私たちのプロトコルは、損傷したDNA上で複製がどのように起こるかを調査する新しい可能性を開きます。この技術は、DNA病変の反対側の一本鎖DNAギャップの形成および修復を検出することができる。S1ヌクレアーゼは、一本鎖DNAを切断し、複製後のギャップの検出を可能にする。
このアプローチは、1970年代にブラジルでMeneghini博士とCordiero-Stone博士によって最初に使用され、最近DNAファイバーアッセイに適応しました。ここで説明する技術を使用して複製後ギャップの形成と修復を研究することで、ゲノムの完全性を維持するDNA修復と複製ストレス応答のメカニズムに関する洞察を得ることができます。本明細書に記載される両方のプロトコルについて、S1ファイバおよびギャップ充填アッセイには、データの正確な解釈を確実にするためにすべての制御を含めることが極めて重要である。
この手順は、私たちの研究室の博士課程の学生であるDavi J.Martinsと、私たちのグループで働く際に以前にこれらの技術を開発した共同研究者であるAnnabel Quinet博士によって実証されます。まず、培養培地を吸引し、直ちに20マイクロモルのIDU培地を含む培養培地を細胞に加える。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で正確に20分間インキュベートする。
その後、予め加温したPBSで細胞を2回素早く洗浄し、1メートル平方UV-Cあたり20ジュールを照射する。未処理のセルをコントロールとして使用します。直ちに200マイクロモルのCldUを含む培地を細胞に加え、摂氏37度および二酸化炭素5%で正確に60分間インキュベートする。
その後、予め加温したPBSで細胞を2回洗浄し、室温で細胞株に従ってCSK 100バッファーで2〜10分間透過処理する。CSK透過処理後、透過処理前のものと比較して、細胞質をほとんど持たない核が見られる。PBSを各ウェルの側面に慎重に注ぎ、PBSで核を洗浄する。
その後、核をS1緩衝液で洗浄する。S1バッファー中の核を、1ミリリットル当たり20単位のS1ヌクレアーゼと共に、そしてS1ヌクレアーゼを用いずに、摂氏37度で30分間インキュベートする。次に、S1 バッファーを吸引し、PBS に 0.1% BSA を追加します。
原子核をこすり、約注釈付きの1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブは常に氷の上に置いてください。核を約4, 600倍のGで4°Cで5分間遠心分離する。
ペレットをPBS中に約1,500細胞/マイクロリットルの濃度で再懸濁する。チューブを氷の上に置き、すぐにプロトコールを広げることによってDNA繊維調製に進む。顕微鏡スライドにカーボンペンシルで注釈を付け、トレイの上に平らに置きます。
均質化を確実にするためにチューブの底部をタップし、対応するスライドの上部に2マイクロリットルの細胞を加える。6マイクロリットルの溶解バッファーを加え、上下約5回ピペッティングして細胞を溶解する。ピペットチップを使用して滴をスライドの底部に向かってわずかに引っ張り、室温で5分間インキュベートして核を溶解します。
スライドを約 20 ~ 40 度傾け、一定の低速でスライドの底まで落下が広がるようにします。スライドを室温の暗闇の中で10〜15分間乾燥させます。次いで、それらを新しく調製した固定溶液を入れた瓶に浸し、室温で5分間インキュベートしてDNAをスライド上に固定する。
スライドをPBSで5分間2回洗浄し、新しく調製した2.5モルのクロリド酸でDNAを室温で40〜60分間変性させる。スライドをPBSで5分間3回洗浄し、以前に37°Cで30〜60分間温めた5%BSAでブロックします。用紙を軽くタップして、余分な液体をスライドから取り除きます。
スライドに30マイクロリットルの一次抗体を滴下し、その上にカバースリップを置きます。暗所の湿気の多いチャンバー内で室温で1〜1.5時間インキュベートする。スライドをPBSの入った瓶に入れて1〜2分間置き、カバースリップを慎重に取り外します。
PBSTを瓶に入れて5分間3回洗浄し、スライドをPBSに入れます。紙を軽く叩いて余分な液体を取り除き、30マイクロリットルの二次抗体をスライドに滴下して加えます。カバースリップを上に置きます。
暗湿したチャンバー内で室温で45〜60分間インキュベートする。スライドを洗浄し、余分なPBSをもう一度除去する手順を繰り返し、20マイクロリットルのマウント試薬をスライドに滴下して加えます。カバースリップを上に置き、泡を避けてください。
細胞が溶解したスライドの上部近くに浸漬油の滴を置きます。緑色のチャンネルを使用し、背景の緑色の点を検索してフォーカスを見つけます。Leica Application Suiteソフトウェアを開き、[取得]をクリックして、緑色のチャンネルを選択します。
解析前に緑色のチャンネルの設定を調整します。次に、赤いチャンネルに変更し、設定を調整します。繊維の主な濃度を見つけ、エッジに移動して、よく広がる、重なり合っていない個々の繊維を見つけます。
1 つのチャンネルのみを使用して画像の領域を選択し、潜在的なバイアスを回避します。オーバーレイの取得アイコンをクリックし、正しい顕微鏡倍率になるようにソフトウェアを調整します。スライドごとに約 15 ~ 20 枚の写真を、スライド全体と一緒に緑のチャンネルで撮影し、次に赤のチャンネルで撮影します。
これで 2 つのチャンネルがマージされ、作成されたオーバーレイが一意のフォルダーに移動されます。赤と緑の色の繊維を見ることができます。ImageJソフトウェアを開き、5番目のアイコンを左クリックし、2番目のオプションを選択してから、セグメント化された線ツールを選択します。
左クリックして赤または緑の地区の正確なパスを描画し、右クリックして描画を停止します。キーボードのMボタンを押して長さを測定します。S1 ファイバーの場合、各ファイバーの赤と緑のトラクトの測定値を追跡し、異なる画像から少なくとも 150 本のファイバーから赤と緑のトラクトの長さを測定します。
S1ファイバは、これらの代表的な画像に示されている。S1ヌクレアーゼによる切断に対して隙間がなくかつ不浸透性の対照新生DNA管がここに示されている。S1ヌクレアーゼによって切断されたギャップに対して陽性のDNA管は、より短いCldU管長をもたらした。
テキスト原稿に広く記述されている差分ラベル付けスキームを実行して、ギャップを埋めるイベントにラベルを付けることができます。ギャップ充填アッセイと名付けられたこのアッセイでは、少なくとも1つのCldUパッチまたはより少ないCldUパッチを有するより長いIDUトラックは、低いギャップ充填密度に対応する。少なくとも 1 つの CldU パッチを持つ短い IDU トラクトと、より多くの CldU パッチを持つ長い IDU トラクトは、高いギャップ充填密度に対応します。
このプロトコルの透過処理ステップは、S1ヌクレアーゼが損傷したDNAの複製中に形成されたギャップに作用するために極めて重要である。S1ヌクレアーゼは、彗星アッセイプロトコルにおいて、治療後に持続する損傷DNAの複製中に形成されるギャップを検出するためにも使用することができる。S1ファイバーアッセイは、複製後のギャップが、特にBRCA1および2遺伝子に変異を有する乳がんおよび卵巣がんにおいて、がんの脆弱性を引き起こす可能性があるという新しいパラダイムへの道を開いた。
