著者らはこの研究で使用した酵母株へのアクセスを提供するためのブランドンJ.ジップとKen B.カプランに感謝したい。著者はまた、ビデオ撮影の支援についてはフリオレーニンドミンゲス - ラミレスに感謝する。 JEEは、助成金番号5RC1GM91755からNIHの資金支援を認めている。

1。製造と組立<ol><li> 。。図1cに示すように、22.96センチメートル（9&quot;）パイ、パン、パンの側面から約2cm、黒のマーカーペン、アルミのヒートシンクのマークの穴（注）を使用して、内部のアルミ製ヒートシンクを置きます：場合、アルミブロックは、（少なくともローカルの金属スクラップの店またはオンラインで購入<a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ）事前にあけられた穴に付属していない、あなたは穴がドリルとアルミを確保するためにステップ1にする前に皿持って手配する必要があります。パイ皿にブロックする。我々は、窒素ガスの気泡がアルミの下から脱出を可能にするために、プラットフォームと4余分な穴にブロックを確保するために5穴を使用する。 </li><li>アルミのヒートシンクの位置に近い低温グリッドボックスを配置し、ノッチと各側面をマーク。 </li><li>アルミ製ヒートシンクの穴のための＃17のドリルビットと低温グリッドボックスの穴のための＃35ドリルビットを使用してマークされた位置のためのパイロット穴を開けます。 </li><li> 5を使用してアルミのヒートシンクをマウント - ＃10、1.9センチメートル（3 / 4&quot;）平頭溝付きボルトと対応するナットと同様に15 - ＃10ワッシャ場所2つのアルミニウムのブロックの下にワッシャーとの裏面上のサード。各ホールのためのパイのパン注：表示領域の近くにアルミブロックの無担保オーバーハングは、ステージのイメージング機能を制限する振動が発生する可能性がすべての取り付けボルトがしっかり締まっているかを確認してください。。 </li><li>挿入3 - ＃4、0.95センチメートル（3 / 8&quot;）低温グリッドボックスマウントとして機能するようにパイのパンの裏側からマイナスボルトと対応するナットを丸めます。 </li><li>別の頂上one箸とペアで一緒にテープ4箸。スペーサーとして機能するようにケーキ型の反対側の端にテープをそれぞれのペア。 </li><li>ケーキやパイのウェットトップとボトム面はのddH 2 Oでそれぞれパン</li><li>スプレー断熱材の2層のケーキパンを埋める。次のステップに進む前に各レイヤーを濡らす。 </li><li>泡にパイ皿を押してください。 </li><li>スペーサーは、パイのパンをご連絡するまで、上下逆さまにフライパンをひっくり返してケーキ型に押してください。ケーキのパンの上の任意の加​​重オブジェクトを配置し、治すために一晩放置します。 </li><li>鋸歯状のナイフで、過剰にフライパンの端から絶縁スプレーフォームを乾燥し、箸を削除切り取る。 </li><li>パイのパンからケーキのパンを取り外します。アルミヒートシンク付き円グラフのパンは現在、絶縁され、&quot;極低温ステージ&quot;（図1a）と呼ぶことにする。 </li><li>極低温ステージの上に透明なプラスチック製のクリップボード（任意の色と厚さ3 mm以上）を配置します。黒のマーカーで約1.5倍の単回低温グリッドボックスの直径の円を描画することにより低温グリッドボックスのマウントの位置とマーク。 1.9センチメートル（3 / 4&quot;）で穴を切り取って穴を見た。このクリップボードは、と呼ばれる&quot;ローディング画面&quot;（図1b）を。 </li><li>極低温ステージと直接対物レンズの下に、ヒートシンク付き顕微鏡での場所の上に新しい透明なクリップボードを置く。彼らは回転と黒のマーカーで、目的のパスをマーク。 </li><li>クリップボードの縁から半円を取り除く印を付けた行に沿ってカット。これは、ジグソーパズルやビデオに示すように穴が複数回見た7.62センチメートル（3&quot;）を用いて行うことができます。 </li><li>最後に皿の領域内ではまだ離れて半円形から1.9センチメートル（3 / 4&quot;）穴を開けるが、これはレベルが低下しばらくイメージング場合、液体窒素（LN 2）を補充するためのポートとなる。これはクリップボードが参照されます。 &quot;表示画面&quot;（図1C）などへ。 </li></ol> 2。サンプル準備<ol><li>水で1 × 10 6細胞/ mLの適当な濃度に合成完全（SC）メディアに成長相の酵母細胞をログに記録希釈する。 </li><li>希薄化後の酵母の2mLをR2 / 1 400メッシュ穴あきカーボン被覆銅低温電子顕微鏡のグリッド（SPI用品、ウエストチェスター、ペンシルバニア州）にピペットで、15秒間吸着されている。 </li><li> 2秒間のソフトセルロースの組織の引き裂かれた部分（キムワイプ）にグリッドの背面に触れることにより、グリッドの表面から余分な液体をブロット。 </li><li>必要であれば、グリッドは後方からブロッティングにより水の3μL滴（1〜3回）で洗浄し、そして邪悪な離れて、ステップ3とすることができます。 </li><li>最後の洗浄の前に、サンプルは、空気圧のプランジ冷凍庫にロードされ、吊りグリッドは、ステップ2.4​​のように洗浄される。表面からの水の大部分を除去するために引き裂かれたティッシュペーパー（キムワイプ）でグリッドをブロッティング後、グリッドはLN 2に陥っている液体のエタンを冷却し、ストレージ1の低温グリッドボックスに転送注：。行うことが重要です。サンプルは、水分を保つために表面に可能な限り薄く液体の層を残す。不適切なブロット法のいずれかのサンプルを乾燥させたり、電子ビームに対して不透明な氷のままにします。 </li></ol> 3。クライオ光顕微鏡<ol><li>と極低温ステージを埋めるLN 2と素早くローディング画面（単1.9センチメートル（3 / 4&quot;）穴とプラスチッククリップボード）でカバー。 </li><li>一度金属はLN 2温度に達すると、一部A5で説明されている3本のネジで作成したマウント1.9センチメートル（3 / 4&quot;）ローディング画面の穴に通して転送に低温グリッドボックスを転送する。ゆるめ低温グリッドボックスそのホルダーから改善されたアクセスのためのホルダーを取り外す。ステップ3.10まで別々のデュワーに液体窒素で低温グリッドボックスホルダーを保管してください。低温グリッドボックスは、サンプルのグリッドの温暖化を防ぐために、LN 2の下に保つ必要があります。 </li><li> 。にちょうどアルミのヒートシンクの上、以下の極低温ステージの詰め替えLN 2 注：LN 2レベルが定期的にチェックし、LN 2は 、ヒートシンクとの接触で連続的であることを保証するために、イメージングプロセス中に補充する必要があります。一般的には、補充は表示画面で充填ポート経由で10分ごとに発生します。 </li><li> LN 2のプレクールピンセットの先端、その後1.9センチメートル（3 / 4&quot;）ロード画面の穴を使用して、ピンセットでアルミのヒートシンクの平坦な視野の表面に、グリッド（s）を転送する。 </li><li>慎重に反射光顕微鏡の目的開口部の下にクライオステージを移動する。 </li><li>ローディング画面の上に透明の視聴画面を置きます。その後、徐々に表示する画面の下にスライドさせてロード画面を削除する注意：この時点で、サンプルは、最も脆弱である。顕微鏡の周りのすべての空気の流れを含めて、最小化する必要があります：呼吸、近くのドアの開口部、過去を歩く人々、等我々はフェイスマスクを着用したり、予防措置として、顕微鏡の接眼レンズ下に透明フェイスシールドをぶら下げ示唆している。 </li><li>クライオステージと平板ヒートシンクの表示エリア上のサンプルのスキャンの冷窒素ガスの環境への対物レンズを回転させる。標準の明視野光学顕微鏡技術を使用すると、センターを検索し、全体像を撮るために、低倍率の対物でグリッドに焦点を当てる。この実験に用いた光学顕微鏡レンズに関する仕様の実験材料に記載されている注：LN 2は、対物レンズに接触していないと我々は画像や冷却の影響からレンズへのダメージの劣化を未だ見たことがありません。 </li><li>関心のある領域に高倍率で焦点と明視野、暗視野、偏光または蛍光イメージングを使用してデータを取得する。将来の相関のための低倍率明視野画像上の関心領域の位置を記録してください。 LN 2を補充するため上記のすべての処置がとられている場合は、蒸発窒素から正圧は、イメージングの期間中、汚染のない環境を（部屋の湿度に依存しない）を維持するのに十分です。 </li><li>完了したら、表示画面の上部の上にスライドさせて、ロード画面を交換してください。ロード画面の下にスライド遅くすることで表示画面を削除します。 </li><li>顕微鏡からクライオステージを削除し、予冷ピンセットで、低温グリッドボックスに戻ってグリッドを転送する。環境に対するシールとストレージおよび将来のイメージングのための液体窒素デュワーにホルダーを転送するために低温グリッドボックスに低温グリッドボックスホルダーをねじ込みます。 </li></ol> 4。クライオ電子顕微鏡<ol><li>常に液体窒素の温度で試料を保持しながら、標準と確立された技術に続いて、クライオEMの転送ホルダーにサンプルのグリッドをロードします。 </li><li>透過型電子顕微鏡にサンプルグリッドでクライオホルダーを挿入します。 </li><li>適切な低倍率のビュー（50 - 500倍公称倍率）で、サンプルのグリッドの中心を見つける。 </li><li>グリッドの中央の銅のタブの相対的な向きを（図2で説明したように）を決定し、相関のための関心の正確な領域を特定するために、ステップ3.7から以前に収集された、低倍率クライオ- LMのデータを使用してください。 </li><li>顕微鏡のアライメント、低用量低温電子顕微鏡イメージングとデータ収集を続行します。 </li></ol> 5。代表的な結果極低温ステージ（図1a）は、低温蛍光顕微鏡と相関cryo-LM/cryo-EM解析のためのクライオ- LMのデータを収集するための効果的な方法です。図2は、低と高倍率クライオ- LMの画像の組み合わせは、あなたがクライオEMの特定の領域への直接参照マップを作成できるようにする方法を示しています。結果として得られるクライオ- LMリファレンスマップ（図2b）は、図3に示すように正確な領域を見つけるために低温電子顕微鏡データの取得中に利用されました。 <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 極低温ステージが 。）極低温ステージのレイアウトは、低温グリッドボックス転送マウントで構成されていますwを示さi番目の白い矢印とアルミ製ヒートシンク。グリッドは、低温グリッドボックスからLN 2の下で転送され、黒の矢印で示すように、ヒートシンクの表示領域上に直接配置。b）画像は、画面のロードに極低温ステージを描いたされています。ローディング画面の穴は、サンプルを転送するポートとして、ピンセット等でヒートシンク上の領域を表示するサンプルに低温グリッドボックスからサ ​​ンプルを移動するための低温グリッドボックスマウントと行為の上に直接配置されます。C）極低温場所の表示画面と対物レンズの下の位置でのステージ。視聴画面上に特殊なカットアウトは、対物レンズが簡単に極低温ステージを移動することなく所定の位置に揺動することができます。離れてサンプルエリアから表示画面の穴は、必要に応じて、LN 2つのレベルを補充するためにポートを埋めるLN 2として動作します。 <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 相関研究のためのクライオ- LMに移動。サンプリンググリッドに付着した酵母細胞の）低倍率クライオ- LMビュー。関心のある領域の高倍率蛍光画像を重ねb）同じ画像の（）と満たされたオレンジ色の多角形でサンプルのグリッドの中心をマーキング。センターは4つの正方形、余分な金属製のタブや前後のオープンを持つ3人のグループで構成されています。余分な金属製のタブを持つ3つの正方形の場合は、2対の不斉中心を形成し、長いと短い軸についてのタブを共有する。この不斉中心は、左上隅に見ることができるとクライオ- LMと低温電子顕微鏡との間のグリッドの回転角度と利き手を示すために使用されていました。いずれかから関心の低倍率の画像多くの分野は、低温電子顕微鏡で同一の領域を特定するために、参照マップとしてマークされ、使用することができます。（B）における関心の領域のc）の拡大蛍光クライオ- LMイメージ。 HTA1 - CFP、C末端CFPヒストンマーカーは、核の位置をラベル緑斑点状の構造として見ることができます。（C）に対応したエリアのd）の低温電子顕微鏡の画像。 スケールバーは50ミクロンを表す。 <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="図3" /> クライオ- LMと低温電子顕微鏡の 図3。 相関。クライオ明視野（、D）と相関同一の酵母細胞を示す図の2つのフィールド、低温蛍光（B、E）、および低温電子顕微鏡（C、F ）。 スケールバーは5ミクロンを表す。

<ol>
	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

著者らは競合する経済的利益を宣言していません。

<p class="jove_content"&gt;私たちの極低温ステージ及び試料調製技術、クライオ- LMと低温電子顕微鏡との間の相関の研究を使用することを含め、これに限定されないが近づくと、従来の室温以上のいくつかの利点を示す：迅速な固定を<sup&gt; 1,2</sup&gt;、退色に低減<sup&gt; 3</sup&gt;、および低温電子顕微鏡の前にサンプルの完全性のスキャン<sup&gt; 4,5</sup&gt;または化学的固定/埋め込み<sup&gt; 6</sup&gt;。クライオEMのデータ収集のためのボトルネックの1つは、TEMにサンプルを転送し、画像に適した領域を見つけるためにグリッドをスキャンの両方に必要な時間です​​。クライオ- LMの迅速なデータ収集と<sup&gt; 5</sup&gt;、時間は大幅に削減することができる良好なセルを見つける過ごした。従って、我々は時間と費用を節約し、事前にスキャンして、クライオ- LMへの関心の領域をマッピングすることにより、このボトルネックを緩和することができます。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;その他の高価または複雑な極低温の段階では、高分解能クライオ- LMのイメージングを可能にすることができる。しかし、ここで製造された段階では、多くのアプリケーションで十分です。テキストとビデオで説明されているようにクライオ- LMのイメージングとサンプルグリッドの転送が慎重に行われている場合、完全に汚染無料イメージングを達成することができる。このメソッドは、同じ細胞、細胞小器官や高分子複合体の蛍光と電子顕微鏡データの直接的な相関関係は、カーボン担体上に分散または薄い組織切片に含まれることが可能<sup&gt; 7</sup&gt;。それは、この極低温ステージの値が全体として光学顕微鏡の分野にcryo-LM/cryo-EM相関の研究を超えることに留意すべきである。この極低温ステージがよく繊細な試料と蛍光団の染料/汚れの両方に適しています<sup&gt; 8</sup&gt;、量子ドット、または蛍光タグタンパク質<sup&gt; 9</sup&gt;それは、グルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドで室温の化学的固定と包埋時に不安定になることがあります。その結果、我々は、この極低温ステージは、以前にコストと不十分なアクセスによって抑止されているクライオ- LM、興味のある人へのより大きなアクセスを提供することを願っています。</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt;トラブルシューティングクライオ光学顕微鏡</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1。サンプル吸着：</em&gt;異なるサンプルでは、​​カーボン担体への変数の吸着特性を示すことができる。このような連続的な炭素、穴あきカーボン、またはサンプルをサポートするためのformvarコーティングされたグリッドのような他の種類のサポートのグリッドを使用することが必要になるかも知​​れません。サンプルではグリッドではなく、炭素表面の銅バーへのバインディングの場合はさらに、、それが湿潤剤を使用してグリッドをインキュベートすることにより、または前のサンプルのほかに放電グローによる炭素表面の化学的性質を調整する必要があります。</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2。ステージの安定性：</em&gt;あなたが振動に気付いた場合、それは可能性が高い重量ではなく、液体窒素のバブリングで過負荷にされているサンプルの段階によるものです。極低温ステージの追加重量は、時々標準的な3軸の旅行の顕微鏡ステージに沿って送信するために低周波の振動を引き起こす、と否定的にぼかしを経由して画像に影響を与える可能性があります。これは、簡単にビデオに示すように、二重ネジの腕を持つ調整可能なミニリフトまたは調節可能なアダプタのいずれかで下から顕微鏡の旅行の段階をサポートすることによって修正することができます。これらの調節可能なサポートメカニズムの両方は、旅行のステージの非可動部分と相互作用し、したがって、イメージングに必要としても、XとY軸の変換を許可します。</p

特定の試薬と機器の表： <table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th><th>コスト</th></tr><tr><td> 1〜22.86センチメートル（9&quot;）傾斜したエッジを持つパイのパン</td><td>グッドクック</td><td></td><td>地元の食料品店</td><td> 4.39ドル</td></tr><tr><td> 1〜22.86センチメートル（9&quot;）ケーキパン</td><td>グッドクック</td><td></td><td>地元の食料品店</td><td> 4.93ドル</td></tr><tr><td>箸の4組</td><td></td><td></td><td>地元の食料品店</td><td> 0.50ドル</td></tr><tr><td> 1 - 素晴らしいもののスプレーフォーム</td><td>素晴らしいもの</td><td></td><td>地元の金物屋</td><td> 5.98ドル</td></tr><tr><td> 1 - アルミの4センチメートルx8cm x1cmブロック</td><td></td><td></td><td>地元の金物屋や金属のスクラップヤード</td><td> 10.00 $ </td></tr><tr><td> 5 - ＃10 1.91センチメートル（3 / 4&quot;）平頭溝ボルトW /ナット</td><td></td><td></td><td>地元の金物屋</td><td> 0.98ドル</td></tr><tr><td> 3 - ＃4 0.95センチメートルは（3 / 8&quot;）溝付きボルトW /ナットを丸める</td><td></td><td></td><td>地元の金物屋</td><td> 0.98ドル</td></tr><tr><td> 15 - ＃10ワッシャ</td><td></td><td></td><td>地元の金物屋</td><td> 0.98ドル</td></tr><tr><td> 2 - 透明なプラスチックのクリップボード</td><td></td><td></td><td>ローカルオフィスストア</td><td> 6.84ドル</td></tr><tr><td> 1 - 低温電子顕微鏡のグリッドボックスホルダー</td><td>テッドペラ</td><td> 160から41 </td><td></td><td> N / </td></tr><tr><td> 1 - 低温電子顕微鏡のグリッドボックスのハンドリングロッド</td><td>テッドペラ</td><td> 160から46 </td><td></td><td> N / </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1穴あき炭素膜、400メッシュの銅クライオEMサポートのグリッド</td><td> SPI用品</td><td> 4340C - XA </td><td></td><td> N / </td></tr></tbody></table>実験材料<ol><li> 酵母菌株：Hta1 - CFP：：カプランの研究室からKanMX6：カン（KSC - 3382：MATA、URA3 - 52、LYS2 - 801、ADE2 - 101、TRP1 -Δ63、HIS3 -Δ200、LEU2 -Δ1、Hta1 - CFP：カリフォルニア大学デ​​ービス校）。 </li><li> クライオ光学顕微鏡：クライオ光顕微鏡の画像はライカDFC310 FX CCDカメラとライカDM4000M反映して顕微鏡で撮影した。ブライトフィールド、暗視野と蛍光イメージは、HCX PL FLUOTAR 5倍0.15 NA空気の目標、HCX PL FLUOTAR倍0.30 NA空気の目標、PL FLUOTAR 50倍0.55 NA空気の目標やNPLAN 100倍0.75 NA空気の対物レンズを用いて取得した。明視野および暗視野像では、光源として12V 100Wタングステンランプを使用。フィルタキューブ蛍光の場合は、EL6000 UVランプのソースは、ライカJC1（：：BP 30分の480、DM LP 505、SF BP 40分の535＆LP 580 Ex.F.）と組み合わせて使用​​した。 </li><li> クライオ透過型電子顕微鏡：低温電子顕微鏡画像はガタン626クライオトランスファーホルダ（ガタン、米国）を利用した200 keVでJEM - 2100 - FEGの透過型電子顕微鏡（JEOL、日本）オペレーティングシステム上で取得した。顕微鏡写真は、4096 X 4096ピクセルTietz CCDカメラ（TVIPS、Gauting、ドイツ）で50、200、1,200、4,000 Xの公称倍率で記録した。 </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

低温光顕微鏡（極低温- LM）のカップリングと低温電子顕微鏡（クライオEM）は、細胞のダイナミクスと超微細構造を理解するための多くの利点をもたらす。最初に、細胞は、両方の技術のためのほぼネイティブ環境で撮像することができます。ガラス化プロセスのために、第二に、サンプルは迅速な物理的な固定化ではなく、ゆっくりと化学的固定によって保持されます。第三に、イメージングは​​クライオ- LMと低温電子顕微鏡の両方で同一のサンプルは、単一のセルではなく、&quot;代表的サンプル&quot;の比較からのデータの相関関係を提供します。これらの利点は、先行研究から知られているが、相関クライオ- LMと低温電子顕微鏡のままの普及は、適切な極低温光顕微鏡のステージを買うか、または構築の費用と複雑さにも制限がある場合があります。ここでは、アセンブリを示す、と地元のハードウェアとの食料品店で見つけた部品を以下の40ドルで、任意の研究室で作製することができる安価な極低温ステージを使用してください。このクライオ- LMステージは、長作動距離の空気の目標を装備している反射光顕微鏡用に設計されています。相関クライオ- LMと低温電子顕微鏡の研究では、試料の支持体として、カーボンコーティングされた標準の3mmの低温電子顕微鏡のグリッドの使用を適応させる。グリッドにサンプルを吸着した後、サンプルをガラス化して転送する/グリッドを処理するために、以前設定されたプロトコルは、マルチ技術のイメージングを可能にするために続いている。その結果、この設定は、反射光顕微鏡での検査では、凍結水和試料の直接の相関イメージングへのアクセス権を持つことができます。

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

我々は、最も反射光顕微鏡に合うように設計された低コストの低温ステージの製造を実証する。このラボに構築された極低温ステージには、低温光と低温電子顕微鏡との間の効率的かつ信頼性の相関イメージングを可能にします。

相関ライト/電子顕微鏡のための低コストクライオ光学顕微鏡のステージの作製

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.3K ビュー.  University of California Davis. 我々は、最も反射光顕微鏡に合うように設計された低コストの低温ステージの製造を実証する。このラボに構築された極低温ステージには、低温光と低温電子顕微鏡との間の効率的かつ信頼性の相関イメージングを可能にします。

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Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

生物工学

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

ハイスループットマイクロ流体の迅速かつ低コストのプロトタイピング包装方法

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

液体射出成形用の3Dプリント金型を用いた医療機器を迅速かつ低コストプロトタイピング

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

オープンソース、低コストのバイオインク、食品溶融物押出3Dプリンタの設計

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...