著者らは、優れた継続的な畜産ケアを提供するためディーキン大学ゼブラフィッシュ施設のスタッフに感謝したいと思います。 YGは、アルフレッドディーキンポスドク研究フェローシップとディーキン大学から中央研究グラントでサポートされています。 SLMはNHMRCキャリア開発フェローシップでサポートされています。 ACWはNHMRC有効にグラントでサポートされています。すべての著者は、ディーキン大学の分子医療研究戦略研究センターによりサポートされています。

パート1：ゼブラフィッシュ胚の化学処理<ol><li>受精後のゼブラフィッシュ胚を収集します。 28.5℃にて100でE3培地のC×15mmのペトリ皿を注：in situハイブリダイゼーションまたはオイルレッドO染色では、0.2mMの最終濃度で1 -フェニル-2 -チオ尿素（PTU）は、に追加されます、色素形成を阻害しますが、1タツノオトシゴ分析には必要ありません。 </li><li>薬理学的研究については、適切な車両専用コントロールと約26時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を開発するための適切な最終濃度で必要な化学物質を追加注：光感受性薬理学的阻害のために、胚はで発展させることができる分析前に暗い。 </li></ol>パート2：シーホースXF 24アナライザーを使用したライブ代謝プロファイル<ol><li> O 2とHを収容する各実行の前に、シーホースXF 24アナライザーカートリッジ<sアップ&gt; +蛍光体はアナライザで実行自動化されたプロセスを通して校正されています。 </li><li> 24ウェルXFの24膵島プレートの作製。以下の実験シーケンスを採用している： <ol><li>酸素消費量は温度の変動に敏感であるため、4つのウェルをプレート間で想定される温度変動を制御するために使用されます。これらの井戸は、胚が含まれていませんが、E3の培地を700μl（ 図2A）が充填されます。 </li><li>残りの20ウェルは（パート2.2を参照）、E3培地と1つの胚それぞれ（ 図2B）を700μlに満ちている。 </li><li>各実験では、10胚は車両のみ（コントロール）と10化学阻害剤（処理）で処理で処理される。対照および処理胚は（：;：処理胚：よくA4：制御胚、よくA5扱わ胚などよくA3コントロール胚ウェルA2 など ）を交互にされています。 </li><li>膵島キャプチャ画面はの上に追加され。試料がアッセイ全体の測定室（ 図2B）のままであることを保証するために、各ウェル注：化学的処理された胚は前タツノオトシゴアナライザを実行している化学物質を洗い流す必要がなく、プロシージャ全体を通して、元の化学溶液に残るプログラム。 </li><li>完了したら、プレートはタツノオトシゴアナライザーにロードされ、検定が開始されます。 </li></ol></li><li>サンプルの分析。二つの異なるアッセイは日常的に行われている。 <ol><li>基礎呼吸/最大呼吸プログラム（期間：約90分）。基底呼吸の変化は、最大呼吸が病理学的および生理学的状態の両方の番号に関連付けられ、このパラメータの総エネルギー生産能力と変化の尺度である一方で、代謝機能不全を支える。予備の呼吸能力、またはさらなるATP産生を増加させるためのシステムの能力は、また計算されます最大呼吸から基底の減算によって、このテストによる。三各ミックスの反復（2分）/待機（1分）/測定（2分）のサイクルは、まず基底呼吸を確立するために行われる。第3サイクルの終わりに、FCCPの2.5μMの（ミトコンドリアprotonophore /脱共役剤）の最終濃度は、各ウェルの最大呼吸の測定を可能に追加されます。測定サイクルは、その後、5〜8倍（ 図3）を繰り返す。 </li><li> ATPのターンオーバー/プロトンリークプログラム（持続時間約60分）。 ATPの代謝回転に起因する呼吸がATP生産の形でミトコンドリアの主要な機能を表し、プロトンリーク、または非結合呼吸による呼吸しながら、密接に基礎呼吸と活性酸素種の形成を含むミトコンドリア機能の他のパラメータと連動しています。 ATPの代謝回転に起因する呼吸は、25μMオリゴ（の阻害剤を添加した後の呼吸量の差で表されるTPシンターゼ）基底呼吸に比べて。脱共役呼吸、またはプロトンリークによる呼吸は、25μMのロテノン（複合体Iの阻害剤）を添加した後のオリゴマイシン媒介呼吸と呼吸の間の差を計算することによって決定される。測定サイクルは、それぞれのミトコンドリア阻害剤を添加した後、8回繰り返される。 </li></ol></li></ol>実行の終了時に、10個のコントロールと10化学処理された胚の平均値を算出しています。 パート3：オイルレッドO染色<ol><li> 50 HPFの胚を4℃で一晩4％PFAで細かい鉗子を用いdechorionatedと固定されています</li><li>オイルレッドO染色は、以前（ 図4を参照）2に記載されているように 、実行されます。 </li></ol>

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ゼブラフィッシュ胚における遺伝子機能も簡単にブロックされたり、アクティブにすることができながら、ゼブラフィッシュは、前方（ENU誘発）とリバース（耕耘、ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的ノックアウト、モルホリノノックダウン）遺伝的アプローチ3,4両方のための十分に確立された遺伝的モデルである符号化された製品の特定の選択的な薬理学的化合物を使用して。彼らの外部の開発と小型のため、ゼブラフィッシュ胚は、代謝解析のために特に適している。しかし、代謝プロフィールとゼブラフィッシュ胚における in vivoでのミトコンドリア機能の堅牢な計測は1つだけ予備説明と共に、達成5報告されていない。タツノオトシゴの分析は、もともと細胞ベースの代謝研究用に設計されており、正確で信頼性の高い結果6を与えることが実証されている。ゼブラフィッシュ胚には、この新しい方法論の適用が重要、と代謝研究のために、このモデルのより広い使用を増強する可能性があります。そこで本研究では、基底呼吸、最大呼吸、呼吸予備容量は、ATPの代謝回転とプロトンリーク電流を含むタツノオトシゴアナライザーを用いて、ゼブラフィッシュ胚の呼吸パラメータの範囲の測定値を示しています。我々はまた、このような測定は、この場合の脂質の蓄積であり、このアッセイ系における薬理学的阻害剤の使用の他の生理的パラメータと相関させることができる方法の例を提供します。遺伝子組み換え胚の使用と組み合わせることで、これが代謝に影響を与える要因を理解するための強力な実験的なプラットフォームを提供します。 ミトコンドリアの機能不全は、糖尿病7、肥満8、多発性硬化症9、パーキンソン病10、アルツハイマー病11とがん12のいくつかのタイプなど、多くのヒト疾患に関与していると、この新しい方法論のための様々なアプリケーションがあります。重要なことは、Oそれによって生体の呼吸および代謝プロファイルで生理学的に関連するビューを提供する、アクティブになっている-そのようなサイトカイン、開発関連の成長などなど-ウルの仕事はすべての環境の影響は 、in vivo で行われます。などの化学画面も日常的に野生型と変異型の背景ゼブラフィッシュ胚（ 図1）、影響呼吸、ミトコンドリア機能や代謝を簡単にタツノオトシゴ·アナライザを使用して識別することができることを小説医薬品で実行されます。タツノオトシゴ·アナライザを使用して生成された結果は、追加情報を提供するために、他のアッセイと組み合わせて使用​​することができる。これは、例えばcebpαなどの特定の脂肪細胞のマーカーのためのin situハイブリダイゼーションなどのオイルレッド染色、または分子解析、PPARα、PPARγ、FASなどの生理的な分析を含むことができ、 この方法にはいくつかの制限が残っている。我々と他の人はMEASにオリゴマイシンを使用することができたものの、60 HPFオリゴマイシンの治療よりも古い胚の若い胚5（ 図3を参照）上のURE ATP生産とプロトンリークは、非効率的です。我々は古い胚でオリゴマイシンは、同じように簡単に解釈する結果は不可能若い胚に比べて拡散することができないと信じています。オリゴマイシンの結果は、ATPの代謝回転と切り離さ呼吸による呼吸の測定のための必須であるので、我々は現在、年上の胚のオリゴマイシンの高い濃度を調査している。しかし、アンチマイシン治療法は、このような基礎呼吸、最大呼吸とスペア呼吸容量、古いゼブラフィッシュ胚で行うことができ、最大68 HPF（図示せず）などの他の測定と、より長い有効のままです。 現在のタツノオトシゴアナライザーのセットアップを使用してのもう一つの制限は、ゼブラフィッシュ胚および若齢幼虫にのみ適していることなどを各ウェル膵島捕捉プレート内の物理的な空間です。したがって、metabolを行う成魚における食餌誘導性肥満のICの研究は、例えば、まだ技術的に実現不可能である。しかし、この研究では、ことが可能な分析の範囲を拡張し、特に少年又は成魚用に設計されたプレートの開発を促すことができる。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> XFの24細胞外フラックスアナライザー</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 100737-101 </td><td> 24ウェルフォーマット</td></tr><tr><td>膵島キャプチャーマイクロプレート</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 101122-100 </td><td> 24ウェルフォーマット</td></tr><tr><td> XFのキャリブレーション·ソリューション</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XFのアッセイ培地</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td>オイルレッドO </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - フェニル-2 - チオ尿素（PTU） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7629 </td><td>/ zfbook/chapt10.html＃wptohtml51 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html＃wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3（胚培地） </td><td>自分で作った</td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html＃wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100X15ミリメートルペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td> 35から1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td>シグマ</td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>シグマ</td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシンA </td><td>シグマ</td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

代謝の分野で成長している目標は、ミトコンドリア機能のさまざまな側面に遺伝の影響を判断することです。これらの関係を理解することは、糖尿病や肥満などのミトコンドリア機能不全と連動疾患の範囲のための基礎にある病因を理解するのに役立ちます。計装における最近の進歩は、細胞株や組織外植片のミトコンドリア機能の異なるパラメータの監視を可能にしました。ここでは、シーホースXFバイオサイエンス24細胞外フラックスアナライザーを用いてゼブラフィッシュ胚の発生過程で生体内でのミトコンドリア機能パラメータの迅速かつ高感度な分析のための方法を提示する。このプロトコルは、膵島キャプチャは単一胚を各ウェルに配置されている場合には、生体エネルギーの測定を可能にする、マイクロプレートを含む利用：基礎呼吸（i）を、ATPの代謝回転に起因する（ii）の基底ミトコンドリア呼吸（iii）のミトコンドリアの呼吸をし、（iv）ミトコンドリア切り離さ呼吸やPRoton漏れ及び（i​​v）の最大呼吸。このアプローチ胚ゼブラフィッシュの呼吸パラメータを使用すると、野生型および遺伝的に改変された胚（変異、遺伝子の過剰発現や遺伝子ノックダウン）またはその薬理学的に操作され、それらの間で比較することができます。それは、このプロトコルの普及はこの関連脊椎動物動物モデルにおける in vivoでの代謝性疾患の遺伝的基礎を分析するための新しいツールを研究者に提供することが予想されます。

<html>我々は、特に代謝、呼吸速度および脂質代謝に役割の特定の遺伝子を理解することに興味を持っています。したがって、我々はこれらの遺伝子の1つによってコードされる酵素の特異的な薬理学的阻害剤を用いたHPF 26年から野生型ゼブラフィッシュ胚を処理した。残りの半分を4％で固定している間50 HPFで、車両及び阻害剤で処理した胚の半分は、ミトコンドリア機能のためのタツノオトシゴを用いて分析したPFAの一晩4℃で、その後、オイルレッドOで脂質沈着のために染色。特定の酵素阻害剤による治療は特に終脳と耳胞（ 図4B、C）の下に脂質沈着の増加と関連していた基底呼吸で約2倍に増加し（ 図4A）、つながった。 pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; 図1。ゼブラフィッシュ胚の化学的処理の概略図。野生型、遺伝的に操作され、またはその薬理学的に処理されたゼブラフィッシュ胚は背景です。 <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> 図2。 XF24膵島プレートが設定します。（）4つのウェルは、温度コントロールとしてのみ胚性媒体を含む（Xでマークされている）と他の人がよく1つの胚を含む/。 （B）は膵島キャプチャー画面（矢じり）で覆わ車両スルホキシド（DMSO）で処理された50 HPF野生型胚を示すだけでなく1（C6）のクローズアップ。 <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> 図3。 Respirat野生型50 HPFのゼブラフィッシュ胚のイオンパラメータは、（A）各測定では、20個の胚の平均が表示されます。基底呼吸（平均：299.7、SD：75.7; SEM：16.9）、最大呼吸（平均：387.4、SD：93.3; SEM：20.9）、スペア呼吸容量（平均：87.7、SD：72.0​​; SEM：16.1）。 （B）の各測定では、20個々の結果の平均値が提示される。基底ミトコンドリア呼吸、ATPの代謝回転に起因するミトコンドリア呼吸、ミトコンドリアの脱共役呼吸および非ミトコンドリア呼吸。 MT：ミトコンドリア、SRC：スペア呼吸容量、SD：標準偏差、SEM：平均値の標準誤差。結果は/分/胚消費O 2のpmolに提示されます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 REPRE基底呼吸と脂質沈着に及ぼす化学物質の曝露のsentative結果（A、B）は側面図でオイルレッドOで染色した50のHPF胚。選択的阻害剤と共にインキュベート胚（B）は、終脳における多くのオイルレッドO染色（矢印）が表示され、ビヒクル処置対照胚と比較して、耳胞（矢印）の下。 （C）の基底呼吸は化学的に処理された胚（群あたりn = 10胚）で約2倍の増加を示しています。結果は、O 2 /分/胚のpmolに示されている。

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Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュは、代謝の研究のために十分に利用されている強力な脊椎動物のモデルを表しています。ここでは、測定するための迅速な方法を記述<em生体内で&gt;</emそれによって、この生物の適用性を増加させる、遺伝的または薬理学的に操作された胚の間の異なるミトコンドリア機能パラメータの比較を可能にゼブラフィッシュを開発する&gt;代謝プロファイル。

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.8K ビュー.  School of Medicine, Deakin University. ゼブラフィッシュは、代謝の研究のために十分に利用されている強力な脊椎動物のモデルを表しています。ここでは、測定するための迅速な方法を記述代謝?...

ビデオ: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

生物学

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...