著者らは、慎重に原稿を見直すためのWJルーニーを認める。

肺結核が疑われるすべての患者は細菌検査のために少なくとも二つの喀痰検体を提出しなければならないことが結核医療状態の国際規格の標準的な2。痰が最 ​​も高い収率がこの時点で収集された可能な場合には、少なくとも一つの早朝の標本が得られなければならない11 XpertのMTB / RIFアッセイがある誘導または喀出痰から調製された痰のサンプルや濃縮された痰の堆積物に適用することができます正または負の抗酸菌（AFB）塗抹標本は、6、12、13アッセイを持っている結核の臨床上の疑いがある誰のために患者からの検体の使用を意図しています。1、2）抗結核療法を受けていない）&lt;7治療の日、または3）過去60日以内に治療を受けていないていました。それは細菌のDNAは、抗菌薬治療後に持続する可能性があるため、薬物療法7の影響を監視するために使用すべきではないことに注意してください。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;などの感染性病原体を送信することができる場合に使用されるカートリッジを含む臨床検体を、扱います。適切なこのような保護使い捨ての手袋を着用などの予防措置、実験室のコートと眼用保護具を使用して、あなたの機関の安全手順とガイドラインに従ってください。 1。喀痰サンプル 注：テストを実行できるGeneXpert DXシステムモジュールがあるので一度だけ多くの標本としてプロセス、！ <ol><li>対応する検体IDを持つ各XpertのMTB / RIFカートリッジにラベルを付けます。 </li><li>転送1.0mlを滅菌ピペットを用いて円錐形、スクリューキャップチューブに痰を喀出。また、全体の標本は、元のリークプルーフ痰の収集容器内に処理されることがあります。 </li><li>滅菌ピペットを用いて喀痰に、2.0ミリリットルXpertのMTB / RIFサンプル試薬（V / V 2:1）を追加します。 </li><li>蓋を交換し、10秒間激しくチューブを振る-20時間。また、混合物（30秒）ボルテックスすることができます。 </li><li>チューブを室温で5分間直立することができます。 </li><li>精力的に10〜20倍管を横に振る。また、渦（30秒）を使用します。 </li><li>チューブを室温でさらに10分間直立することができます。 </li><li>標本を検査します。サンプルは痰の目に見える塊で液化する必要があります。 </li></ol> 2。濃縮された堆積物 注：テストを実行する可能GeneXpert DXシステムモジュールがあるので一度だけ多くの標本としてプロセス！ <ol><li>対応する検体IDを持つ各XpertのMTB / RIFカートリッジにラベルを付けます。 </li><li>滅菌ピペットを用いて円錐形、スクリューキャップチューブに1.5ミリリットルXpertのMTB / RIFサンプル試薬を転送します。 </li><li>滅菌ピペットを使用したサンプル用試薬を含むチューブに少なくとも0.5ミリリットルの濃堆積物を追加します。 </li><li>蓋を取り付けて、チューブvを振るigorously 10〜20倍。また、渦（30秒）を使用します。 </li><li>チューブを室温で5分間直立することができます。 </li><li>精力的に10〜20倍管を横に振る。また、渦（30秒）を使用します。 </li><li>チューブを室温でさらに10分間直立することができます。 </li><li>標本を検査します。サンプルは痰の目に見える塊で液化する必要があります。 </li></ol> 3。 XpertのMTB / RIFカートリッジのロード 注：カートリッジにサンプルを追加して30分以内にテストを開始します！ <ol><li> XpertのMTB / RIFカートリッジと検体IDのラベルを確認してください。 </li><li>カートリッジのふたを開きます。 </li><li>提供滅菌ピペットを用いて、メニスカスが最小マークの上になるまで、ピペットに液化した試料を吸引し、XpertのMTB / RIFカートリッジの開いているポートにサンプルを転送します。 </li></ol> 注：エアロゾル形成のリスクを最小限に抑えるために徐々に分配する！ <ol start="4"><li>カートリッジのふたを閉じます。 </li></ol> 4。テストを開始 注：テストを開始する前に、GeneXpert DXシステムはGX2.1ソフトウェアが装備されていることを確認し、XpertのMTB / RIFアッセイは、ソフトウェアにインポートされた9に ！ <ol><li>コンピュータの電源をオンにし、GeneXpert Dxの機器の電源をオンにします。 </li><li> Windowsデスクトップで、GeneXpert Dxのショートカットアイコンをダブルクリックします。 </li><li>あなたのユーザ名とパスワードを使用してGeneXpert DXシステムソフトウェアにログオンします。 </li><li> GeneXpert DXシステム]ウィンドウで、 テストを作成]をクリックします。 スキャンカートリッジのバーコードのダイアログボックスが表示されます。 </li><li> サンプルID]ボックスで 、スキャンまたはサンプルIDを入力します。 </li><li> XpertのMTB / RIFカートリッジ上のバーコードをスキャンします。 作成テスト]ウィンドウが表示されます。 </li><li> テストの開始]をクリックします </強い&gt;と表示されるダイアログボックスでパスワードを入力します。 </li><li>点滅する緑色の光のインストゥルメント·モジュールのドアを開き、カートリッジをロードします。 </li><li>ドアを閉じます。テストが開始され、光の点滅が停止し、常に緑のままです。テストが終了すると、ランプが消灯します。 </li><li>システムが実行の終了時にドアロックを解放するまで待機し、モジュールのドアを開け、カートリッジを取り外します。 </li><li>あなたの機関の標準的な慣行に従って、適切な廃棄容器に使用済みカートリッジを廃棄してください。 </li></ol> 5。代表的な結果各XpertのMTB / RIFカートリッジはMTB複雑でRIF耐性の検出と同様に標的細菌の適切な処理のために制御し、PCR反応において阻害剤の存在下（s）を監視するためのサンプル処理制御（SPC）のための試薬が含まれています。プローブ·チェック·コントロール（PCC）は、試薬の再水和に充填PCRチューブを検証カートリッジは、プローブの整合性、および染料の安定性。XpertのMTB / RIFアッセイで9プライマーは81塩基対の&quot;コア&quot;領域を含むrpoB遺伝子の一部を増幅する。分子ビーコンと呼ばれる5つ異なる色の蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブは、全体の81-bpのコアを尋問する14の各分子ビーコンは、標的配列は、野生型rpoBと異なる場合、そのターゲットにバインドしないように特定するように設計されました一塩基置換のように少しずつ順序。彼らが彼らの目標、すなわち、野生型rpoB配列にバインドされている唯一の分子ビーコン蛍光ので、検定の5つの色のいずれかの不在は、関連付けられているコア領域に保存された野生型配列と変異を区別するRIF耐性6。 SPCは、負のサンプルで陽性であるべきであり、正のサンプルで正または負の値となります。テストSPCは、負のテストで検出されない場合、結果は &quot;無効&quot;になります。 PCR反応の開始前に、GeneXpert DXシステムは、ビーズ水分補給、反応管充填、プローブの整合性と染料の安定性を監視するためのプローブからの蛍光シグナルを測定します。プローブからの蛍光シグナルは、割り当てられた受入基準を満たしている場合、PCCを渡します。以下に示すような結果は、測定した蛍光信号と埋め込 ​​まれた計算アルゴリズムからGeneXpert DXシステムによって解釈され、 ビューの結果ウィンドウ9に表示されます。 MTBが検出されました：MTB、標的DNAが検出され、両方のコントロールを、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。低いCt値はDNAテンプレートの高い出発濃度を表しています。高いCt値はDNAテンプレートの低濃度を表しています。 MTB検出結果では、 &quot;RIF耐性が検出されました&quot;（ 図1A）、（ &quot;RIF耐性が検出されません。&quot; <strオング&gt;図1B）、または&quot;RIF耐性不定&quot;は別々の行に表示されます。 MTBが検出されない：MTB、標的DNAが検出されていません。両方のコントロール、SPCとPCC、割り当てられた受入基準（ 図2）を満たす。 無効：MTBの有無を決定することはできません：SPCは、受入基準を満たしていない場合、すなわち、サンプルが適切に処理されていないか、またはPCRが阻害された（ 図3）。注：余分な検体を再検査！ エラー：失敗したPCCの結果（FAIL）の1つ以上の。 MTBとSPCの両方は結果が表示されません。注：余分な検体を再検査！ PCCは（PASS）渡された場合は、エラーはシステムコンポーネントの障害によって引き起こされます。 図1：MTB標的DNAが検出され、両方のコントロール、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。低いCt値が高いの開始を表すDNAテンプレートの濃度、より高いCt値はDNAテンプレートの低濃度を表しています。 MTB検出結果に&quot;不定RIF抵抗&quot;、 &quot;RIF耐性が検出されない&quot;（ 図1A）、 &quot;RIF耐性が検出されました&quot;（ 図1B）、または別の行に表示されます。 <img alt="図1A" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" /> 図1A MTB検出されました。RIF耐性が検出されません、rpoB遺伝子の81 bpのRIF耐性決定領域（RRDR）が存在していたのIEのみ野生型核酸配列6。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図1B" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" /> 図1B MTB検出されました。RIF耐性が検出されました。ポジションをカバーする、プローブB（矢印）のドロップアウトが完了Rの513から517<html> rpoB遺伝子のRDR。例6は、部分的なシーケンスは、rpoB遺伝子変異D516Vが検出されたことを明らかにした。8は <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" /> 図2 MTBのターゲットDNAが検出されませんでした;両方のコントロールを、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" /> サンプルが正常に処理されていないため、SPCは、受入基準を満たしていない場合、またはPCRが阻害されているため。MTBの図3に無効な試験の結果、すなわち有無を決定することはできません。3547fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

<ol>
	<li>Sudre, P., Dam, t. e. n., Chan, G., C, A., Kochi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis+in+the+present+time:+a+global+overview+of+the+tuberculosis+situation.">Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation.</a> World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).</li><li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tuberculosis+control:+epidemiology,+strategy,+financing.">Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing.</a> WHO report 2010. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The global plan to stop TB, 2006-2015. , (2006).</li><li>Morris, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+multiple+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Infect. Dis. 171, 954-960 (1995).</li><li>Traore, H., Fissette, K., Bastian, I., Devleeschouwer, M., Portaels, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rifampicin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+isolates+from+diverse+countries+by+a+commercial+line+probe+assay+as+aninitial+indicator+of+multidrug+resistance.">Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as aninitial indicator of multidrug resistance.</a> Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4, 481-484 (2000).</li><li>Helb, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Rifampin+Resistance+by+Use+of+On-Demand+Near-Patient+Technology.">Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand Near-Patient Technology.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 229-237 (2010).</li><li>Blakemore, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Analytical+Performance+of+the+Xpert+MTB/RIF.">Evaluation of the Analytical Performance of the Xpert MTB/RIF.</a> Assay. J. Clin. Microbiol. 48, 2495-2501 (2010).</li><li>Telenti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rifampicin-resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Detection of rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis.</a> Lancet. 341, 647-650 (1993).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneXpert Dx System Operator Manual. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Standards for Tuberculosis Care (ISTC). , (2009).</li><li>Boehme, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Molecular+Detection+of+Tuberculosis+and+Rifampin+Resistance.">Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).</li><li>Marlowe, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Cepheid+Xpert+MTB/RIF+assay+for+the+Direct+Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+Complex+from+Respiratory+Specimens.">Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for the Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory Specimens.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1621-1623 (2011).</li><li>El-Hajj, H. H., Marras, S. A. M., Tyagi, S., Kramer, F. R., Alland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+single+tube+with+molecular+beacons.">Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).</li><li>Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+extrapulmonary+tuberculosis+by+automated+GeneXpert+MTB/RIF+system.">Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

XpertのMTB / RIFアッセイは、サンプルの汚染除去、ハンズフリー操作、サンプル処理のオンボード、どちらの喀痰または濃縮された堆積物中の、単一のMTBとRIF抵抗の同時検出のための超高感度半nested PCR法を統合し、システムを使用して簡単にできます。検出のアッセイの分析限界は、痰の131 CFU / mlであることが判明した。Ct値とMTBの細胞数の間に6対数線形関係が存在するCFU / mlの喀痰10月7日から2月 10日までに当てはまります。臨床的に関連MTB濃度は、すべてのアッセイの直線範囲内に収まるように、アッセイは細菌負荷の半定量的な見積もりを提供しています。7アッセイは、唯一の中等度の実験室インフラストラクチャとトレーニングが必要になります。検出限界は、従来の顕微鏡に比べて少なくとも2桁低く位置しています。6特異性が優れています。また、RIF-resistanの同時検出トンMTBは、薬剤耐性結核の時代におけるポイントオブケア検査の設定で重要な利点です。3 臨床の設定があり、肺結核を診断するためのアッセイのパフォーマンスに限られて公開されているデータを最新の状態に12;。文化と比較した場合、13が疑われる肺結核患者の喀痰中の検出MTBのXpertのMTB / RIFアッセイの全体的な臨床的感度は97.6％であったリファレンスとして。と1462人の患者の合計これらの5つの研究サイトを（;バクー、アゼルバイジャン;ケープタウン＆ダーバン、南アフリカ、インドのムンバイリマ、ペルー）が関与してプロスペクティブ多施設共同研究の結果であった。研究対象集団の文化で確認されたTBの全体的なプレテストの確率は50.7％であった。感度は塗抹および培養陽性例のための99.8パーセントと塗抹陰性、培養陽性の場合の90.2パーセントであった。で98.4パーセントと比較して結核とHIV陽性の患者のうち、MTB / RIF検査の感度は、93.9％であったHIV-陰性患者低い結核罹患率の設定では12の文化と比較すると、MTBを検出するための全体的な合意は89％であった。感度は、それぞれ、塗抹陰性検体の塗抹陽性、72％が98％であった、と特異性は良好であった13未治療の喀痰と濃縮された堆積物のそれらのテストの間に感受性の有意差は認められなかった。211例（99.1％感度）209とで同じ調査では12、MTB / RIFテストが正しく検出されたRIF耐性シーケンシングの結果を考慮したRIF感受性を持つすべての506例（100％の特異性）、12作者は、調査結果はに可能性があることを示唆し、ケースの検出、およびRIF耐性の差別、両方のパフォーマンスは、様々なサイト間で同様のことがわかった広く適用可能である。さらに12は 、気管支肺胞洗浄および気管支などの痰以外の呼吸器検体の濃縮された堆積物、lの分泌物は、匹敵する感度と特異度でテストされています。アッセイのパフォーマンスに13データ肺外結核のテストを浮上している15。 グローバルな結核対策は早急に迅速な新しい結核患者の診断とユニバーサル·アクセス·ポイント·オブ·ケアの設定でRIF耐性MTBの検出を可能にする効果的なツールを必要とします。MTBを検出するために使用される3現在の核酸増幅方法は、労働集約的な、複雑であり、技術的に厳しい。 XpertのMTB / RIFアッセイは、彼らはそれを余裕ができるようになることを提供、これらの設定に結核と薬剤耐性の両方の標準化され、敏感な、非常に特定の診断テストをもたらす可能性があります。アクセスを容易にするために、革新的な新しい診断のための財団は、（FIND）XpertのMTB / RIFテストのために大幅な価格引き下げを交渉しています。現在のFIND-ネゴシエートされた価格は、割引の対象国のリストと共に、Web上で利用可能な10 </suP&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> XpertのMTB / RIFテスト</td><td>ケフェウス型変光星</td><td> GXMTB/RIF-10 </td></tr><tr><td>転送ピペット</td><td>ザルスタット</td><td> 86.1172.001 </td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15ミリリットル、120×17ミリメートル、PS </td><td>ザルスタット</td><td> 62.553.542 </td></tr></tbody></table>

diagnosing pulmonary tuberculosis with the xpert mtb/rif test

結核菌 （MTB）による結核（TB）は、公衆衛生上の大きな問題のままです。感染症は世界人口の1の3分の1にまで影響し、約200万人が毎年結核によって殺されている高品質の2ユニバーサルアクセスできます。 、すべての結核患者のための患者中心の治療はストップ結核戦略WHOのによって強調されています。3信頼性の高い薬剤耐性検査の結果に基づいて呼吸器検体と薬物療法でMTBの迅速な検出は、この戦略の実装を成功させるための前提条件です。しかし、世界の多くの分野では、結核の診断はまだ小文字を区別しない、不十分な標準化された喀痰顕微鏡検査の方法に依存しています。無効な結核の検出と薬剤耐性MTB株の出現と伝送ますますグローバル化する結核対策活動を危険にさらす2。 地球規模で - - スタンドの肺結核の効果的な診断は、可用性を必要とする、ardized使いやすい、このようなリファンピシン（RIF）などの主要な抗生物質にMTB複雑と抵抗の両方の直接検出を可能にするであろう強力な診断ツールを使用します。後者の結果は多剤耐性MTB（MDR結核）のためのマーカーとして機能することができ、信頼性の高い試験結果の迅速な可用性&gt; MDR-TBの分離株の95％4、図5に報告されていると、直接音患者管理につながる可能性がある最終的に、個々の患者を治すため、地域社会における結核感染の連鎖が破壊され、意思決定2。 セファイドの（サニーベール、カリフォルニア州、米国）XpertのMTB / RIFアッセイ6、7は顕著な方法で上記の要求を満たしています。それ）が喀痰または濃縮された痰の堆積物中のMTB複雑なDNAの検出1の核酸核酸増幅検査であり、2）rpoB遺伝子のRIF耐性関連変異の検出8これは、セファイドのGeneXpert DXで使用するために設計されています。システム番目で、サンプルの処理、核酸増幅、リアルタイムPCR、逆転写酵素PCRを使用して、ターゲット配列の検出を統合し自動化します。システムテストを実行して結果を表示するための器具、パーソナルコンピュータ、バーコードスキャナ、およびプリロード済みソフトウェアで構成されています。9それは、PCR試薬を保持し、PCRプロセスをホストする単回使用の使い捨てXpertのMTB / RIFカートリッジを採用しています。カートリッジは自己完結型であるため、サンプル間のクロスコンタミネーションが除去されます。MTBを検出するために使用される6現在の核酸増幅方法は、複雑な労働集約的、技術的に厳しいです。 XpertのMTB / RIFアッセイは、彼らはそれを余裕ができるようになることを条件として、ユニバーサル·アクセス·ポイント·オブ·ケアの設定を3に結核と薬剤耐性の両方について、標準化された敏感な、非常に特定の診断テストをもたらす可能性を秘めています。アクセスを容易にするために、革新的な新しい診断のための財団は、（FIND）signifiを交渉していますカント価格引き下げ。現在のFIND-ネゴシエートされた価格は、割引の対象国のリストと共に、Web上で利用可能な10

Watch this Scientific Journal Video about Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test at JoVE.com

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

XpertのMTB / RIFのテストは、サンプルの汚染除去、ハンズフリー操作、サンプル処理のオンボードとの同時検出のための超高感度半nested PCR法を統合<em&gt;結核</em約2時間の喀痰または濃縮された喀痰の堆積物のいずれか&gt;とリファンピシン耐性、、。テストが標準化されているだけ適度な実験室インフラストラクチャとトレーニングが必要になります。

XpertのMTB / RIFのテストで肺結核の診断

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

79.8K ビュー.  University of Bern. XpertのMTB / RIFのテストは、サンプルの汚染除去、ハンズフリー操作、サンプル処理のオンボードとの同時検出のための超高感度半nested PCR法を統合結核とリファンピシン耐性、、。テストが標準化されているだけ適度な実験室インフラストラクチャとトレーニングが必要になります。

ビデオ: Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

の成長結核バイオフィルム

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

免疫・感染学

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...