Vogliamo ringraziare particolarmente Monique Nenniger Tosato per il suo eccellente supporto tecnico e Jean-Yves Chatton per i suoi pareri scientifici e la piattaforma di imaging CIF della UNIL per le apparecchiature microscopio. Il finanziamento è stato fornito dal Fondo nazionale svizzero.

1. Dissezione del VNO del mouse <ol><li> Utilizzare topi adulti. Come feromone di rilevamento è implicato in multimodalità, attenta distinzione tra ceppi, genotipi, sessi ed età è importante e influenzerà i risultati. Qui, abbiamo scelto i topi adulti VG 30 precedentemente utilizzati per l&#39;identificazione di un feromone-recettore coppia (2-eptanone-V1rb2) 31 (fig. 1A). </li><li> Prima di iniziare la dissezione, preparare fresco freddo artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF; 118 mM NaCl, NaHCO 3 25 mM, D-glucosio 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) saturo di oxycarbon (95% O 2: 5% di CO 2). Per questo, mescolare tutti i componenti tranne ACSF CaCl 2. Saturare la soluzione direttamente spumeggiante con oxycarbon. Alla fine, aggiungere i 2 CaCl e regolare con DDH 2 0 al volume desiderato. Tenere la soluzione ACSF sul ghiaccio fino use. </li><li> L&#39;eutanasia del mouse dovrebbe essere preferenzialmente fatto da dislocazione cervicale o da CO 2 inalazione poco prima l&#39;esperimento. </li><li> Tagliare la testa del mouse. Posto sotto un microscopio da dissezione a freddo ACSF continuamente oxycarbonated. </li><li> Tagliare la mandibola e la posizione della testa in modo da visualizzare il palato (Fig. 1B). </li><li> Fare un&#39;incisione in senso orizzontale nella parte superiore del palato (Fig. 1B) con le forbici micro e rimuovere la membrana palato con micro dissettore. Idratare e pulire la cavità esposta con ACSF (Fig. 1C). </li><li> Tagliare la parte superiore e la parte inferiore del setto nasale (Fig. 1C). Delicatamente estrarre il setto nasale contenente il VNO e metterla direttamente in ACSF su ghiaccio (fig. 1D). </li><li> Separare verticalmente le due parti del VNO utilizzando micro dissettore e delicatamente rimuovere la capsula cartilaginea del VNO (Fig. 1E). Assicurarsi che tutti i pezzi cartilaginei vengono rimossi. </li></ol> 2. VNO tessuto preparazione fetta La preparazione dei tessuti VNO fetta descritto in questa sezione 2) è principalmente per le indagini di imaging di calcio. Fette VNO può essere utilizzato anche per immunohistostainings su fette galleggianti per verificare l&#39;integrità strutturale del tessuto (vedi sezione 3) del protocollo). <ol><li> Preparare basso punto di fusione agar (3% in standard PBS) e il vostro posto di lavoro. Avrete bisogno di ACSF, un microtomo e supporta, micro dissettore, incorporando stampi (22 x 22 x 20 mm), salviette di precisione, spazzole, piastre di coltura dei tessuti, cyanacrylat colla, ghiaccio e un termometro. </li><li> Riempire lo stampo con il 3% embedding basso punto di fusione agar. Assicurarsi che la temperatura non è superiore a 41 ° C prima di mettere in verticale il poco cancellato VNO (Fig. 2A) per essere in grado di ottenere fette coronali. </li><li> Mettere lo stampo embedding su ghiaccioper 1 minuto fino a solidificazione e quindi separato dal blocco di agar. Tagliare il blocco agar in una forma piramidale e posizionarlo con la colla sul supporto microtomo (Fig. 2B). </li><li> Tagliate le fette coronali VNO con il microtomo, con una velocità di 0,5 mm / s, un&#39;ampiezza di 0,7 mm e uno spessore di 100 micron a freddo ACSF e raccogliere le fette di tessuto con una spazzola prima di inserirle in una piastra di coltura dei tessuti pieni di freddo ACSF. </li><li> Se le sezioni contengono fluorescenza endogena come GFP (in gene-mirati neuroni) è possibile selezionare sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza (Fig. 2C). </li></ol> 3. Immunoistochimica su fette VNO galleggiante L&#39;obiettivo di questa procedura è quello di verificare l&#39;integrità del tessuto fette del VNO ottenuto in sezione 2). Acetilati-tubulina è un microtubulo / citoscheletro marcatore espresso in dendriti e microvilli dei neuroni sensoriali VNO. Per gli esperimenti di imaging di calcio, andare direzionetemente alla sezione 4) del protocollo. Il metodo immunohistostaining mobile a fette VNO può essere adattato alla valutazione dell&#39;espressione di una proteina di interesse. A tal fine, si consiglia di fissare il VNO per 1h a 4 ° C in una soluzione di fissativo (paraformaldeide 4% in PBS, pH 7.6) dopo il punto 1.7) del protocollo e l&#39;utilizzo da questo punto di PBS a pH 7,6, piuttosto che ACSF soluzione. <ol><li> Nella piastra di coltura tissutale, fette di riparare il vostro interesse in una soluzione di fissativo (paraformaldeide 4% in PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C. </li><li> Blocca il tuo fette di tessuto notte a 4 ° C in una soluzione PBS contenente NGS (siero normale di capra) 10% e Triton X-100 allo 0,5%. </li><li> Incubare fette con l&#39;anticorpo primario (anti-acetilati-tubulina, Mouse, 1:2000) per 16h a temperatura ambiente (RT) in una soluzione PBS contenente NGS 5% e Triton X-100 allo 0,25%. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti con una soluzione di PBS contenente NGS 2%. </li><li> Incubare al buio con il secoanticorpi ndary (Cy5-coniugato capra anti-topo, 1:200) in una soluzione PBS contenente NGS 2% per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS contenente NGS 2%, PBS NGS 1% e PBS solo. </li><li> Montare le sezioni in un supporto di montaggio a fluorescenza (contenenti o meno DAPI) mettendoli al centro delle zone delimitate idrofobica (usare una penna idrofobico) e coprire le fette con coprioggetto. </li><li> Fare osservazioni e acquisizioni con la microscopia confocale e di un software che consente ricostruzioni 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Immagini di calcio su fette VNO <ol><li> Le seguenti procedure si svolgeranno al buio. Incubare fette VNO per 1h a 37 ° C in una soluzione di carico composto da freddo ACSF con Fura-02:00 (7 mM, soluzione madre di 1 mM in DMSO) e Pluronic 0,1% (w / v; soluzione madre al 20% in DDH 2 O). </li><li> Tenere le fette caricato su ghiaccio con oxycarbonation fino al momento dell&#39;uso. Fette caricate possono essere conservati per3-4h. </li><li> Mettere le fette caricato con un pennello in una camera di perfusione contenente ACSF e mantenere le fette con una fetta di ancoraggio dei tessuti (Fig. 3A). </li><li> Posizionare la camera di perfusione sul palco di un microscopio di imaging di calcio (Fig. 3B) e continuamente profumato con oxycarbonated ACSF a temperatura ambiente. Temperatura può essere adattato con l&#39;utilizzo di un regolatore di temperatura bipolare. </li><li> Osservazioni delle fette caricato VNO (Fig. 3C-E) sono eseguiti con un microscopio invertito a fluorescenza, con un obiettivo 25x o 63x e un luogo fresco SNAP-HQ telecamera. L&#39;illuminazione è fatta in modo sequenziale (340/380 nm) con uno strumento policromatore e registrati a una velocità di 5Hz. Emissione filtrata viene effettuata a 510 nm. Cambia il rapporto di calcio intracellulare (ΔF = 340 nm/380 nm) sono monitorati con un apposito software. </li><li> Chemostimulation devono essere selezionati secondo il vostro scopo sperimentale. Qui, perfusione di ACSF contenente un feromone mix (isobutylamine, 2-eptanone, 4-eptanone, 2-eptanolo, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 M), 2-eptanone (10 -6 M) o raccolto di recente maschili e femminili (1: 1) urina topo (1:100) vengono eseguite 32. Perfusione di ATP (125 mM) è usato come un test di vitalità economica alla fine degli esperimenti (Fig. 3F) e dovrebbe indicare una percentuale di circa l&#39;80% dei neuroni vitali. In queste condizioni, le fette possono essere utilizzati fino a 2 ore. </li><li> GFP-tagged sottopopolazioni di neuroni sensoriali sono visualizzati con illuminazione specifica (qui i neuroni che esprimono V1rb2) e possono essere analizzati con precisione (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Per stabilire un dosaggio funzionale per indagare i percorsi di trasduzione più in atto nel VNO mouse, o per individuare nuove feromoni-recettori coppie, approfittiamo del mouse VG linea (Fig. 1A </strong&gt;). In questa linea, uno su 240 V1Rs recettori, il recettore è V1Rb2 GFP-tagged permettendo la facile visualizzazione di una particolare sottopopolazione di neuroni sensoriali vomeronasale. Dopo l&#39;estrazione e la dissezione del VNO (Fig. 1E), ci prepariamo acuta fette VNO (Fig. 2C). Fissiamo una frazione di loro, al fine di verificare e validare l&#39;integrità tissutale della preparazione eseguendo immunohistostainings contro la tubulina acetilata-proteina (Fig. 2D-F). L&#39;altra frazione delle fette viene utilizzato per esperimenti di imaging di calcio. Per questo, le fette sono caricati con Fura-02:00 (Fig. 3C-E) e il livello di calcio intracellulare di ogni neurone è monitorato come un rapporto ΔF (Fig. 3F). La vitalità dei neuroni viene valutata da perfusione di ATP (125 micron), dopo di che rapido aumento e transitoria del rapporto ΔF è atteso (Fig. 3F). L&#39;urina è una delle principali fonti di feromoni, perfusione di frescal&#39;urina del mouse Ly raccolti (1:100) viene utilizzato come controllo endogeno. Si innesca transienti di calcio in circa il 50% dei neuroni registrati (cella 1 e 2, fig. 3F). Sotto GFP illuminazione, V1Rb2 neuroni positivi sono osservabili, e perfusione di suo ligando noto feromonali, 2-eptanone, avvia l&#39;attivazione cellulare (cella 1, fig. 3I). È interessante notare che attivazioni neuronali sono osservabili in una frazione di neuroni che non esprimono il recettore V1Rb2 (neuroni negativo GFP) (cella 2, fig. 3I), a dimostrazione della complessità del feromone di codifica nel VNO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione dell&#39;organo vomeronasale del mouse. (A) Un mouse dalla linea VG. (B) Dopo l&#39;eutanasia del mouse, la testa piena è posta sotto un microscopio binoculare e la mascella inferiore viene rimosso in modo da visualizzare il palato. Una piccola incisione orizzontale è fatto(Linea nera tratteggiata). (C) Dopo la rimozione del palato, il setto nasale allineato con il VNO è tagliato in alto e la parte inferiore (bianco linee tratteggiate) per facilitare l&#39;estrazione VNO. (D) Il VNO si trova in soluzione ACSF e separati (inserire: vista di potenza superiore delle due parti). (E) La capsula cartilaginea del VNO è delicatamente rimosso, e il VNO senza la sua capsula cartilaginea viene utilizzato per il resto degli esperimenti. Barre di scala sono: BE, 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figura 2. Mouse vomeronasale preparazione fetta acuta e dell&#39;integrità tissutale. (A) La VNO mouse è verticalmente integrata in una soluzione agar 3%. La temperatura del agar deve essere inferiore a 41 ° C. (B) Il blocco di agar è tagliato in una forma piramidale e 100 micron sezioni VNO (linea nera tratteggiata) sono generati in ACSF. (C) fette VNO può essere selezionato sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza per visualizzare uno specificopopolazione di tag neuroni sensoriali. (DF) integrità tissutale può essere valutato immunohistostainings contro la tubulina acetilata-proteina, una visione di potenza superiore del V1rb2 gene mirati neuroni dimostrare la perfetta conservazione della preparazione. I neuroni con i loro dendriti che raggiunge la superficie del lume (E) così come l&#39;espressione della proteina strutturale nel manopole dendritiche e microvilli può essere osservato (F). Barre di scala sono: B, 5 mm; C, 60 micron; D, a 40 micron, EF, 20 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini di calcio e la rilevazione di feromoni in vomeronasale fette di tessuto acuta. (A) Dopo un Fura-02:00 fase di carico, fette VNO sono posti in una camera di perfusione e sono mantenuti con un ancoraggio adeguato (vedere ad alta potenza). (B) Gli esperimenti sono eseguiti nel buio e fette VNO sono continuamente perfuso con ACSF a temperatura ambiente con un sistema di vuoto. La temperatura può essere chosit con un sistema di controllo della temperatura composto da un elemento bipolare Pelletier e una sonda termica. Questo particolare esperimento è stato eseguito a temperatura ambiente. (CE) fette VNO sono osservabili in contrasto di fase Hoffman (C, Hv) o Fura 380 nm prima di illuminazione (D) e durante l&#39;attivazione neuronale (E, qui con ATP). (F) vitalità neuronale è valutata con perfusione di ATP (125 mM). Qui, chemostimulation avviene con le urine (urina, 1:100) o con un mix di feromoni del mouse (ph mix., 10 -6 M) ad un flusso costante di 165 ml / h. I livelli di calcio intracellulare (ΔF) può essere registrato individualmente per ogni cella (Cella 1 a 3). (G) Un neurone V1Rb2 viene visualizzato sotto GFP illuminazione (1). (H) Il carico di questo neurone (1) così come un non-V1rb2 neuroni che esprimono (2) viene visualizzato. (I) Il neurone V1rb2 è in grado di rispondere a 2-eptanone con un aumento del calcio intracellulare. Questo particolare non V1rb2 neuroni che esprimono risponde anche a 2-eptanone (cella 2). Barre di scala sono: CE, 20 micron; GH,15 micron; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F e I) Durata di applicazione stimolo è indicata dalle barre sotto ogni traccia. La scala cromatica arbitraria rappresenta l&#39;intensità di fluorescenza.

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Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di imaging di calcio qui presentata permette di registrare, in una preparazione fetta acuta, le risposte feromonali di topo neuroni VNO. Con questo approccio, dissezione dall&#39;animale ai neuroni vomeronasale è, con po &#39;di pratica, facilmente raggiungibile e offre una lunga vita di preparazione dei tessuti. Esso consente in termini di tempo esperimenti come indagini farmacologiche o lo studio di codifica feromonale. Con questa tecnica fisiologica, le popolazioni di grandi dimensioni così come precisa sottopopolazioni neuronali possono essere analizzati nello specifico. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato ad approcci immunoistochimica o esperimenti a base di coloranti altri calcio. L&#39;utilizzo di queste metodologie combinate sicuramente permettere l&#39;identificazione di nuovi leganti feromonale per il chemocettori orfano molti espressi nel topo organo vomeronasale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-trifosfato disodico soluzione salina (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Preferenzialmente per immunoistochimica </td></tr><tr><td> Agar (basso punto di fusione) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Preferenzialmente per l&#39;imaging di calcio </td></tr><tr><td> CL-100 bipolare del termoregolatore </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure capra anti-topo IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Riparo dalla luce </td></tr><tr><td> DMSO (dimetilsolfossido) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Incorporare stampi, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescente montaggio di mezzi (Vectashield con DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Riparo dalla luce </td></tr><tr><td> Glisseal N (grasso per vuoto, 60 g) </td><td> Borer Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Grande registrazione camera bagno (RC-26G) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (software per l&#39;imaging di calcio; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonale anti-tubulina, acetilatod topo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Siero normale di capra (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Piattaforma per camere (P-1) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (bottiglia di dosaggio, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line riscaldamento Soluzione / raffreddamento </td><td> Warner Instruments </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Fetta di ancoraggio (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PEN PAP (idrofobopenna) </td><td> Pelco internazionale </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrante lama microtomo VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome ad alta velocità del sistema policromatore </td><td> Visitron Sistemi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane software scientifico </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson e Martin Lüscher feromone usato il termine per la prima volta nel 1959 da 1 a descrivere prodotti chimici usati per la comunicazione intra-specie. I feromoni sono volatili e non volatili di breve durata 2 molecole secrete e / o contenuti nei fluidi biologici 3,4, come ad esempio urina, un liquido noto per essere la principale fonte di feromoni 3. Comunicazione feromonali è implicata in una varietà di modalità di animali fondamentali quali le interazioni 5,6 parenti, organizzazioni gerarchiche 3 e le interazioni sessuali 7,8 e sono quindi direttamente correlata con la sopravvivenza di una data specie 9,10,11. Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall&#39;organo vomeronasale (VNO) 10,12, una struttura abbinato situato alla base della cavità nasale, e racchiusi in una capsula cartilaginea. Ogni VNO ha una forma tubolare con un lume 13,14 che permette il contatto con l&#39;esternomondo della chimica. Il neuroepitelio sensoriale è composta principalmente da vomeronasale neuroni sensoriali bipolari (VSNs) 15. Ogni VSN estende un singolo dendrite al lume che termina con una manopola dendritiche grande cuscinetto fino a 100 microvilli implicati nella individuazione di prodotti chimici 16. Sottopopolazioni numerose VSNs sono presenti. Essi si differenziano per il chemocettrice essi esprimono e quindi probabilmente dal ligando (s) riconoscono 17,18. Due famiglie principali recettori vomeronasale, V1Rs e V2Rs 19,20,21,22, sono composti rispettivamente da 23 e 240 120 24 soci e sono espressi in livelli separati del neuroepitelio. Recettori olfattivi (OR) 25 e recettori formil peptide (FPRs) 26,27 sono anche espressi in VSNs. Se tali sottopopolazioni neuronali utilizzare lo stesso percorso a valle di segnalazione per i feromoni di rilevamento è sconosciuta. Nonostante un ruolo di primo piano svolto da un calcio-permeabile canale (TRPC2) presente nel microvilli di neuroni maturi 28 TRPC2 canali di trasduzione indipendenti sono stati suggeriti 6,29. A causa dell&#39;elevato numero di sottopopolazioni neuronali e la particolare morfologia dell&#39;organo, le indagini farmacologiche e fisiologiche degli elementi di segnalazione presenti nel VNO sono complessi. Qui, presentiamo un acuto preparazione fetta di tessuto del VNO del mouse per l&#39;esecuzione di indagini di imaging di calcio. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche, in un ambiente naturale di un tessuto vivente, di sottopopolazioni generale o individuale di VSNs già caricati con Fura-02:00, un colorante calcio. Questo metodo è anche utile a studiare i GFP-tagged recettore feromone ed è adattabile per l&#39;uso di altre sonde fluorescenti calcio. Come esempio, si usa il mouse: ecco un VG linea 30, in cui è legata la traduzione del recettore feromone V1rb2 l&#39;espressione di GFP da una strategia policistronica. </p&gt;

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall&#39;organo vomeronasale (VNO). Qui, un acuto preparazione fetta di tessuto VNO per eseguire l&#39;imaging calcio è descritto. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche di sottopopolazioni e / o di singoli neuroni in un tessuto vivente ed è comodo per l&#39;identificazione del recettore-ligando.

Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Views.  University of Lausanne. Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall'organo vomeronasale (VNO). Qui, un acuto preparazione fetta di tessuto VNO per eseguire l'imaging calcio è descritto. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche di sottopopolazioni e / o di singoli neuroni in un tessuto vivente ed è comodo per l'identificazione del recettore-ligando.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...