Die Autoren danken der WJ Looney sorgfältig für die Durchsicht des Manuskriptes.

Standard 2 von den Internationalen Standards für Tuberkulose Pflege besagt, dass alle Patienten mit Verdacht auf Lungen-TB mindestens zwei Sputum Proben zur bakteriologischen Untersuchung vorlegen sollte. Wenn möglich, sollte mindestens ein Early-Morning-Probe erhalten werden, wie Sputum in dieser Zeit gesammelt hat den höchsten Ertrag. 11. Der Xpert MTB / RIF-Test auf Sputum-Proben oder konzentrierten Sedimenten aus Sputum oder induzierten Sputum ausgehustet werden, die bereit sind, angewendet werden kann . entweder säurefesten Bazillen (AFB) Abstrich positiv oder negativ 6, 12, 13 Der Test ist für den Gebrauch mit Proben von Patienten, für die es klinischem Verdacht auf Lungen-TB, die haben bestimmt: 1) nicht empfangen Anti-Tuberkulose-Therapie, 2 ) hatte &lt;7 Tagen nach der Therapie, oder 3) haben keine Therapie in den letzten 60 Tagen erhalten haben. Sie beachten, dass es nicht zur Überwachung der Auswirkungen der medikamentösen Therapie 7, weil bakterielle DNA nach antimikrobieller Therapie weiterhin verwendet werden könnten. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Behandle klinischen Proben, einschließlich der verwendeten Patronen, als potentiell infektiös zu behandeln. Verwenden Sie die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Schutzkleidung Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrillen, und folgen Sie Ihrer Institution Sicherheit Verfahren und Richtlinien. 1. Sputum Proben Hinweis: Prozess nur so viele Proben auf einmal, denn es gibt GeneXpert DX-System-Module zur Verfügung, um den Test laufen! <ol><li> Beschriften Sie jede Xpert MTB / RIF-Patrone mit der entsprechenden ID-Probe. </li><li> Transfer 1.0 ml Sputum zu einer konischen, Röhrchen mit Schraubverschluss mit einem sterilen Transferpipette. Alternativ kann die gesamte Probe in der ursprünglichen dicht Sputum Sammelbehälter verarbeitet werden. </li><li> Fügen Sie 2,0 ml Xpert MTB / RIF Probe-Reagenz (2:1; v / v) auf die Sputum mit einer sterilen Transferpipette. </li><li> Setzen Sie den Deckel, und schütteln Sie das Röhrchen kräftig 10-20 Mal. Alternativ kann die Mischung verwirbelt (30 sec). </li><li> Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schütteln Sie das Röhrchen kräftig 10-20 mal. Alternativ können Sie auch einen Wirbel (30 sec). </li><li> Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für weitere 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überprüfen Sie die Proben: Proben sollten ohne sichtbare Klumpen von Sputum verflüssigt werden. </li></ol> 2. Konzentrierte Sedimente Hinweis: Prozess nur so viele Proben auf einmal, wie es GeneXpert DX-System-Module zur Verfügung, um die Tests laufen! <ol><li> Beschriften Sie jede Xpert MTB / RIF-Patrone mit der entsprechenden ID-Probe. </li><li> Übertragen Sie 1,5 ml Xpert MTB / RIF Probe-Reagenz zu einer konischen, Röhrchen mit Schraubverschluss mit einem sterilen Transferpipette. </li><li> Fügen Sie mindestens 0,5 ml konzentrierte Sediment zum Beispiel Reagenz, das Rohr mit einer sterilen Transferpipette. </li><li> Setzen Sie den Deckel, und schütteln Sie die Röhre vigorously 10-20 mal. Alternativ können Sie auch einen Wirbel (30 sec). </li><li> Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Schütteln Sie das Röhrchen kräftig 10-20 mal. Alternativ können Sie auch einen Wirbel (30 sec). </li><li> Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für weitere 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überprüfen Sie die Proben: Proben sollten ohne sichtbare Klumpen von Sputum verflüssigt werden. </li></ol> 3. Das Laden des Xpert MTB / RIF-Cartridge Hinweis: Starten Sie den Test innerhalb von 30 Minuten Zugabe der Probe in der Patrone! <ol><li> Prüfen Sie die Etiketten auf der Xpert MTB / RIF-Kartusche und der Probe-ID. </li><li> Öffnen Sie die Patrone Deckel. </li><li> Mit dem sterilen Transferpipette vorgesehen, saugen Sie den verflüssigten Probe in die Pipette, bis der Meniskus ist über der Mindestpunktzahl und übertragen Sie die Probe in den offenen Port des Xpert MTB / RIF-Patrone. </li></ol> Hinweis:Dosiernadel langsam, um das Risiko der Bildung von Aerosolen zu minimieren! <ol start="4"><li> Schließen Sie die Patrone Deckel. </li></ol> 4. Starten des Tests Hinweis: Bevor Sie den Test, sicherzustellen, dass die GeneXpert DX-System mit dem GX2.1 Software ausgestattet, und der Xpert MTB / RIF-Test wird in die Software importiert 9! <ol><li> Schalten Sie den Computer und dann auf der GeneXpert Dx Instrument ein. </li><li> Auf dem Windows-Desktop, doppelklicken Sie auf das GeneXpert Dx Shortcut-Symbol. </li><li> Melden Sie sich am GeneXpert DX-System-Software mit Ihrem Benutzernamen und Passwort an. </li><li> In der DX-System GeneXpert Fenster klicken Sie auf Test erstellen. Die Scan-Cartridge Barcode-Dialogbox erscheint. </li><li> Im Sample-Feld ID scannen oder geben Sie den Proben-ID. </li><li> Scannen Sie den Barcode auf dem Xpert MTB / RIF-Patrone. Der Test erstellen wird angezeigt. </li><li> Klicken Sie auf Test starten </strong&gt;, und geben Sie Ihr Kennwort in das Dialogfeld, das angezeigt. </li><li> Öffnen Sie das Gerät mit dem Modul Tür blinkendes grünes Licht, und laden Sie die Patrone. </li><li> Schließen Sie die Tür. Der Test beginnt und das Licht aufhört zu blinken und ständig grün. Wenn der Test abgeschlossen ist, schaltet sich das Licht aus. </li><li> Warten Sie, bis das System löst das Türschloss am Ende des Laufes, öffnen Sie dann das Modul Tür und entfernen Sie die Patrone. </li><li> Entsorgen Sie verbrauchte Patronen in den entsprechenden Abfallbehältern nach Ihrer Institution üblichen Verfahren. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Jeder Xpert MTB / RIF Patrone Reagenzien zum Nachweis der MTB-Komplex und RIF Beständigkeit sowie einer Probe Prozesskontrolle (SPC) für eine angemessene Verarbeitung der Target-Bakterien zu kontrollieren und die Gegenwart von Inhibitor (en) in der PCR-Reaktion zu überwachen . Die Sonde Check-Control (PCC) überprüft Reagenz Rehydratation, PCR-Röhrchen füllendie Patrone, zu verstärken Sonde Integrität und Farbstabilität. 9 Die Primer in der Xpert MTB / RIF-Assay einen Teil des Gens rpoB enthält die 81-Basenpaar &quot;Kern&quot;-Region. Fünf unterschiedlich farbigen fluorogenen Nukleinsäure-Hybridisierungssonden, genannt Molecular Beacons, fragt den gesamten 81-bp-Kern. 14 Jede Molecular Beacon wurde entwickelt, um so spezifisch, daß es nicht sein Ziel zu binden, wenn die Zielsequenz unterscheidet sich von dem Wildtyp-rpoB Sequenz durch so wenig wie ein Einzel-Nukleotid-Substitution. Da Molecular Beacons Fluoreszenz nur, wenn sie ihre Ziele, dh Wildtyp-Sequenz rpoB gebunden sind, die Abwesenheit von einem der fünf Farben in dem Test zwischen dem konservierten Wildtyp-Sequenz und Mutationen zu unterscheiden in der Kernregion die assoziiert sind mit RIF Widerstand. 6 Die SPC sollten in einer negativen Probe positiv und kann negativ oder positiv sein in einer positiven Probe. Der TestErgebnis wird sein, &quot;Ungültig&quot;, wenn der SPC wird nicht zu einem negativen Test nachgewiesen. Vor Beginn der PCR-Reaktion, misst das GeneXpert DX-System das Fluoreszenzsignal von den Sonden zu Wulst Rehydratisierung, Reaktions-Rohrfüllung, Sonde Integrität und Farbstabilität zu überwachen. Die PCC ist erfolgreich, wenn die Fluoreszenz-Signal von den Sonden erfüllt die Aufnahmekriterien zugewiesen. Die Ergebnisse von der GeneXpert DX-System von den gemessenen Fluoreszenz-Signale und Embedded Berechnungsalgorithmen werden interpretiert und sind in der View Results Fenster 9 angezeigt, wie unten angegeben: MTB Detected: MTB Ziel-DNA erkannt wird; beide Regler, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugewiesen. Untere Ct-Werte stellen eine höhere Ausgangskonzentration von DNA-Matrize, höhere Ct-Werte stellen eine geringere Konzentration an DNA-Matrize. Im MTB detektierten Ergebnisse &quot;RIF Widerstand erkannt&quot; (Abbildung 1A), &quot;RIF Widerstand nicht erkannt&quot; ( <strong&gt; Abbildung 1B), oder &quot;RIF Widerstand unbestimmt&quot; wird in einer eigenen Zeile angezeigt werden. MTB nicht erkannt: MTB-Ziel-DNA wird nicht erkannt, beide Kontrollen, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugewiesen (Abbildung 2). Ungültig: Das Vorhandensein oder Fehlen von MTB nicht ermittelt werden kann: SPC nicht erfüllt Akzeptanzkriterien, dh die Probe nicht richtig verarbeitet wurde, oder PCR inhibiert wurde (Abbildung 3). Hinweis: wiederholen Sie den Test mit extra Probe! Fehler: Ein oder mehrere der PCC Ergebnisse gescheitert (FAIL). Sowohl MTB-und SPC-Anzeige Kein Ergebnis. Hinweis: wiederholen Sie den Test mit extra Probe! Wenn die PCC übergeben (PASS), wird der Fehler von einer Systemkomponente Fehler verursacht hat. Abbildung 1: MTB-Ziel-DNA erkannt wird; beide Regler, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugewiesen. Niedrigere Ct Werte stellen eine höhere Anfangs-Konzentration von DNA-Matrize, höhere Ct-Werte stellen eine geringere Konzentration an DNA-Matrize. Im MTB detektierten Ergebnisse &quot;RIF Widerstand nicht erkannt&quot; (Abbildung 1A), &quot;RIF Widerstand erkannt&quot; (Abbildung 1B), oder &quot;RIF Widerstand unbestimmt&quot; wird in einer eigenen Zeile angezeigt werden. <img alt="1A" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" /> . 1A MTB nachgewiesen; RIF Widerstand nicht erkannt wird, dh nur die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des 81-bp-RIF Widerstand bestimmenden Region (RRDR) des Gens rpoB anwesend war 6. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="1B" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" /> . Abbildung 1B MTB nachgewiesen; RIF Widerstandes erfasst. Füllen Sie brechen die Probe B (Pfeil), die deckt die Positionen 513 bis 517 des R<html> RDR des Gens rpoB. 6 Im Beispiel partielle Sequenzierung ergab, dass die Gen-Mutation D516V rpoB erkannt wurde. 8 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" /> Abbildung 2 MTB-Ziel-DNA wurde nicht erkannt,.. Beide Regler, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugeordnet <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" /> . 3 Ungültig Testergebnis, dh Anwesenheit oder Abwesenheit von MTB nicht ermittelt werden kann: SPC nicht erfüllt Akzeptanzkriterien, weil die Probe nicht richtig verarbeitet, oder weil PCR gehemmt wurde.3547fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

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	<li>Sudre, P., Dam, t. e. n., Chan, G., C, A., Kochi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculosis+in+the+present+time:+a+global+overview+of+the+tuberculosis+situation.">Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation.</a> World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).</li><li>World Health Organisation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tuberculosis+control:+epidemiology,+strategy,+financing.">Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing.</a> WHO report 2010. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The global plan to stop TB, 2006-2015. , (2006).</li><li>Morris, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+multiple+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.</a> J. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Xpert MTB / RIF-Test integriert Probe Dekontamination, Freisprechen, On-Board-Probe Verarbeitung, sowie hochsensible hemi-nested PCR zum gleichzeitigen Nachweis von MTB und RIF Widerstand, entweder im Sputum oder konzentrierten Sedimenten, in einem einzigen , einfach zu bedienendes System. Der Test der analytischen Nachweisgrenze wurde festgestellt, dass 131 KBE / ml Sputum sein. 6 Die log-lineare Beziehung zwischen Ct-Werte und die Anzahl der MTB-Zellen zu präsentieren gilt von 10 2 bis 10 7 CFU / ml Sputum. Als klinisch relevanten Konzentrationen MTB fallen alle in den linearen Bereich des Assays stellt der Assay semi-quantitative Schätzungen der bakteriellen Belastung. 7 Der Test erfordert nur moderate Labor-Infrastruktur und Ausbildung. Die Nachweisgrenze liegt bei mindestens zwei Größenordnungen niedriger als die der konventionellen Mikroskopie. 6 Spezifität ist ausgezeichnet. Darüber hinaus die gleichzeitige Erfassung der RIF-resistant MTB ist ein bedeutender Vorteil bei der Einstellung von Point-of-Care-Tests in der Ära der MDR-TB. 3 Um nur begrenztem Umfang vorhandenen Daten auf den Test die Leistung für die Diagnose von Lungen-TB im klinischen Umfeld Bisher gibt es 12;. 13 der Xpert MTB / RIF-Test des gesamten klinischen Empfindlichkeit des Nachweises von MTB im Sputum von Patienten mit Verdacht auf Lungen-TB betrug 97,6%, wenn die Kultur im Vergleich als Referenz. Dies waren die Ergebnisse einer prospektiven Multicenter-Studie, die fünf Prüfzentren (Lima, Peru; Baku, Aserbaidschan, Kapstadt &amp; Durban, Südafrika, Mumbai, Indien) beteiligt und insgesamt 1462 Patienten. Die gesamte Pre-Test-Wahrscheinlichkeit für Kultur bestätigt TB in der Studienpopulation betrug 50,7%. Die Sensitivität betrug 99,8% für schmier-und Kultur-positiven Fälle und 90,2% für Abstrich-negative, Kultur-positiven Fällen. Unter HIV-positiven Patienten mit Lungentuberkulose, war die Empfindlichkeit des MTB / RIF-Test 93,9%, verglichen mit 98,4% in. HIV-negativen Patienten 12 In einer Einstellung von niedrigen TB-Prävalenz-Studie war die Vereinbarung zur Erkennung MTB 89%, wenn die Kultur verglichen; die Sensitivität betrug 98% für Abstrich-positive und 72% für Abstrich-negativen Proben, jeweils, und die Spezifität war ausgezeichnet. 13. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Empfindlichkeit zwischen den Tests auf unbehandelten Sputum und den auf konzentrierte Sedimenten. 12. In der gleichen Studie, die MTB / RIF-Test korrekt erkannt RIF Widerstand in 209 von 211 Patienten (99,1% Sensitivität) und in alle 506 Patienten mit Anfälligkeit RIF (100% Spezifität), bei der Sequenzierung Ergebnisse berücksichtigt wurden. 12. Die Autoren fanden, dass Leistung sowohl für Fall-Erkennung und Diskriminierung von RIF Widerstand, ähnlich wie über verschiedene Standorte war, was darauf hindeutet, dass die Ergebnisse wahrscheinlich sind eine breite Anwendung finden. 12 Darüber hinaus konzentrierten Sedimenten des respiratorischen Proben anderer als Sputum, wie bronchoalveoläre Lavage und Bronchienl Sekret, wurden mit vergleichbarer Sensitivität und Spezifität geprüft. 13 Daten auf den Test die Leistung beim Test extra-Lungen-TB ist im Entstehen. 15 Global TB Kontrolle braucht dringend wirksame Instrumente, die eine schnelle Diagnose der neuen TB-Fälle und Detektion von RIF-resistenten MTB in universal-Zugang erlauben Point-of-Care-Einstellungen. 3 Aktuelle Nukleinsäureamplifikation Methoden zur MTB erkennen sind komplex, arbeitsintensiv, und technisch anspruchsvoll. Der Xpert MTB / RIF-Test hat das Potenzial, standardisierte, empfindliche und sehr spezifische diagnostische Tests sowohl für Tuberkulose und der Medikamentenresistenz auf diese Einstellungen, sofern sie in der Lage, die es sich leisten zu bringen. Um den Zugang zu erleichtern, hat die Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) deutliche Preissenkungen für die Xpert MTB / RIF-Test ausgehandelt. Aktuelle Preise ausgehandelt FINDEN, zusammen mit der Liste der Länder, für die Rabatte, sind im Web verfügbar. 10 </sup&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Xpert MTB / RIF-Test </td><td> Cepheid </td><td> GXMTB/RIF-10 </td></tr><tr><td> Transferpipetten </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1172.001 </td></tr><tr><td> Konische Röhrchen, 15 ml, 120 x 17 mm, PS </td><td> Sarstedt </td><td> 62.553.542 </td></tr></tbody></table>

diagnosing pulmonary tuberculosis with the xpert mtb/rif test

Tuberkulose (TB), verursacht durch Mycobacterium tuberculosis (MTB) bleibt ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit: Die Infektion betrifft bis zu einem Drittel der Weltbevölkerung ein, und fast zwei Millionen Menschen von TB sterben jedes Jahr 2 Universeller Zugang zu qualitativ hochwertiger. , Patienten-zentrierte Behandlung aller TB-Patienten wird von der WHO Stop TB-Strategie ist hervorgehoben. 3 Der schnelle Detektion von MTB in respiratorischen Proben und medikamentöse Therapie auf zuverlässige Resistenz Testergebnisse basieren, sind eine Voraussetzung für die erfolgreiche Umsetzung dieser Strategie. Doch in vielen Gebieten der Welt, TB-Diagnose immer noch auf unempfindlich, schlecht standardisierte Sputum-Mikroskopie-Methoden. Unwirksame TB-Erkennung und die Entstehung und Übertragung von resistenten Stämmen MTB zunehmend gefährden globale TB-Kontrolle Aktivitäten. 2 Effektive Diagnose der Lungentuberkulose erfordert die Verfügbarkeit - auf globaler Ebene - der Standheitlichen, einfach zu bedienende, robuste und Diagnostika, welche den direkten Nachweis sowohl des MTB-Komplex und Resistenz gegen Antibiotika Schlüssel, wie Rifampicin (RIF) ermöglichen würde. Letzteres Ergebnis kann als Marker für multiresistente MTB (MDR-TB) zu dienen und hat in&gt; 95% der MDR-TB-Isolaten. 4, 5 Die schnelle Verfügbarkeit von zuverlässigen Testergebnissen berichtet wird wahrscheinlich direkt in Klang übersetzen Patientenmanagement Entscheidungen, die letztlich den einzelnen Patienten zu heilen wird und die Kette der TB-Übertragung in der Gemeinde. 2 Cepheid (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF-Test 6, 7 erfüllt die Anforderungen oben in einer merkwürdigen Weise skizziert. Es ist ein Nukleinsäure-Säuren Amplifikation Test für 1) der Nachweis von MTB komplexen DNA im Sputum oder konzentrierter Sputum Sedimente und 2) der Nachweis von RIF Resistenz-assoziierte Mutationen des Gens rpoB 8 Es ist zur Verwendung mit Cepheid GeneXpert Dx konzipiert. System-than integriert und automatisiert Probenaufbereitung, Nukleinsäureamplifikation und Detektion der Zielsequenzen mit real-time PCR und Reverse-Transkriptase-PCR. Das System besteht aus einem Instrument, Personal Computer, Barcode-Scanner und vorinstallierter Software zum Ausführen von Tests und Anzeigen der Ergebnisse. 9 Es beschäftigt Verwendung von Einweg-Xpert MTB / RIF-Patronen, die PCR-Reagenzien zu halten und Gastgeber des PCR-Prozesses. Da die Patronen selbst enthalten sind, ist eine Kreuzkontamination zwischen den Proben eliminiert. 6 Aktuelle Nukleinsäureamplifikation Methoden zur MTB erkennen sind komplex, arbeitsintensiv und technisch anspruchsvoll. Der Xpert MTB / RIF-Test hat das Potenzial, standardisierte, empfindliche und sehr spezifische diagnostische Tests sowohl für Tuberkulose und der Medikamentenresistenz zu bringen, um Universal-Access-Point-of-Care-Einstellungen 3, sofern sie in der Lage, die es sich leisten. Um den Zugang zu erleichtern, hat die Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) signifikant ausgehandeltcant Preissenkungen. Aktuelle Preise ausgehandelt FINDEN, zusammen mit der Liste der Länder, für die Rabatte, sind im Web verfügbar. 10

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Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Der Xpert MTB / RIF-Test integriert Probe Dekontamination, Freisprechen, On-Board-Probe Verarbeitung, sowie hochsensible hemi-nested PCR zum gleichzeitigen Nachweis von<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Und Rifampicin-Resistenz, entweder im Sputum oder Sputum konzentrierten Sedimenten, in etwa zwei Stunden. Die Prüfung ist standardisiert und erfordert nur moderate Labor-Infrastruktur und Ausbildung.

Diagnose Lungentuberkulose mit dem Xpert MTB / RIF-Test

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

79.8K Aufrufe.  University of Bern. Der Xpert MTB / RIF-Test integriert Probe Dekontamination, Freisprechen, On-Board-Probe Verarbeitung, sowie hochsensible hemi-nested PCR zum gleichzeitigen Nachweis von Mycobacterium tuberculosis Und Rifampicin-Resistenz, entweder im Sputum oder Sputum konzentrierten Sedimenten, in etwa zwei Stunden. Die Prüfung ist standardisiert und erfordert nur moderate Labor-Infrastruktur und Ausbildung.

Serie: Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Rechtsventrikulären systolischen Druck Messungen in Kombination mit Harvest of Lung and Immune Gewebeproben in Mäuse

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test, Messung der Lungenfunktion und Fixierung der Lunge, um die Auswirkungen von Übergewicht und beeinträchtigter Stoffwechsel auf pulmonale Ergebnisse studieren

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...