このプロトコルはペットによってセルおよびジルコニウム89-DBNおよび非侵襲的な追跡のradiolabelingのための段階的な方法を記述する。また、この技術は、細胞表面タンパク質の主要な手段にジルコニウム-89-DBNを共有結合させることにより、細胞を放射性標識するための信頼性が高く安定した方法を提供します。神経疾患やさまざまながんの細胞療法に携わる医師や科学者は、このプロトコルが、非侵襲的PETイメージングによる細胞ベースの治療の薬物動態を理解するのに役立つことに気付くでしょう。
詳細なプロトコルは、この放射性標識技術を学び、採用するためのガイダンスを新規ユーザーに提供します。重要な手順に含まれる追加のノードは、新しいユーザーの問題のトラブルシューティングに役立ちます。まず、約100ミリグラムのヒドロキサメート樹脂を含むカラムを調製し、8ミリリットルの純粋な無水アセトニトリルでカラムを洗浄した後、5〜6ミリリットルの空気でフラッシュして活性化します。
2ミリリットルの0.5ノルマル塩酸をカラムに通します。5〜6ミリリットルの空気をさらに洗浄した後、ジルコニウム-89と天然イットリウムの両方を含む溶液をヒドロキサメート樹脂にゆっくりとロードします。ヒドロキサメート樹脂から結合していない天然イットリウムを20ミリリットルの2つの通常の塩酸で洗浄し、続いて10ミリリットルの脱イオン水で洗浄します。
リン酸ジルコニウム-89水素の形態のジルコニウムを除去するには、0.5ミリリットルの1.2モルリン酸二カリウムリン酸カリウムリン酸二水素カリウム緩衝液をカラムに添加し、カラム上に30分間放置します。さらに 1.5 ミリリットルの 1.2 モルバッファーを添加して、カラムからジルコニウムを溶出します。次に、緩衝液に配合された約120マイクロリットルのリン酸ジルコニウム-89水素を取り、HEPES-KOHと炭酸カリウムで溶液を中和してpH7.528にします。
新たに調製した5ミリモルのDFO-Bn-NCSを4マイクロリットル、中和したリン酸ジルコニウム-89水素約285マイクロリットルに加えます。そして、ピペッティングで溶液を混合します。イットリウムからジルコニウムを単離した後、0.5ミリリットルの1モルシュウ酸をカラムに加え、カラム上に1分間置いて、ジルコニウム-89シュウ酸の形でジルコニウムを溶出させます。
さらに2.5ミリリットルの1モルシュウ酸をカラムに加えます。シュウ酸ジルコニウム89を塩化ジルコニウム89に変換するには、陰イオン交換カラムを6ミリリットルのアセトニトリルで洗浄し、続いて5〜6ミリリットルの空気でフラッシュします。次に、カラムを10ミリリットルの生理食塩水で洗浄し、続いてもう一度空気を洗い流します。
シュウ酸ジルコニウム-89を含む溶液を活性化陰イオン交換カラムにゆっくりとロードしてから、空気で再洗浄します。次に、カラムを50ミリリットルの脱イオン水で洗浄し、結合していないシュウ酸イオンを除去します。塩化ジルコニウム-89の形態のジルコニウムを逃がすには、0.1ミリリットルのノルマル塩酸をカラムに添加し、カラム上に1分間放置します。
さらに 0.4 ミリリットルのノルマル塩酸 1 個でカラムからジルコニウムを溶出します。窒素ガスの安定した流れの下で摂氏65度の加熱ブロックに10〜30分間入れて、V字型バイアルで乾燥させた塩化ジルコニウム89を乾燥させ、乾燥した塩化ジルコニウム89を水中で再構成します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに500マイクロリットルのHEPES緩衝HBSSを入れた約600万個の細胞を含む500マイクロリットルの細胞懸濁液を調製し、約100マイクロリットルの調合ジルコニウム-89-DBNを添加します。
ジルコニウム-89-DBNと細胞懸濁液を、マイクロピペットで溶液を静かに上下にピペッティングして混合します。細胞とジルコニウム-89-DBN混合物をシェーカー上で、摂氏25〜37度で約550RPMで30〜45分間インキュベートし、細胞標識を行います。新たに調製した放射性TLC溶媒を用いて、細胞の放射性標識反応に対して放射性TLCを実行します。
パーセンテージでパーセントを計算しますtag画面に示されている式を使用して、Rfが0.01から0.02に等しい。別の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで、約100マイクロリットルの調合ジルコニウム-89-DBNと約500マイクロリットルのHEPES緩衝HBSSを混合し、バックグラウンド補正用の無細胞コントロールとして使用します。画面に示された式を使用して、Rfが0.01〜0.02に等しいときの放射能の割合を計算し、計算された2つの放射能率を差し引いて、有効な細胞放射性標識を計算します。
放射性標識の完了を確認した後、600マイクロリットルの冷却した細胞に適した完全培地を添加して、放射性標識反応のクエンチングを行う。細胞を96Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。そして上澄みを捨てます。
ペレット化した細胞を500マイクロリットルの冷やした培地に、マイクロピペットで培地を上下にピペッティングして静かに再懸濁します。細胞を摂氏4度で10分間96Gで遠心分離し、上清を廃棄します。次に、画面に示された式を使用して、すべての洗浄後の最終的な放射性標識効率を計算します。
放射性標識細胞の品質を確保するために、放射性標識細胞の最終懸濁液を目視検査し、凝集塊が存在しない場合は、放射性標識および洗浄ステップの1時間以内にPBSで調製した0.4%トリパンブルー溶液を使用してトリパンブルー排除生存率試験を実施します。ジルコニウム-89リン酸水素と塩化ジルコニウム-89を使用したジルコニウム-89のDFO-Bn-NCSのキレート化効率は、放射性TLCで測定すると異なります。ジルコニウム-89で放射性標識したさまざまな細胞の7日間にわたる安定性をここに示します。
放射性標識細胞によるジルコニウム-89放射能の保持は、研究したすべての細胞で安定しており、標識後7日間で観察された排出はごくわずかであることがわかりました。ジルコニウム-89-DBNを用いたさまざまな細胞タイプにおける細胞放射性標識効率をこの表に示します。細胞の放射性標識効率は、洗浄後の放射性標識細胞ペレットで観察される未補正収率として20〜50%まで変化します。
このプロトコルの最も重要なステップは、キレート化混合物へのDFO-Bn-NCSの添加と放射性標識細胞の品質評価です。この技術の応用は、細胞ベースの治療の薬物動態を理解するのに役立ちます。また、細胞療法のクリアランスプロファイルを変更する臨床的必要性についても疑問が生じます。
