אנו רוצים להודות במיוחד מוניק Nenniger Tosato לקבלת תמיכה טכנית מעולה שלה, כמו גם ז&#39;אן איב Chatton עבור עצות המדעי שלו ואת פלטפורמת CIF הדמיה של UNIL עבור הציוד מיקרוסקופ. המימון ניתן על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. Dissection של העכבר VNO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עכברים בוגרים. כמו פרומון חישה הוא מעורב multimodalities, הבחנה זהירה בין זנים, גנוטיפים, המינים והגילאים חשובה ישפיעו התוצאות. כאן, אנו בוחרים מבוגר בעכברים VG 30 השתמשו בעבר לצורך זיהוי של זוג פרומון קולטן (2-heptanone-V1rb2) 31 (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניתוח, להכין טרי קר נוזל מלאכותי cerebro-השדרה (ACSF; NaCl 118 מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ NaHCO 3, D-גלוקוז 10 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ KCl, MgCl 2 2 מ&quot;מ, לאא 2 PO 4 1.2 מ&quot;מ, CaCl 2 2 מ&quot;מ; pH 7.4) רווי oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). לשם כך, לערבב את כל המרכיבים למעט ACSF CaCl 2. להרוות את הפתרון ישירות על ידי מבעבע עם oxycarbon. בסופו של דבר, להוסיף את 2 CaCl ולהתאים עם DDH 2 0 לנפח הרצוי. שמור את הפתרון ACSF על הקרח עד use. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתת חסד של העכבר צריך להיעשות מעדיפים בדיוק לפני הניסוי על ידי נקע בצוואר הרחם או משאיפת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הראש העכבר. מקום בו תחת מיקרוסקופ הביתור ACSF קר oxycarbonated ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הלסת התחתונה ואת המיקום הראש כדי להמחיש את החיך (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך אופקי בחלק העליון של החיך (איור 1B) במספריים מיקרו להסיר את הקרום החיך עם מלקחיים לנתח מיקרו. מימה ולנקות את חלל חשוף עם ACSF (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור העליון והחלק התחתון של מחיצת האף (איור 1C). בעדינות לחלץ את מחיצת האף המכיל את VNO ולמקם אותו ישירות ACSF על הקרח (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד אנכית את שני החלקים של VNO באמצעות מלקחיים לנתח מיקרו בעדינות להסיר את הקפסולה סחוסי של VNO (איור. 1E). ודא כי כל החלקים סחוסי יוסרו. </li></ol> 2. פרוסה VNO רקמות הכנה פרוסת רקמה VNO הכנה המתואר בסעיף זה 2) הוא בעיקר לחקירות הדמיה סידן. פרוסות VNO יכול לשמש גם עבור immunohistostainings על פרוסות צף לאמת את השלמות המבנית של הרקמה (ראה סעיף 3) לפרוטוקול). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נמוכה ההיתוך אגר (3% ברמת PBS) וכן מקום העבודה שלך. יהיה עליך ACSF, microtome ותומך, מלקחיים לנתח מיקרו, הטמעת תבניות (22 x 22 x 20 מ&quot;מ), מגבונים דיוק, מברשות, תרבות צלחות רקמות, cyanacrylat דבק, קרח, מדחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את התבנית עם הטבעה אגר התכה נמוכה של 3%. ודא כי הטמפרטורה אינה עולה על 41 מעלות צלזיוס לפני הצבת אנכית VNO מחה זמן קצר (איור 2 א) כדי להיות מסוגל לקבל פרוסות העטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית הטבעה על הקרחדקות 1 עד התמצקות ואז נפרד ממנה לחסום את אגר. חותכים את גוש אגר בצורת פירמידה ולמקם אותו עם דבק על התמיכה microtome (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות העטרה VNO עם microtome, עם מהירות של 0.5 מ&quot;מ / s, משרעת של 0.7 מ&quot;מ עובי ו 100 מיקרומטר ACSF קר לאסוף את פרוסות רקמה עם מברשת לפני הכנסתם צלחת רקמה תרבות מלאים קר ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פרוסות שלך מכילים הקרינה אנדוגני כמו GFP (בגן במיקוד נוירונים) אתה יכול לבחור אותם תחת stereomicroscope ניאון (איור 2C). </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה על פרוסות VNO צף מטרת הליך זה היא לוודא את תקינות של פרוסות רקמה VNO שהושג בסעיף 2). טובולין Acetylated, הוא סמן microtubule / cytoskeleton לידי ביטוי דנדריטים של נוירונים microvilli VNO חושית. עבור ניסויים הדמיה סידן, ללכת directly סעיף 4) של הפרוטוקול. השיטה immunohistostaining צף על פרוסות VNO ניתן להתאים הערכה של הביטוי של חלבון כלשהו של עניין. למטרה זו, אנו ממליצים לתקן את VNO עבור 1h ב 4 ° C בתמיסה מקבע (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.6) לאחר הנקודה 1.7) של פרוטוקול ולהשתמש מזה PBS נקודה ב-pH 7.6 מאשר ACSF פתרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת בתרבית רקמה, לתקן את פרוסות העניין שלך בפתרון מקבע (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.6) 1h ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק פרוסות הרקמה לילה בשעה 4 שלך ° C בתמיסה המכילה PBS NGS (עז נורמלי סרום) 10% טריטון X-100 ב -0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות עם הנוגדן הראשוני (אנטי acetylated-טובולין, עכבר, 1:2000) עבור 16h בטמפרטורת החדר (RT) בתמיסה המכילה PBS NGS 5% טריטון X-100 ב% 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות בתמיסת PBS NGS המכיל 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך עם הערוץנוגדן ndary (Cy5-מצומדות עיזים אנטי מאוס, 1:200) בתמיסה המכילה PBS NGS 2% עבור 1h ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBS NGS המכיל 2%, PBS NGS 1% ו-PBS בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פרוסות שלך תקשורתי גובר ניאון (המכיל DAPI או לא) על ידי הצבתם במרכז אזורי מופרד הידרופובי (להשתמש בעט הידרופובי) ולכסות את פרוסות עם coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תצפיות ורכישות עם מיקרוסקופיה confocal ואת תוכנה המאפשרת 3D שחזורים (איור 2D-F). </li></ol> 4. סידן הדמיה על פרוסות VNO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליכים הבאים יתקיימו בחושך. דגירה VNO פרוסות עבור 1h ב 37 ° C בתמיסה טעינת מורכב ACSF קר עם Fura, 02:00 (7 מיקרומטר; פתרון מלאי של 1 מ&quot;מ ב DMSO) ו pluronic 0.1% (w / v; פתרון המניה ב -20% ב DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרו את הפרוסות טעון על הקרח עם oxycarbonation עד לשימוש. פרוסות טעון יכולים להישמר עבור3-4H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות טעון עם מברשת בתא המכיל זלוף ACSF ולשמור את הפרוסות עם עוגן רקמות פרוסה (איור 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא זלוף על הבמה של מיקרוסקופ סידן הדמיה (איור 3B) ומתמשך perfuse עם ACSF oxycarbonated ב RT. טמפרטורה ניתן להתאים את השימוש של בקר טמפרטורה דו קוטבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תצפיות של פרוסות טעון VNO (איור 3C-E) מבוצעים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה, במטרה 25x או 63x ומצלמה מגניב SNAP-HQ. תאורה נעשית ברצף (340/380 ננומטר) עם מכשיר polychromator והקליט בשיעור של 5Hz. פליטת מסוננים נעשית על 510 ננומטר. יחס סידן שינויים תאיים (= ΔF nm/380 340 ננומטר) מנוטרים עם תוכנה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chemostimulation יש לבחור בהתאם לצורך הניסוי שלך. כאן, perfusions של ACSF המכיל מ פרומוןix (isobutylamine, 2-heptanone, 4-heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 M), 2-heptanone (10 -6 M) או שנאספו טרי זכר ונקבה (1: 1) שתן העכבר (1:100) מבוצעות 32. זלוף של ה-ATP (125 מיקרומטר) משמש מבחן הכדאיות בסוף הניסויים (איור 3F) וצריך להצביע על שיעור של כ 80% נוירונים קיימא. בתנאים אלה, פרוסות יכול לשמש עד 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subpopulations GFP-tagged של נוירונים חושיים הם דמיינו ידי תאורה ספציפית (כאן הנוירונים להביע V1rb2) וכן ניתן לנתח במדויק (איור 3G-I). </li></ol> 5. נציג תוצאות: כדי להקים assay פונקציונלי לחקור את התמרה רב המסלולים מתרחש VNO העכבר, או לזהות חדש פרומון קולטן זוגות, אנחנו מנצלים את העכבר VG קו (איור 1A </strong&gt;). בתחום הזה, אחד מתוך 240 רצפטורים V1Rs, הקולטן V1Rb2-GFP הוא מתויג המאפשר הדמיה קל של subpopulation מסוים של נוירונים חושיים vomeronasal. לאחר מיצוי דיסקציה של VNO (איור 1E), אנו מכינים חריפה פרוסות VNO (איור 2C). אנו לתקן חלק מהם, כדי לבדוק ולאמת את תקינות tissular של התכשיר על ידי ביצוע immunohistostainings נגד החלבון טובולין acetylated-(איור 2D-F). שבריר השנייה של פרוסות משמש ניסויים הדמיה סידן. לשם כך, פרוסות נטענים עם Fura, 02:00 (איור 3C-E) ורמת סידן תוך תאי של כל נוירון מנוטר כיחס ΔF (איור 3F). הכדאיות של נוירונים הוא מוערך על ידי טפטוף של ה-ATP (125 מיקרומטר), לאחר עלייה מהירה וחולפת יחס ΔF צפוי (איור 3F). שתן להיות המקור העיקרי של פרומונים, זלוף של טריאסף ly עכבר שתן (1:100) משמש לשלוט אנדוגני. זה מעורר הארעיים סידן כ -50% של נוירונים מוקלט (תא 1 ו -2, איור. 3F). תחת ה-GFP תאורה, V1Rb2 נוירונים החיוביים הם נצפים, ו זלוף של ליגנד המושכת הידוע שלה, 2-heptanone, יוזם הפעלה סלולרית (תא 1, איור. 3I). מעניין, הפעלות נוירונים הם הנצפה גם בשבריר של נוירונים אינם מבטאים את הקולטן V1Rb2 (נוירונים GFP שלילי) (2 תאים, איור. 3I), הוכחת את המורכבות של פרומון קידוד VNO. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection האיבר עכבר vomeronasal. (א) עכבר מקו VG. (ב) לאחר המתת חסד של העכבר, ראש מלא ממוקם תחת מיקרוסקופ המשקפת את הלסת התחתונה מוסרת כדי להמחיש את החיך. חתך אופקי קטן נעשה(קו מקווקו שחור). (ג) לאחר סילוקו של החיך, מחיצת האף מצופה VNO הוא חתך בחלק העליון והחלק התחתון (קווים מקווקווים לבן) כדי להקל על החילוץ VNO. (ד) VNO ממוקמת בפתרון ACSF ומופרד (הכנס: תצוגת כוח עליון של שני החלקים). (ה) הכמוסה סחוסי של VNO מוסר בעדינות, ואת VNO ללא סחוס הקפסולה שלה משמש להמשך הניסויים. ברים סולם הם: BE, 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> 2. איור עכבר vomeronasal הכנה חריפה פרוסה ויושרה tissular. (א) VNO העכבר מוטבע אנכית פתרון אגר 3%. הטמפרטורה של אגר חייב להיות נמוך מ 41 ° C. (ב) לחסום אגר הוא חתך בצורת פירמידה ו 100 מיקרומטר סעיפים VNO (קו מקווקו שחור) נוצרות ACSF. (ג) פרוסות VNO ניתן לבחור תחת stereomicroscope ניאון כדי להמחיש מסויםאוכלוסיה של נוירונים חושיים מתויג. (DF) יושרה Tissular ניתן להעריך על ידי immunohistostainings נגד החלבון טובולין acetylated-, תצוגה של כוח עליון V1rb2 גן במיקוד נוירונים להדגים את שימור מושלם של התכשיר. נוירונים עם דנדריטים הארוכה שלהם להגיע לפני השטח של לומן (E), כמו גם את הביטוי של החלבון המבני הבליטות microvilli הדנדריטים ניתן לצפות (F). ברים סולם הם: B, 5 מ&quot;מ; C, 60 מיקרומטר; ד &#39;, 40 מיקרומטר; EF, 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> 3. איור סידן הדמיה זיהוי פרומון ב vomeronasal פרוסות הרקמה חריפה. (א) לאחר שלב Fura 02:00-loading, פרוסות VNO ממוקמים בתא זלוף ומתוחזקים עם עוגן מותאם (תצוגת מתח גבוה). (ב) ניסויים מבוצעים את פרוסות כהה VNO הם perfused ברציפות ב RT עם ACSF עם מערכת ואקום. הטמפרטורה יכולה להיות chosen באמצעות בקר טמפרטורה המערכת מורכבת על ידי אלמנט דו קוטבית פלטייה ו בדיקה תרמית. ניסוי זה בפרט בוצע ב RT. (CE) פרוסות VNO הם הנצפה תחת בניגוד שלב הופמן (C, HV) או Fura 380 ננומטר תאורה לפני (ד &#39;) במהלך ההפעלה העצבית (E, כאן עם ה-ATP). (F) הכדאיות העצבית מוערך עם טפטוף של ה-ATP (125 מיקרומטר). כאן, chemostimulation נעשה עם שתן (שתן, 1:100) או בתערובת של פרומונים העכבר (ph לערבב., 10 -6 M) בשיעור זרם בלתי פוסק של 165 מ&quot;ל / h. רמות הסידן תאיים (ΔF) ניתן להקליט בנפרד עבור כל תא (Cell 1-3). (G) נוירון V1Rb2 הוא מדמיין תחת GFP תאורה (1). (H) העמסה של זה נוירון (1), כמו גם אי - נוירון V1rb2 להביע (2) מוצג. (אני) נוירון V1rb2 הוא מסוגל להגיב 2-heptanone עם עלייה סידן תוך תאי. זה נוירון מסוים שאינו V1rb2 להביע גם מגיב 2-heptanone (תא 2). ברים סולם הם: CE, 20 מיקרומטר; GH,15 מיקרומטר; ΔF = 340 ננומטר / 380 ננומטר. (F ו-I) משך היישום גירוי מסומן על ידי סורגים תחת כל עקבות. היקף צבע שרירותי מייצג את עוצמת הקרינה.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה סידן השיטה המוצגת כאן מאפשרת להקליט, כהכנה פרוסה חריפה, המושכת את התגובות של נוירונים עכבר VNO. עם גישה זו, דיסקציה מן החיה אל הנוירונים vomeronasal היא, עם קצת תרגול, השגה בקלות ומספק הכנה ארוך רקמה חיה. זה מאפשר זמן רב ניסויים כמו חקירות תרופתי או לימוד של קידוד המושכת. בעזרת טכניקה זו פיזיולוגיים, אוכלוסיות גדולות, כמו גם subpopulations העצבית מדויק ניתן לנתח באופן ספציפי. בנוסף, בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לגישות או ניסויים immunohistochemical המבוססת על צבעים סידן אחרים. השימוש בשיטות אלה בשילוב בוודאי לאפשר זיהוי של ligands המושכת חדש עבור chemoreceptors יתום רבים הביעו באיבר העכבר vomeronasal.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אדנוזין 5&#39;-טריפוספט disodium מלח פתרון (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> אגר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100 גרם </td><td> מועדף עבור אימונוהיסטוכימיה </td></tr><tr><td> אגר (התכה נמוכה) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25 גרם </td><td> מעדיפים הדמיה סידן </td></tr><tr><td> CL-100 דו קוטבית בקר טמפרטורה </td><td> וורנר מכשירים </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 AffiniPure-Anti-IgG עכבר עיזים </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> הגנה מן האור </td></tr><tr><td> DMSO (Sulfoxide דימתיל) </td><td> מרק </td><td> 317,275, 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> הטבעת תבניות, פיל-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פלורסנט הרכבה מדיה (Vectashield עם DAPI, 10 מ&quot;ל) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> הגנה מן האור </td></tr><tr><td> Glisseal N (גריז ואקום, 60 גר &#39;) </td><td> בורר Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> אמבטיה גדולה הקלטה קאמרית (RC-26G) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (תוכנת הדמיה סידן; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron מערכות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חד שבטיים אנטי טובולין, acetylateד נוגדן עכבר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> עז בסרום רגיל (NGS, 10 מ&quot;ל) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמה לתאי (P-1) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 גרם </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> רוטי קול (בקבוק מינון, 10 גר &#39;) </td><td> קרל רוט </td><td> 0,258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 תנור Dual In-line הפתרון / Cooler </td><td> וורנר מכשירים </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> פורסים עוגן (SHD-26GKIT) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> סופר PEN PAP (הידרופוביעט) </td><td> Pelco הבינלאומי </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> רטט להב microtome VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome מהירות גבוהה polychromator מערכת </td><td> Visitron מערכות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D ויזואליזציה נתונים (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane מדעי תוכנה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

פיטר Karlson ומרטין Lüscher השתמשו פרומון המונח לראשונה בשנת 1959 1 לתאר כימיקלים המשמשים לתקשורת תוך מינים. פרומונים הם נדיפים או בלתי נדיף קצרת מולקולות 2 מופרשים ו / או הכלול 3,4 נוזלים ביולוגיים, דוגמת שתן, נוזל ידוע להיות המקור העיקרי של פרומונים 3. תקשורת המושכת הוא מעורב במגוון רחב של שיטות חיה מפתח כגון אינטראקציות 5,6 קרובי משפחה, ארגוני היררכי 3 ואת האינטראקציות המיניות 7,8 ו - וכתוצאה מכך הם בקורלציה ישירה עם להישרדות המין נתון 9,10,11. בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO) 10,12, מבנה לזווג הממוקמת בבסיס של חלל האף, וגם מוקף כמוסת סחוסי. VNO לכל צורה צינורי עם לומן 13,14 המאפשר קשר עם חיצוניעולם כימי. Neuroepithelium חושית מורכבת בעיקר של נוירונים חושיים vomeronasal דו קוטבית (VSNs) 15. VSN כל משתרע דנדריט יחיד לומן שהסתיימו ידית הדנדריטים גדול נושאת עד 100 microvilli מעורב זיהוי כימי 16. Subpopulations רבים של VSNs נוכחים. הם מובחנים על ידי chemoreceptor שהם מבטאים, ובכך ככל הנראה על ידי ליגנד (ים) הם מכירים 17,18. שתי משפחות עיקריות קולטן vomeronasal, V1Rs ו V2Rs 19,20,21,22, מורכבים בהתאמה על ידי 240 23 120 24 חברים באים לידי ביטוי שכבות נפרדות של neuroepithelium. קולטני הריח (מחדרי) 25 ו קולטנים פפטיד formyl (FPRs) 26,27 באים לידי ביטוי גם VSNs. בין אם אלה subpopulations העצבית להשתמש באותו מסלול איתות במורד הזרם עבור פרומונים חישה אינו ידוע. למרות התפקיד המרכזי של ערוץ הסידן חדיר-(TRPC2) נוכח microvilli של נוירונים בוגרים 28 TRPC2 ערוצי התמרה עצמאי הוצעו 6,29. בשל המספר הגבוה של תת עצב את המורפולוגיה המיוחדת של האיבר, חקירות פרמקולוגיות ופיזיולוגיות של אלמנטים איתות נוכח VNO מורכבים. כאן, אנו מציגים רקמות חריפה פרוסה הכנה של VNO העכבר לביצוע הדמיה חקירות סידן. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות בסביבה הטבעית של רקמה חיה, של subpopulations כללית או בודדים של VSNs נטען בעבר עם Fura, 02:00, צבע סידן. שיטה זו היא גם נוח לומד כל קולטן ה-GFP-tagged פרומון ו ניתנת להתאמה לשימוש אחר בדיקות סידן ניאון. כדוגמה, אנו משתמשים כאן עכבר VG קו 30, שבו תרגום של הקולטן פרומון V1rb2 קשורה הביטוי של ה-GFP על ידי אסטרטגיה polycistronic. </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K Views.  University of Lausanne. בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.

Video: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...