我々は彼の科学的なアドバイスや顕微鏡装置のUNILのイメージングCIFのプラットフォームのために特にモニークNenniger彼女の優秀な技術サポートのためのトサトだけでなく、ジャン=イヴチャットンに感謝したいと思います。資金は、スイス国立科学財団によって提供されていました。

1。マウスVNOの解剖<ol><li>成体マウスを使用してください。フェロモンセンシングがmultimodalitiesに関与しているように、菌株、遺伝子型、性別と年齢の間に慎重に区別は重要であり、あなたの結果に影響を与えます。ここで、我々は以前にフェロモン受容体ペア（2 -ヘプタノン- V1rb2）31（ 図1A）の識別に使用される成人VGマウス30を選択します。 </li><li>塩化ナトリウム118 mMの、飽和NaHCO 3 25mMの、D -グルコース10 mMのは、KCl 2mMの、のMgCl 2 2mMの、のNaH 2 PO 4 1.2 mMの、CaCl 2の 2、解剖を開始する前に、新鮮な寒さの人工脳脊髄液を（ACSF準備mMの、oxycarbon（95％O 2で飽和pHは7.4）：5％CO 2）。そのためには、CaCl 2の場合を除き、すべてのACSFのコンポーネントを混在させること。直接oxycarbonでそれをバブリングすることにより解決策を飽和させる。最後に、CaCl 2を追加し、必要な量にのddH 2 0で調整してください。 Uまで氷上でACSFのソリューションを維持するSE。 </li><li>マウスの安楽死は、優先的にただの実験の前に頚椎脱臼によりまたはCO 2吸入により行われる必要があります。 </li><li>マウスの頭部をカット。継続的にoxycarbonated冷たいACSFで解剖顕微鏡の下に置きます。 </li><li> （ 図1B）口蓋を視覚化するために下顎との位置頭をカット。 </li><li>マイクロはさみによる口蓋の上部（ 図1B）に水平に切開を行い、ミクロ解剖ピンセットで口蓋の膜を取り除く。水和物とACSF（ 図1C）で公開された空洞をきれいに。 </li><li>上部を切り取り、鼻中隔（ 図1C）の下部。微妙にVNOを含む鼻中隔を抽出し、氷（ 図1D）にACSFに収めます。 </li><li>垂直にマイクロ解剖鉗子を使用してVNOの二つの部分を分離し、繊細なVNOの軟骨カプセルを削除（図。 1E）。すべての軟骨の部分が削除されていることを確認します。 </li></ol> 2。 VNOの組織のスライス標本このセクション2）で説明されているVNO組織のスライス標本では、主にカルシウムイメージングの調査のためです。 VNOのスライスは、組織の構造的完全性をプロトコルの（セクション3を参照してください）​​）を確認するためにフローティングされたスライス上のimmunohistostainingsに使用することができます。 <ol><li>低融点寒天（標準PBS中の3％）と作業場所を準備します。あなたは、精度のワイプ、ブラシ、組織培養プレート、cyanacrylat接着剤、氷と温度計をACSF、ミクロトームとサポートし、マイクロ切開鉗子、埋め込み型（22 × 22 × 20 ​​mm）を必要になります。 </li><li> 3パーセントの低融点寒天で埋め込み金型を埋める。温度が41よりも高いではないことを° C冠状スライスを得ることができるように垂直にすぐに一掃VNO（ 図2A）を配置する前に確認してください。 </li><li>氷の上で埋め込み金型を配置その後1凝固までの分とのために寒天のブロックからそれを分離する。ピラミッド型の形状で寒天ブロックをカットし、ミクロトームサポート（ 図2B）に接着剤でそれを置きます。 </li><li> 0.5ミリメートル/秒、0.7 mmの振幅と冷たいACSFで100μmの厚さの速度で、ミクロトームで冠状VNOスライスをカットし、寒さで満たされた組織培養プレートに置く前に、ブラシで組織切片を収集するACSF。 </li><li>あなたのスライスがGFPのような内因性の蛍光を（遺伝子標的ニューロンの）が含まれている場合には、蛍光実体顕微鏡（ 図2C）の下でそれらを選択することができます。 </li></ol> 3。 VNO浮動スライス上で免疫組織化学この手順の目的は、セクション2）で得られたVNOの組織切片の整合性を確認することです。アセチル化チューブリンは、VNO感覚ニューロンの樹状突起と微絨毛に発現し微小管/細胞骨格マーカーです。カルシウムイメージング実験のために、方向を行くtlyへのプロトコルのセクション4）。フローティングVNOスライス上で免疫組織染色法は、対象とする任意のタンパク質の発現の評価に適応することができます。この目的のために、我々は、4℃で1時間のためにVNOをする、解決することを° Cを固定液で（PBS、pHが7.6のパラホルムアルデヒド4％）ポイント1.7の後に）この時点PBSからプロトコルと使用のpHは7.6ではなく、お勧めACSFソリューション。 <ol><li>組織培養プレートでは、固定液に興味のあるスライス（PBS、pHが7.6のパラホルムアルデヒド4％）で4 1H℃を修正</li><li> 0.5％でNGS（血清正常ヤギ）10％、トリトンX - 100を含むPBS溶液で4℃一晩あなたの組織切片° Cをブロックする。 </li><li> 0.25パーセントでNGS 5％トリトンX - 100を含むPBS溶液で室温（RT）で16時間一次抗体とスライス（抗アセチル化チューブリン、マウス、1:2000）インキュベートする。 </li><li> NGS 2％を含むPBS溶液で5分間3回洗浄する。 </li><li>セコで暗所でインキュベートNGSの室温で1時間の2％を含むPBS溶液でndary抗体（Cy5標識ヤギ抗マウス、1:200）。 </li><li>のみNGSの2％、PBS NGS 1％を含むPBSとPBSで5分間3回洗浄する。 </li><li>疎水性の区切りゾーン（疎水性のペンを使用する）の中央に配置することにより、蛍光マウンティング培地（DAPIを含むかどうか）でスライスをマウントし、カバースリップを持つスライスをカバー。 </li><li>共焦点顕微鏡と3D再構成（ 図2D - F）を許可するソフトウェアを使用して観測し、買収を行う。 </li></ol> 4。 VNOのスライス上にカルシウムイメージング<ol><li>次の手順では、暗闇の中で行われます。 37 1時間インキュベートVNOスライス°フラ- 2AM（7μM、DMSO中の1mMのストック溶液）で冷たいACSFで構成されるローディング溶液中でCとプルロニック0.1％（w / vの;のddH 2で20％のストック溶液O）。 </li><li>使用するまでoxycarbonationと氷の上にロードされたスライスをしてください。ロードされたスライスを使用するために残しておくことができます3 - 4H。 </li><li> ACSFを含む灌流チャンバー内のブラシでロードされたスライスを置き、組織切片のアンカー（ 図3A）とスライスを維持する。 </li><li>カルシウムイメージング顕微鏡（ 図3B）のステージ上の灌流チャンバーを置き、継続的に室温でoxycarbonated ACSFを灌流。温度は、バイポーラの温度コントローラを用いて適応させることができる。 </li><li>ロードされたVNOスライス（ 図3C - E）の観測は、25倍または63x客観的かつクールSNAP - HQのカメラで、倒立蛍光顕微鏡で実行されます。照明は、ポリクロメータの楽器で（380分の340 nm）を連続して行われ、5Hzのの速度で記録されます。フィルタリングされた放射は510 nmで行われます。細胞内カルシウムの比率の変化（ΔF= 340 nm/380 nm）は適切なソフトウェアを使用して監視されます。 </li><li> Chemostimulationは、あなた自身の実験目的に応じて適宜選択されるべきである。ここでは、フェロモンMを含むACSFのperfusionsIX（イソブチルアミン、2 -ヘプタノン、4 -ヘプタノン、2 -ヘプタノール、pentylacetate、dimethylpyrazine、α/β-ファルネセン、10 -6 M）、2 -ヘプタノン（10 -6 M）またはたての（1オスとメス収集： 1）マウスの尿（1:100）が32を実行している。 ATP（125μM）の灌流は、実験の終了時に実行可能性のテストとして使用されます（ 図3F）と約80％生存ニューロンの割合を示す必要があります。これらの条件下で、スライスは2時間まで使用することができます。 </li><li>感覚ニューロンのGFPタグ亜集団は、特定の照明（ここV1rb2表現する神経細胞）によって可視化されると（ 図3G - I）を正確に分析することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 多形質導入マウスVNOで行われている、または新たなフェロモン受容体のペアを識別するための経路を調査する機能アッセイを確立するために、我々は、VGマウスライン（ 図1Aを活用する</stroNG&gt;）。この行では、240 V1Rs受容体のうち1人は、V1Rb2受容体は鋤鼻感覚ニューロンの特定のサブポピュレーションの容易な視覚化を可能にGFPタグ付きです。 VNO（ 図1E）の抽出と解剖の後、我々は急性VNOスライス（ 図2C）を用意する。我々は、アセチル化チューブリン蛋白質（ 図2D - F）に対してimmunohistostainingsを実行することで、準備のtissular整合性をチェックし、検証するために、それらの一部を修正。スライスの他の画分をカルシウムイメージング実験に使用されます。そのためには、スライスはフラ- 2AM（ 図3C - E）によってロードされ、各ニューロンの細胞内カルシウムレベルは、ΔFの比（ 図3F）として監視されます。ニューロンの生存性は、ΔF比の迅速かつ一時的な増加が（ 図3F）期待される後、ATPの灌流（125μM）によって評価されます。フェロモンの主要な供給源である尿、新鮮なの灌流LY収集したマウスの尿（1:100）は、内在性コントロールとして使用されます。それは、記録されたニューロン（セル1と2、 図3F）の約50％のカルシウムトランジェントをトリガします。 GFP照明の下、V1Rb2陽性ニューロンは、2 -ヘプタノン、観察、およびその既知のフェロモンリガンドの灌流され、細胞の活性化を（セル1、 図3I）を開始します。興味深いことに、神経細胞のアクティベーションは、VNOでコーディングフェロモンの複雑さを示す、V1Rb2受容体（GFP陰性ニューロン）（セル2、 図3I）を発現していないニューロンの割合で観測されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> 図1マウス鋤鼻器官の解剖。 VGのラインから（A）マウス。 （B）マウスの安楽死の後、完全な頭部は、双眼顕微鏡下に置かれており、下顎が口蓋を視覚化するために削除されます。小さな水平方向の切開が行われる（黒の破線）。 （C）口蓋を除去した後、VNOが並ぶ鼻中隔は、VNOの抽出を容易にするために上側と下側の部分（白点線）にカットされます。 （D）VNOは、ACSFのソリューション内に配​​置し、（挿入：二つの部分の高いパワービュー）分離されています。 （E）VNOの軟骨カプセルは微妙に削除され、その軟骨カプセルのないVNOは、実験の残りの部分に使用されます。スケールバーは以下のとおりです、1 mmに。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> 図2。マウスの鋤鼻急性スライス標本とtissular整合性。 （A）マウスVNOは垂直に寒天3％溶液に埋め込まれています。寒天の温度は41℃未満にする必要があります（B）寒天ブロックはピラミッド状の形状にカットされ、100μmのVNOのセクションは、（黒の破線）ACSFで生成されます。 （C）VNOのスライスは、特定のを可視化するために、蛍光実体顕微鏡下で選択することができます。タグ付けされた感覚ニューロンの人口。 （DF）Tissularの整合性は、アセチル化チューブリン蛋白質、準備の完璧な保護を実証V1rb2遺伝子標的ニューロンのより高い電力のビューに対してimmunohistostainingsによって評価することができる。内腔の表面（E）だけでなく、樹状ノブや微絨毛の構造タンパク質の発現に達した彼らの長い樹状突起を持つ神経細胞は、（F）を観察することができます。スケールバーは以下のとおりです。Bを5mm、C、60μmの、D、40μm以下、EF、20μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> 図3。カルシウムイメージングと鋤鼻急性組織切片におけるフェロモンの検出。 （A）フラ- 2AMローディングフェーズの後、VNOのスライスは、灌流チャンバー内に配置され、適応アンカー（ハイパワービュー）で維持されます。 （B）実験が暗いとVNOスライスで実行される連続的に真空システムを用いてRTでACSFを灌流されています。温度はchosすることができますバイポーラペルティエ素子と熱プローブによって構成される温度制御装置のシステムを使用してエン。この特定の実験は室温で行った。 （CE）VNOのスライスは、（D）と神経細胞活性化（E、ここでATPを持つ）の間の前にホフマンの位相コントラスト（C、HV）やフラ380nmの照射下で観測されています。 （F）神経生存率は、ATP（125μM）の灌流で評価されます。ここで、chemostimulationは、尿（尿、1:100）、または165ミリリットル/ hの一定流量でマウスのフェロモンの混合（ミックスのpH。、10 -6 M）で行われます。細胞内カルシウム濃度（ΔF）（セル1〜3）各セルごとに個別に記録することができます。 （G）V1Rb2のニューロンがGFP照明（1）に基づく可視化です。 （H）このニューロン（1）と同様に非V1rb2表現するニューロン（2）の荷重が表示されます。 （I）V1rb2のニューロンは、細胞内カルシウムの増加とともに2 - ヘプタノンに対応することができます。この特定の非V1rb2表現するニューロンは、また、2 - ヘプタノン（セル2）に応答します。スケールバーは以下のとおりです。CE、20μm以下、GH、は15μm、ΔF= 340 nmの/ 380nmの。 （FおよびI）刺激のアプリケーションの持続時間は、各トレースの下のバーで示されます。任意のカラースケールは、蛍光強度を表します。

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで紹介するカルシウムイメージング法は、急性スライス標本では、マウスVNOニューロンのフェロモン応答を記録することができます。このアプローチでは、鋤鼻ニューロンに動物の解剖は、いくつかの練習で、容易に達成可能であり、長期生体組織の準備を提供します。それは、薬理学的調査やフェロモンのコーディングの研究のように時間のかかる実験をすることができます。この生理学的手法では、大規模な集団だけでなく、正確な神経細胞集団は、特に分析することができます。さらに、この方法は簡単に他のカルシウム色素に基づいて、免疫組織化学的なアプローチや実験に適応することができます。これらを組み合わせた方法論を使用すると、確実にマウス鋤鼻器官に発現し、多くの孤児の化学受容体の新たなフェロモンリガンドの同定が可能になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アデノシン5&#39; -三リン酸二ナトリウム塩溶液（ATP） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A6559 - 25UMO </td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A7002 - 100G </td><td>優先的に免疫組織化学のための</td></tr><tr><td>寒天（低融点） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A0701 - 25G </td><td>優先的にカルシウムイメージングのための</td></tr><tr><td> CL - 100バイポーラ温度コントローラ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> W64 - 0352 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5標識AffiniPureヤギ抗マウスIgG </td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 115から175から071 </td><td>光から保護</td></tr><tr><td> DMSO（ジメチルスルホキシド） </td><td>メルク</td><td> 317275 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型、ピールウェイ</td><td> Polysciences </td><td> 18646A - 1 </td><td> 22 × 22 × 20ミリメートル</td></tr><tr><td>蛍光マウンティング培地（DAPIとVectashield、10 ml）を</td><td> Rectolab </td><td> H - 1200 </td><td></td></tr><tr><td>フラ- 2AM </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td>光から保護</td></tr><tr><td> Glisseal N（真空グリース、60g）を</td><td>ボーラーのChemie社</td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td>大浴場の録音室（RC - 26G） </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor（カルシウムイメージングのためのソフトウェア、v.7.6.5.0） </td><td> Visitronシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モノクローナル抗チューブリン、アセチル化Dマウス抗体</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T6793 - .2ML </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清（NGS、10ml）を</td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td>チャンバー用のプラットフォーム（P - 1） </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0277 </td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF - 127、2gの</td><td>インビトロジェン</td><td> P - 6867 </td><td></td></tr><tr><td>ロティコル（投薬瓶、10g）を</td><td>カールロート</td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC - 20デュアルインラインソリューションのヒーター/クーラー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> W64 - 0353 </td><td></td></tr><tr><td>スライスのアンカー（SHD - 26GKIT） </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td>スーパーPAPのPEN（疎水性ペン） </td><td> Pelcoの国際</td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td>フルカ</td><td> 93420 - 250ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>振動刃ミクロトームVT 1200S </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome高速ポリクロメータ方式</td><td> Visitronシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3Dデータの可視化（Imaris; v.6.3.1） </td><td>ビットプレーン科学ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

ピーターカールソンとマーティンルッシャーは、イントラ種の通信に使用される化学物質を記述するために1959年1で初めて長期的フェロモンを使用していました。フェロモンは揮発性または不揮発性の短命な分子である2分泌および/ ​​または尿など、フェロモン3の主な源であることが知られている液体のような生物学的流体3,4、に含まれている。フェロモンコミュニケーションは、親族間相互作用5,6、階層的な組織3、性的な相互作用7.8などの主要な動物のモダリティの多様に関与していると結果的に直接与えられた種9,10,11の生存と相関している。マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）10,12、鼻腔の底部にある対になった構造によって媒介される、と軟骨カプセルに封入。各VNOは、外部との接触を可能にする内腔13,14と筒形状を有している化学の世界。感覚神経上皮は、主に鋤鼻バイポーラ感覚ニューロン（VSNを）15で構成されています。各VSNは、化学物質の検出16に関与する100絨毛まで付いた大きな樹のノブで終わる腔に単一の樹状突起を拡張します。 VSNの多数の亜集団が存在している。それらはおそらく彼らが17,18を認識するリガンド（s）でこのように表現し、化学受容器によって区別されます。二つの主要な鋤鼻受容体ファミリー、V1RsとV2Rs 19,20,21,22は 、240 23 120 24メンバーによってそれぞれ構成され、神経上皮の別々の層で表されます。嗅覚受容体（ORS）25とホルミルペプチド受容体（FPRの）26,27は、VSNをで表されます。 これらのニューロンの亜集団は、センシングフェロモンのために同じ下流のシグナル伝達経路を使用しているかどうかは不明です。カルシウム透過性チャネル（が果たす主要な役割にもかかわらず28 TRPC2独立した情報伝達のチャンネルが6,29を提案されている成熟した神経細胞の微絨毛に存在TRPC2）。神経細胞集団の数が多いとオルガンの独特な形態のために、VNOに存在するシグナル伝達要素の薬理学的および生理学的な調査は複雑です。 ここで、我々は、カルシウムイメージングの調査を行うためのマウスVNOの急性組織のスライス標本を提示する。この生理学的アプローチは、以前にフラ- 2AM、カルシウム色素でロードされたVSNの一般的なまたは個々の部分集団の生体組織の自然環境、で、観察することができます。このメソッドは、GFPタグ付きのフェロモン受容体を研究するにも便利ですし、他の蛍光カルシウムプローブの使用のための適応です。例として、我々はここにフェロモンV1rb2受容体の翻訳はポリシストロン戦略によるGFPの発現にリンクされているVGマウス30行目を 、使用してください。 </p&gt;

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）によって媒介される。ここでは、カルシウムイメージングを行うためのVNOの急性組織のスライス標本が記載されている。この生理学的アプローチは、生体組織に集団および/または個々の神経細胞の観察を可能にし、受容体 - リガンドの識別に便利です。

マウス鋤鼻急性組織スライス標本のイメージングフェロモンセンシング

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K ビュー.  University of Lausanne. マウスでは、フェロモンを検出する能力は、主に鋤鼻器官（VNO）によって媒介される。ここでは、カルシウムイメージングを行うためのVNOの急性組織のスライス標本が記載されている。この生理学的アプローチは、生体組織に集団および/または個々の神経細胞の観察を可能にし、受容体 - リガンドの識別に便利です。

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

鋤鼻上皮の多電極アレイ録音

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

神経科学

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

スライスの準備、器官組織培養と視交叉上核における時計遺伝子の活動のルシフェラーゼ記録

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

カルシウムイメージングの急性脳室下帯スライスの調製

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

スライスこれホット：生理的温度における急性成人の脳スライス

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...