר דם μL 1000 / min דרך צינורות הפסולת כדי להסיר כל הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח P1 לחדר. סרוו לחץ תתאים באופן אוטומטי כדי לשמור על הלחץ הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse דם μL 100 / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצמידים להקליט מצלמה דיגיטלית שני שדות של כלי perfused למשך 15 שניות ב 1, 3, 5, 7.5 ו - 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף הודעה תקינות תפקוד האנדותל ניתן להעריך באמצעות שיטות פרמקולוגיים כגון myograph ו מולקולה ביטוי הדבקה ניתן לקבוע באמצעות אימונוהיסטוכימיה להמשיך לאמת את התגובה הדלקתית. </li></ol> כ. זמן = 15 דקות 8. נציג תוצאות: תרשים סכמטי של תא הלחץ ההתקנה מוצג באיור 1. עם מצלמה דיגיטלית מצמידים את תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן דמיינו מיידי באמצעות הקלטות וידאו חי. נציג תמונות וידאו נראים באיור 3 שבו leukocytes נחשבים חסיד אל האנדותל אם יישארו נייחים במשך 10 שניות. עם הקלטות וידאו על תאים לולאה רציפה דבק ניתן לספור כשדה הממוצעת. אמנם הן נמוכות (איור 3A) גבוה (איור 3 ב) הלחץ יגרום מידה מסוימת של הידבקות עלייה משמעותית הידבקות ליקוציט בלחץ גבוה intraluminal נתפסת וזה הוכיח גם כמותית (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> באיור 1. Pressurised כלי לשעבר vivo סכמטית קאמרית. כלי cannulated מחובר מתמר (P1) הפרוקסימלית ו דיסטלי (P2) מתמרים המאפשרת את לחץ הדם כדי לטפל בתוך הכלי. זלוף היא באמצעות מתמר P1 והלחץ נשמר באמצעות מתמר P2. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> איור 2. Cannuala עם קשרים. הקשרים פוליאסטר שחור מחוברים צינורית כל אחד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> איור 3. תמונות וידאו נציג. הידבקות התא דינמי (חץ אדום) תחת הקרינה ב 80 מ&quot;מ כספית (א) ו - 120 מ&quot;מ כספית (ב) לאחר 10 דקות של טפטוף. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> איור 4. הדבקה ליקוציט ב ספראג Dawley הראש העורקים לאחר דגירה 1 שעה בשפל (80 מ&quot;מ כספית) ו בלחץ גבוה (120 מ&quot;מ כספית). *** P &lt;0.001, נותחו על ידי 2-way ANOVA אמצעים חזר באמצעות מבחן Bonferroni פוסט הוק.

<ol>
	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ההסתדרות הרפואית אלפרד מחקר וחינוך בעלי התחנה ועדת האתיקה ובית החולים אלפרד ועדת האתיקה.

זוהי שיטה שונה ללמוד הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי הדם ללא פגע מבודד בתנאים בלחץ בזמן אמת. זלוף של החדר כלי לבד מאפשר אימות מהירה של הפרו דלקתי זנים של עכברים גדולים וכלי חולדה. מניפולציה הפעלת הלחץ מאפשר אינטראקציות תא דינמי לצפות נמוך מ ללחצים intraluminal גבוהה מאוד, ולכן עדיף לחקות-ing פיזיולוגיים תנאי pathophysiological. קוטר כלי ניתן למדוד באמצעות תוכנית מספיק תאים הדמיה תזרים גזירה ולכן וקצב ניתן לקבוע מניפולציות לכן. עם יכולות myograph שלה, התערבות פרמקולוגית להציב באמבטיה להוסיף מימד נוסף של תנאי הניסוי אפשרי עם המודל הזה מאפשר מחקרים של מסלולים מכניסטית איתות. בעוד שימור האנדותל לא ניתן לאשר במהלך מניפולציה לחץ, התגובות ACH ו-PE יכול להתנהל זלוף הודעה 9. יצויין כי התקנה זו ממחישה את ההשפעות של הלחץ intraluminal על התא אל התא אינטראקציות לא את ההשפעות של זרימת הדם הסיסטולי pulsatile ולא לחצים או הדיאסטולי. יתר על כן, בעוד שינויים בלחץ חריפה על הידבקות ליקוציט נצפו, ההתקנה זה יכול להיות מנוצל גם להסתכל על ההשפעות לחץ כרוני (כלומר הגדלת פעמים הדגירה באמצעות מודל כרוני בבעלי חיים בלחץ). ספראג העורקים Dawley הראש הנפוצים הם הפגינו להגדיר זאת אך זנים ומינים אחרים ניתן להשתמש עם התאמות מתאימות לגודל צינורית. ואכן, חשוב לציין כי גיל ומשקל של החיות להשפיע על גודל הספינה ובכך להגדיר את זה למעלה צריך להיות אינדיבידואלי עבור כל ספינה. דיסקציה סגור וזהיר של הרקמה החיבורית יכול לשפר להדמיה של לויקוציטים מאוד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מיקרוסקופ </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> סטריאו דיסקברי V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 מזרק משאבה </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית ואת הבקר </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת תאורה פלואורסצנטי </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> כלי הקאמרית </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> סרוו לחץ בקר ומשאבה peristaltic </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> נ.ב. - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Pressure Monitor זלוף </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x מתמר לחץ </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> בקר טמפרטורה </td><td> חיים מכשור מערכות </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltic משאבה </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil התא תיוג פתרון </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> השתמש 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

יתר לחץ דם ברחבי העולם, היא דיווחה כי ברבעון כ האוכלוסייה הוא הגורם המוביל ביו הסיכון עבור תמותה ברחבי העולם. ב יתר לחץ דם בכלי הדם קשורה בתפקוד האנדותל דלקת מוגברת המובילה טרשת עורקים מדינות מחלה שונים, כגון מחלת כליות כרונית 2, 3 שבץ ואי ספיקת לב 4. הצעד הראשוני דלקת בכלי הדם המובילים atherogenesis הוא מפל הידבקות שכרוך מתגלגל, קשירה, הדבקות ואת גלגול מאוחר של לויקוציטים דרך האנדותל. גיוס הצטברות של לויקוציטים כדי האנדותל הוא מתווך על ידי הגברת הביטוי של מולקולות הדבקה כגון הידבקות התא וסקולרית מולקולה-1 (VCAM-1), הדבקה תא תאיים מולקולה-1 (ICAM-1) ו-E-selectin וכן עליות ציטוקינים ו chemokine לשחרר upregulation של מינים החמצן מגיב 5. In vitro שיטות כגון מבחני הידבקות סטטי לעזור לקבוע מנגנונים מעורבים התא אל התא הדבקה כמו גם ניתוח של מולקולות הידבקות התא. שיטות המועסקים הקודם במבחנה הראו עליות חדות הלחץ על האנדותל יכול להוביל הידבקות מונוציטים, upregulation של מולקולות הדבקה ו סמנים דלקתיים 6 עם זאת, דומה הרבה מבחני חוץ גופית, ממצאים אלה לא בוצעו בזמן אמת בתנאים זרימה פיזיולוגיות, וגם עם דם כולו. לכן, מבחני vivo מנוצלים ויותר במודלים של בעלי חיים כדי להדגים דלקת בכלי הדם והתפתחות פלאק. מיקרוסקופיה Intravital כיום בשימוש נרחב על מנת להעריך הידבקות לויקוציטים, הגירה מתגלגל, גלגול 7-9. כאשר המשלב את ההשפעות של הלחץ על ליקוציט הידבקות אנדותל במחקרים vivo הן נרחבות. מחקר אחד כזה בוחן את ההשפעות בזמן אמת של זרימה גזירה על צמיחת עורקים סמנים דלקתיים שיפוץ אך הוערכו רק באמצעות אימונוהיסטוכימיה 10. כאן אנו מציגים מודל הקלטה הידבקות ליקוציט בזמן אמת ללא פגע כלי דם בלחץ הדם באמצעות זלוף כולו. המתודולוגיה היא שינוי של מודל קאמרית לשעבר vivo זלוף 9 כלי המאפשר ניתוח בזמן אמת של לויקוציטים-אנדותל האינטראקציות דבק בכלי ללא פגע. שינוי שלנו מאפשר מניפולציה של הלחץ intraluminal עד 200 מ&quot;מ כספית ומאפשר ללמוד לא רק בתנאים זרימה פיזיולוגיות אלא גם בתנאי לחץ. בעוד myography מערכות הלחץ הוכחו בעבר לצפות קיר לומן כלי בקוטר 11 כמו גם התכווצות כלי זה הוא הפעם הראשונה הוכחת ליקוציט-אנדותל האינטראקציות בזמן אמת. כאן אנו להדגים את הטכניקה באמצעות עורקי הראש שנקטפו מן חולדות cannulated לתא מחוייט זרימה מצמידים את מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החדר כלי מצויד coverglass תחתית גדול המאפשר עדשה בקוטר גדול אובייקטיבי עם מרחק עבודה קצר לתמונה כלי. יתר על כן, אגוניסט נבחרים ו / או היריבים יכול להיות מנוצל כדי להמשיך לחקור את מנגנוני השליטה הידבקות התא. היתרונות של שיטה זו על פני מיקרוסקופיה intravital כוללים שום מעורבות של ניתוח פולשני ולכן התפוקה גבוהה יותר ניתן להשיג. שיטה זו גם מאפשרת את השימוש של טיפול מעכב מקומי לכלי הרצוי ואילו intravital רק מאפשר טיפול מעכב מערכתי.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure at JoVE.com

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

זוהי שיטה לדמיין הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי בלחץ שנקטפו. הטכניקה מאפשרת ללמוד הידבקות כלי דם תחת זרם גזירה עם לחצים שונים intraluminal עד 200 מ&quot;מ כספית ובכך לחקות-ing התנאים pathophysiological של לחץ דם גבוה.

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Views.  Monash University. זוהי שיטה לדמיין הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי בלחץ שנקטפו. הטכניקה מאפשרת ללמוד הידבקות כלי דם תחת זרם גזירה עם לחצים שונים intraluminal עד 200 מ"מ כספית ובכך לחקות-ing התנאים pathophysiological של לחץ דם גבוה.

Video: Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...