著者らは、このプロトコルの彼女の批判的なコメントのためにビクトリアカーペンターに感謝します。

パートI -大人のネッタイシマカ蚊のRNAiによる遺伝子ノックダウン。実験の概要については、 図1を参照してください。 1。 dsRNAの合成<ol><li>関心とコントロールdsRNAの遺伝子に対する特異的dsRNAを合成する。注：私達は3 &#39;特異的cDNA 2の端部と5に接続されたT7プライマー配列を持つ&#39;末端（5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA位置して300から500塩基対の範囲でPCR断片のために開発のプライマーをお勧めしますTAG GG-3 &#39;）。フラグメントの一意性は、BLASTN解析3で確認されるべきである。 </li><li> dsRNAを合成する転写反応のためにT7 RNAポリメラーゼを利用したAmbion社Megascript T7高収率転写キット（Ambion社、試薬のテーブル）を使用します。注：同様の試薬およびキットは、他の利用可能です。 </li><li> dsRNAを精製するために、Megascriptキットとの指示に従って、塩化リチウムを沈殿させる。 </li><li> purificat後イオン、滅菌水でdsRNAペレットを溶解する。マイクロインジェクションのための適切な粘度を確保するために、dsRNAの濃度は2μg/μlを超えないようにしてください。 </li></ol> 2。注射の準備<ol><li>シンプルなマイクロインジェクタは、チューブ、はさみ、金属針、1mlの注射器、および1 mlプラスチックピペットチップ（ 図2を参照）を使用して構築することができます。チューブの長さは〜40 cmにカットする必要があります。また、自動化されたマイクロインジェクタなどドラモンドNanojet II 4として使用することができます。 <ol><li> 2 mlのスケールマークで注射器の先端（針ハブ）をカットし、プランジャーからゴムプランジャーヘッドを取り外します。 </li><li>パンチ穴ゴムプランジャーヘッドに金属針を使用して、針ハブに戻るゴムプランジャーヘッドを配置します。 </li><li>チューブの一端に針ハブを置き、マウスピース（あるいは、10ミリリットルSYとして使用されるもう一方の端に1 mlのプラスチック製のピペットチップを配置ringe）を注入するために必要な空気の圧力を生成するために使用することができます。 </li></ol></li><li>ゴムプランジャーヘッドの穴にガラスキャピラリー針を配置し、幅は液体が流れるように十分大きくなるように針の先端を切る。注意：針先の最適なサイズは経験的に決定する必要があります - 針の幅が大きすぎる場合は、この針の幅が小さすぎる場合、それが浸透することは不可能になり、外傷や高い蚊の死亡率になります蚊外骨格。 </li><li>準備されたdsRNAはサンプル中の水没注射針を、口の部分（またはシリンジ）で液体を吸引することにより、注射針に液体サンプルを描画します。注：この手順は 、in vivo利尿アッセイプロトコルでで使用されているPBS緩衝液（下記参照）を含む蚊に注入されているすべての液体試薬のと同じです。 </li></ol> 3。蚊を収集し、麻酔<ol><li>コレクション1コレクションバイアルに、バッテリ駆動の吸引とT蚊。コレクションバイアルの上にキャップを置き、蚊を麻酔するためにクリーンなCO 2パッドの上に瓶を置きます。注：代わりに蚊が氷の上で麻酔をすることができます。 </li></ol> 4。蚊インジェクション<ol><li>コレクションバイアルを開き、直接CO 2パッドの上に蚊を配置し、蚊が麻酔するまで待ちます。 </li><li>すべての男性を破棄します。 </li><li>注射のための容易なアクセスを可能にするために側に蚊を並べる。 </li><li>怪我を避けるために、脚や翼によって蚊をつかむ。また、蚊を操作するために微細な絵筆や羽を使用することができます。 </li><li>第一蚊を注入する準備ができたら、穏やかに鉗子で胸部の片側をサポートしており、胸郭の反対側（ 図2）に針の先端を挿入します。それはキューティクルの薄い部分に注入して針を押して避けるこ​​とをお勧めします胸郭に深くO。 </li><li>針が配置されたら、蚊に液体を吹く。所望の量は、針で液体のメニスカスを監視することによって決定することができます。特定のボリュームのために必要なミリメートルの数は、ガラスキャピラリー針（πR2時間）のシリンダー容積を計算することによって決定することができます。一般的に注射に使用されるdsRNAの有効量は1μgです。 </li><li>液体蚊に注入されたら、慎重に針を撤回。胸郭の外側に大きな液滴の形態の場合、蚊は捨てられるべきです。その後、次の蚊で、このプロセスを繰り返します。 </li></ol> 5。蚊の回収·貯留<ol><li>注入後、ストレージ用のコンテナに蚊を配置します。たとえば、1パイントワックスはメッシュが段ボール蓋で保護されたカバーで（スープカップ）段ボールカップが並ぶ。蓋が公開するカバーメッシュのカットアウト部を有している。一度すべてのMOsquitoesがコンテナ内に配置され、インキュベーションのための環境制御チャンバー内にコンテナを配置し、そのようなメッシュ被覆の上に置かれ、20％ショ糖に浸した綿球などの食料源、で蚊を提供しています。 in vivoで利尿アッセイを実行する前に、各蚊の水和状態を標準化するために12時間の水源のdsRNA注入蚊を奪う。 </li><li> dsRNAを媒介遺伝子ノックダウンの効率は可変にすることができます。遺伝子サイレンシングは、注入後1日を始めることができ、それは注入後4 6日まで続く可能性があります。最大の遺伝子ノックダウンを達成するために最適な時間は、使用されるすべての遺伝子について実験的に決定する必要があります。我々が進む前に、一般的に、我々は、dsRNAの注射後3日待ってください。 </li></ol>パートII -大人のネッタイシマカ蚊の in vivo利尿アッセイでは 注：このプロトコルは、著者によって開発されたと黄熱病の蚊のネッタイシマカ 1にアクアポリン蛋白質のRNAiによるノックダウンに使用されます。個々の蚊の間でのばらつきを避けるために、蚊は、グループで分析する必要があります。技術的な理由から、我々は、治療ごとに5蚊のグループをお勧めします - 蚊が注射後の尿を排泄し始める前に、最初の体重測定を実行する時間の限られた量があります。 6。蚊を収集し、麻酔<ol><li>蚊のコレクションの前に、分析精度のバランスを使用してキャップを持つ空のコレクションバイアルの重量を記録します。このバイアルは、後続のすべての測定に使用されます。 </li><li>アスピレーターで体重コレクションバイアルに5メスの蚊を収集します。コレクションバイアル上にキャップを置き、蚊を麻酔するのに数秒のためにCO 2パッドの上に座らせて。 </li></ol> 7。初期重量測定<ol><li> tを取る高精度のバランス上のキャップで蚊を含むコレクションバイアルを配置することにより、5蚊の彼の初期重量測定。 </li><li>蚊の体重とキャップを使用してコレクションバイアルを取り出し、キャップを持つ空のコレクションバイアルの重量を差し引いて5蚊の群の重量を計算します。 </li><li>コレクションバイアルを開いて、蚊の体重を記録した後、CO 2のパッドに直接蚊を配置します。蚊は体重測定中に目覚め始めている場合は、それを開いて、パッドの上に蚊を配置する前に数秒間、CO 2パッドの上にバイアルを設定します。 </li></ol> 8。注射の準備<ol><li> RNAiによる遺伝子ノックダウンプロトコルに与えられた指示に従って、マイクロインジェクターを設定します。 </li><li>マイクロインジェクタのガラスキャピラリー針を置き、針の先端を断つように幅がLIQのために十分な大きさです。流れるようにUIDを指定します。 </li><li>水没PBS緩衝液で針と注射針にバッファを描画するには、このプロトコルに使用するため、所望の量は、それぞれの蚊のためにPBSの1.25μlです。注：この量は女性の蚊5で巻き取られる血漿の平均量を模倣しています。 </li></ol> 9。蚊インジェクション<ol><li>マイクロインジェクターで簡単にアクセス可能にするために蚊を並べる。 </li><li>針が配置されたら、蚊にP​​BSバッファを吹く。 </li><li>液体蚊に注入されると、液滴は、胸郭の外側に形成するかもしれません。この液滴は、慎重に次のステップの前に削除する必要があります。 </li><li>次の蚊でこの注入プロセスを繰り返します。経験と、蚊の生存率は、注入後ほぼ100％になります。 </li></ol> 10。計量蚊<ol><li>注入後、穏やかにコレクションバイアルに蚊を配置とキャップ。高精度のバランス上のキャップで蚊を含むコレクションバイアルを配置することにより、5蚊の最初の体重測定を行います。 </li><li>キャップ付き蚊やコレクションバイアルの重量を取ることによって、5蚊の群の重量を計算し、キャップを持つ空のコレクションバイアルの重量を減算します。注：蚊はCO 2麻酔パッドから除去した後、2分以内に尿を排泄し始めるので、それが排 ​​泄を開始する前に体重測定を行うことが重要です。 </li><li>彼らは尿を排泄し始めます小さな容器に蚊を置きます。 </li></ol> 11。二番目以降の体重測定 注：蚊の体重測定が30分間隔で撮影する必要がありますが、これは排泄率に応じて、短いか長い間隔に調整することができます。 <ol><li> 30分後、grouを収集キャップと同じコレクションバイアルにアスピレーターで5蚊のp。高精度のバランス上のキャップで蚊を含むコレクションバイアルを配置することにより、蚊の次の重量測定を取る。 </li><li>測定後、次の30分間、同じ保持容器内の蚊を配置します。 </li><li>目的の時間のために、このプロセスを繰り返します。 </li></ol> 12。決定モスキート排泄率<ol><li> 5蚊の群に注入した液体の総量は、直ちに注入後の重量から蚊の初期重量を差し引くことによって計算することができます。 </li><li>特定の時点で蚊のグループによって排泄された尿の量は、特定の時点での蚊の重量から蚊の初期重量を差し引くことによって計算することができます。 </li><li>特定の時点での排泄率は、配当によって計算することができます。鼎液体注入の合計額（ 表1）ことにより、この時点で排泄される尿の量。 </li></ol> 13。代表的な結果 RNAiによる遺伝子ノックダウンとin vivoでの利尿アッセイでは、ネッタイシマカ蚊利尿におけるアクアポリンの影響を研究するハンセンラボで使用されている。 ネッタイシマカマルピーギ管で表現されている3つのアクアポリンは蚊1を制御するために比較して排泄率に大きな影響をノックダウンした。 図4は、利尿アッセイはネッタイシマカとネッタイイエカの間の排泄率を比較するために使用されている実験の代表的な結果を示しています。異なる温度で。 <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 10蚊EA の RNAi /利尿アッセイのフローチャートを示す。5グループchは、特定の遺伝子のdsRNAを注入されると10蚊の別の5つのグループはコントロールするdsRNAを注入されています。 PBSで200μMHgCl 2で注入された蚊の別のグループは、ポジティブコントロールとして使用されています。これらの蚊は、注射の前に秤量し、3時間30分間隔で注入した後にされています。 <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 RNAiによる遺伝子ノックダウンとin vivoでの利尿アッセイでシンプルなマイクロインジェクション装置。A.ガラスキャピラリー針は注射に使用されます。灰色の三角形は、蚊に注入される液体の量を示すために、針に描かれたミリメートル単位で表します。 B. 1 mlシリンジは、マイクロインジェクタを構築するために使用される。白い三角形は、針ハブを表し、黒三角は、シリンジのプランジャに取り付けられたゴム製のプランジャーヘッドを表しています。 Cにマウスピースを接続するためのチューブインジェクタ。マイクロインジェクション装​​置のマウスピースとして使用されているD. 1ミリリットル使い捨てピペットチップ（ブルーチップ）。 E. ADの部品を組み込んだマイクロインジェクション装置は<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。最適な蚊注射部位。A.女性ネッタイシマカ蚊は、胸部に大きなスケールの間にガラスキャピラリー針で注入した。黒いバーはサイズ比較のために1ミリメートルを示しています。 B.雌の蚊の胸部の描画や白い斑点は、蚊外骨格の白鱗を表しています。注射針が貫通スポット間の蚊は、注入時の死亡率を最小限に抑える必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。温度の影響ネッタイイエカおよびネッタイシマカ利尿 ​​上でトゥーレ。利尿アッセイは、異なる温度で、蚊、 ネッタイシマカおよびネッタイイエカの2種を用いて行った。注入後の最初の時間中に排泄率はパーセントで指定します。 <table border="1"><tbody><tr><td> グループ </td><td> TARA （G） </td><td> 注入されません （G） </td><td> 注入後 （G） </td><td> 1Hポスト噴射 （G） </td><td> 平均重量（mg） </td><td> 量注入 （μL） </td><td> 量が排泄さ （μL） </td><td> ％排泄 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7.5938 </td><td> 7.6057 </td><td> 7.6104 </td><td> 7.6096 </td><td> 2.38 </td><td> 0.94 </td><td> 0.16 </td><td> 17.0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7.8252 </td><td> 7.8349 </td><td> 7.8415 </td><td> 7.8403 </td><td> 1.94 </td><td> 1.32 </td><td> 0.24 </td><td> 18.2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.8896 </td><td> 7.9026 </td><td> 7.9077 </td><td> 7.906 </td><td> 2.6 </td><td> 1.02 </td><td> 0.34 </td><td> 33.3 </td></tr></tbody></table> in vivoでの利尿アッセイの結果表 1。 ネッタイシマカ 。4にネッタイシマカ雌蚊で行わin vivoでの利尿アッセイ ℃から生データ

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. 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我々は、開示することは何もありません。

使用されるRNAiのプロトコルは、カリフォルニア州リバーサイド6,7の大学でアレキサンダーRaikhelの研究室で開発され、GarverとDimopoulos 4で公開プロトコルに似ていました。このビデオプロトコルに示すように、実験的なアプローチは、 生体内の設定での昆虫利尿に関与する遺伝子を研究するために使用することができます。昆虫の排泄器官、マルピーギ細管では、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> MEGAscript T7ハイ·イールド·キット</td><td> Ambion社、（株） </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> PBS緩衝液</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチックチューブ</td><td>ローカルベンダー</td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1ミリリットルのプラスチックピペットチップ</td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td>ブルーチップ</td></tr><tr><td> 1mlの注射器</td><td>ベクトン·ディッキンソンアンドカンパニー</td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ローカルベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属針</td><td>ノースカロライナ州バイオ</td><td> 654307 </TD&gt; <td>サイズ5 </td></tr><tr><td>パッドを飛ぶ</td><td>ジェネシー科学</td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td>バッテリ駆動アスピレーターW /コレクションバイアル</td><td> UPMAラボ</td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td>ファインチップ鉗子</td><td>世界の精密機器</td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー針</td><td>世界の精密機器</td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td>ステレオ解剖顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td>分析精度のバランス</td><td>メトラー·トレド</td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> 1パイントは並んで段ボールカップをワックス</td><td>ローカルベンダー</td><td></td><td>製造スープカップ</td></tr><tr><td>メッシュネット</td><td>ローカルベンダー</td><td></td><td>プラスチック製のフライガーゼ</td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

このビデオプロトコルは、昆虫の特定の遺伝子をノックダウンし、排泄率を測定するための新規バイオアッセイを行うための効果的なテクニックを示しています。このメソッドは、昆虫の利尿のプロセスのより良い理解を得るために使用し、単一血粉内の液体を大量に取ることができます。吸血節足動物における利尿の研究に特に有用であることができます。 in vivoで利尿アッセイと組み合わせることは、このRNAiによる遺伝子ノックダウンは、 ネッタイシマカ蚊利尿1のアクアポリン遺伝子のRNAiによるノックダウンの効果を研究するためにハンセンラボによって開発されました。 プロトコルは、2つの部分のセットアップです。最初のデモでは、単純な蚊噴射装置を構築する方法とRNAiによる遺伝子ノックダウンのために蚊の胸部にdsRNAを準備して注入する方法を示しています。第二デモを決定する方法を示しています。in vivoでのバイオアッセイで使用して蚊の排泄率。

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる<emin vivoでの&gt;</em目的の遺伝子の効果のノックダウンを研究する&gt;利尿アッセイは蚊体液の排泄をしています。

RNAiによる遺伝子ノックダウンと<emインビボで&gt;</em大人の女性の&gt;利尿アッセイ<em&gt;ネッタイシマカ</em&gt;蚊

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.4K ビュー.  New Mexico State University. このプロトコルでは、とRNAiによる遺伝子サイレンシングを組み合わせる利尿アッセイは蚊体液の排泄をしています。

ビデオ: RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

女性A.ネッタイシマカのモスキートへのdsRNAの注射

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

生物学

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

成虫（A. gambiae）におけるRNAiのアッセイのためのプロトコル

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

マウスにおける急速な非侵襲腰椎髄腔内注射を経由して生体内 siRNAトランスフェクションと脊髄における遺伝子ノックダウン

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

ネッタイシマカ蚊ボルバキアに感染維持

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...