私たちは、協力的かつ熱狂的な研究環境を提供するためのルーベンラボの現在および過去のメンバーに感謝。私たちは、プロトコルの最適化の支援のためにライアンT.ギブソンに感謝。我々は、酵母株およびプラスミドのためにマークHochstrasser（エール大学）とディーター·ウルフ（シュトゥットガルト大学）を感謝。我々は、この原稿の明快さと実用性の改善に彼らの助けのために私たちの匿名の査読者に感謝。この作品は、ボール州立大学からEMR、EMRにボール州立大学ASPIRE研究賞、および資金にSGWにシグマXIのボール州立大学の章から研究賞、国立衛生研究所の助成金（R15 GM111713）によってサポートされていました学長のOfficeと生物学科。

タンパク質分解に欠陥候補突然変異体を同定する1.酵母増殖アッセイ<ol><li>レポーター代謝酵素と、フレームで融合された不安定なタンパク質をコードするプラスミドを、野生型および突然変異体酵母細胞を形質転換する。 </li><li>プラスミド分子を保有する細胞に対して選択的である合成に定義（SD）最小培地5ml中の形質転換体を接種する。回転、30℃で一晩インキュベートする。 </li><li>各一晩培養物を600nm（OD 600）での光学密度を測定します。 注：一晩のインキュベーション後、培養中の細胞のいずれか、対数または定常増殖期にあってもよいが、0.2の最小限のOD 600に達している必要があります。経験的に決定されるような非常に成長の遅い酵母株は、1晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。 </li><li>に希釈した細胞をはじめとする無菌の96ウェルプレート中で形質転換された酵母細胞の六倍連続希釈液を調製するN OD 0.2の600。 96ウェルプレート内の異なる行でアッセイされる各酵母形質転換体を配置します。 <ol><li>各形質転換のために、200μlの最終容量で0.2のOD 600に細胞を希釈するために必要な一晩培養の体積を計算。コラム1に対応するウェルに一晩培養のこのボリュームを追加200μlにボリュームをもたらすために滅菌水の適切な量を追加します。 </li><li>酵母の各行について、列2、3、および4のウェルに滅菌水125μlを添加する。 注：個別に包装された無菌の96ウェルプレートは、滅菌蓋でパッケージされてもよい。蓋は、このステップで配布され、滅菌水のリザーバとして使用することができる。これはマルチチャンネルピペッターに与えられた列のすべてのウェルに滅菌水の同時転送を可能にする。 </li><li>ピによってマルチチャンネルピ ​​ペッターを下の最初の列（OD 0.2の600に希釈した酵母）の内容を混ぜる。 </li><li> TRANSFマルチチャンネルピペッターを使用して列2に列1から酵母25μlの、えー。ピペッティングにより混和する。転送列3の列2から25μL、列3から列4に25μL（各ステップでよく混合）。 </li></ol></li><li>マルチチャンネルピペッターで各サンプルを混ぜる。最も希薄から出発すると、少なくとも適切な選択培地を含む2プレートに酵母、ピペット各サンプルの4μlの列を希釈する。プラスミド選択を（このプレートは酵母スポッティングと成長制御となります）維持培地で一つのプレートを使用してください。プラスミド維持とレポー​​ター酵素に融合された不安定なタンパク質の発現のために選択した媒体と第二のプレートを使用してください。酵母は、急速に沈降し、一定の間隔で上下にピペッティングして細胞を混ぜているため。 注：乾燥機のプレートをより容易に、新たに調製したプレートよりも液体吸収し、したがって、これらの実験のために推奨されている。湿ったプレートを見よ中、室温でインキュベートすることによって乾燥させることができる層流フード中で2日またはより短いインキュベーション - 1ワット湿度。層流ベンチに対して平行である場合、プレートを不均一に乾燥することができる。テンプレートの使用は、簡単に正規の距離で酵母細胞を発見することができる。 2つのサンプルテンプレートが図1に提供される。これらは、印刷された切り出し、ペトリ皿の蓋の内側に取り付けることができる。 </li><li>プレートが作業台の上に乾燥することができます。 </li><li> 6日 - 2、30℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後に各プレートを撮影。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> 100mmの寒天プレート上の酵母細胞をスポッティングするための図1のテンプレート。これらのテンプレートは、マルチチャンネルピ ​​ペッターを持つ通常の距離で酵母をスポッティング容易にすることができる。テンプレートは、印刷された切り出し、ペトリ皿の蓋の内側に取​​り付けることができる。成長にシャーレを置きテンプレートとメディア内部の蓋が固定された。テンプレートは、向きを追跡するためにノッチが付いています。これは、成長アッセイで使用したプレートは、同様に方向性を追跡するためにノッチでマークすることをお勧めします。 4（A）または5（B）酵母細胞の連続希釈が提供されてスポッティングためのテンプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">100 mmのテンプレートと、この図の印刷可能バージョンを表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 酵母増殖アッセイの2生化学確認<ol><li>酵母細胞およびポストアルカリ性タンパク質抽出の成長（31から変更） <ol><li>不安定なタンパク質をコードするプラスミドを、野生型および突然変異体酵母細胞を形質転換する。 </li><li>プラスミド分子を保有する細胞に選択的であるSD培地5ml中で形質転換体を接種する。回転、30℃で一晩インキュベートする。 </li><li>各一晩、CuのOD 600を測定しますlture。 注：一晩のインキュベーション後に、細胞を、対数または定常増殖期にあってもよいが、0.2 10ミリリットルで新鮮な選択培地（ステップ2.1.4）のOD 600に希釈を可能にするOD 600に達している必要があります。経験的に決定されるような非常に成長の遅い酵母株は、1晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。 </li><li> 0.2mlの10の新鮮な選択培地のOD 600に酵母細胞を希釈する。 </li><li> （中期対数増殖しているIE）培養物は0.8と1.2の間のOD 600に到達するまで、回転または振盪、30℃で細胞をインキュベートし続けます。 注：関心のある不安定なタンパク質は、調節可能なプロモーターの制御下にある場合には、タンパク質の発現および細胞収穫の誘導の最適なタイミングは、以前の研究又は経験的観察に応じて変化し得る。 </li><li> 15 mlの円錐での培養の2.5 OD 600単位を収集室温で5分間、5000×gでの遠心分離によってらチューブ。ペッティングまたは吸引により上清を除去します。 注：One OD 600単位を1.0のOD 600での培養液1ml中に存在する酵母の量として定義される。 V = 2.5 OD 600単位/測定OD 600：2.5のOD 600単位（V）を収穫するために必要な（ミリリットル）の培養物の容量は、以下の式を用いて決定することができる</li><li> 1ミリリットル中に細胞を再懸濁し、水を蒸留した。マイクロ遠心チューブに懸濁した細胞を転送します。 </li><li>室温で30秒間、6500×gでの遠心分離によって細胞をペレット。ペッティングまたは吸引により上清を除去します。 </li><li> 100μl中に細胞を再懸濁がダウンしているかボルテックスピペッティングして蒸留水を、そして100μl、0.2MのNaOHを追加します。ピペッティングにより混和する。室温で5分間、サンプルをインキュベートする。 </li><li> 18000 xでの遠心分離により細胞をペレット化（そのほとんどはまだタンパク質をリリースし、まだ生存しているしていない）5分間のグラム。ペッティングまたは吸引により上清を除去します。 </li><li>上下にピペッティングまたはボルテックスによって、細胞を溶解します100μlの1×Laemmliサンプルバッファー、 - 50でペレットを再懸濁。 NOTE：Laemmliサンプル緩衝液中で遠心分離し、細胞のその後の再懸濁以下アルカリ上清の除去はトリス - グリシンランニング緩衝系およびウェスタンブロッティングを使用して、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）と互換性のpHでタンパク質を抽出する。 </li><li>完全にタンパク質を変性させ、5分間95℃で溶解物をインキュベートする。 注：95℃でインキュベートしたときに凝集しやすいタンパク質（いくつかの膜貫通セグメントを持つ例えば、タンパク質）が不溶性になることがあります。経験的にこのようなタンパク質の分析のために、決定されるように、30分- 10について-このため、溶解物は、より低い温度（70℃、 例えば 37℃）でインキュベートされるべきである。 </li><li>氷上で5分間置くことによって溶解物を冷却する。 </li><li>室温で1分間、18000×gで遠心分離溶解物の不溶性物質をペレット化する。事前のその後のウエスタンブロット分析（セクシ​​ョン2.2）に、SDS-PAGEにより上清（可溶化抽出したタンパク質）を分離。また、-20℃で保存溶解物。 </li></ol></li><li>代表ウェスタンブロッティングプロトコル<ol><li> SDS-PAGEゲルで溶解物の実験的に決定されたボリュームをロードします。 </li><li>色素フロントがゲルの底に到達するまで200Vでゲルを実行します。 </li><li> 4℃で90分間 - 60 20 Vでウェット移送によりポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にゲルからタンパク質を移す。 </li><li> 4℃で一晩、室温で1時間、揺動または、トリス緩衝生理食塩水（TBS）中の5％スキムミルク中でインキュベートすることによりブロック膜。 </li><li>ブロッキング溶液デカントします。 </li><li>室温テで1時間、0.1％のTween-20（TBS / T）を含むTBS中の1％スキムミルク中の目的のタンパク質（またはそのエピトープタグ）に特異的な一次抗体で膜をインキュベートするmperature、ロッキング。 </li><li>抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。 </li><li>ロッキング、室温で1時間、TBS / T中の1％スキムミルク中の適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートする。 注：蛍光団は光に敏感であるため、フォア標識抗体の希釈は暗闇の中で準備する必要があります。さらに、フォア標識抗体の存在下での膜のインキュベーションは、遮光容器内に発生する必要があります。これはアルミ箔でインキュベーショントレイをラップすることによって達成することができる。 </li><li>抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。 </li><li>製造業者の推奨に従って、LI-CORオデッセイCLxのを用いた膜と画像Studioソフトウェア（または同等の画像機器およびソフトウェア）の画像を取得する。 </li><li>膜を画像化した後、ロード用の具体的な一次抗体で膜をインキュベートロッキング、室温で1時間、TBS / T中の1％スキムミルクで制御タンパク質る。 </li><li>抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。 </li><li>ロッキング、室温で1時間、TBS / T中の1％スキムミルク中の適切なフルオロフォア結合二次抗体で膜をインキュベートする。 </li><li>抗体溶液をデカントし、そして室温でTBS / Tで膜3×5分間洗浄し、ロッキング。 </li><li>製造業者の推奨に従って、LI-CORオデッセイCLxのを用いた膜と画像Studioソフトウェア（または同等の画像機器およびソフトウェア）の画像を取得する。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

ここで紹介する方法は、迅速な決定と酵母細胞内のタンパク質分解のための遺伝的要件の生化学的に確認することができます。これらの実験は、モデル真核生物として酵母の有用性とパワーを強調（処理するための酵母生物学およびプロトコルのコンピレーションのいくつかの優れたレビューは、保管、および酵母細胞を操作する（ 例えば 41-44）生物に新たな研究者のために?...

選択的なタンパク質分解は、真核生物の生活のために不可欠であり、変化したタンパク質分解は、数種類の癌、神経変性疾患、心血管疾患、および嚢胞性線維症1-5を含む医学的状態の数に寄与する。選択的なタンパク質分解を触媒するユビキチン-プロテアソーム系（UPS）は、これらの条件6-10のための新たな治療標的である。ユビキチンリガーゼは共有結合したタンパク質11に76アミノ酸ユビキチンのポリマーを添付してください。ポリユビキチン鎖でマークされたタンパク質は、12プロテアソーム 〜2.5メガダルトン26Sによって認識され、タンパク質分解されている。モデル真核生物サッカロミセス·セレビシエ （出芽酵母）で開始研究は、真核細胞におけるタンパク質分解メカニズムの解明における基礎となっている。 UPSの最初の実証生理的基質は、酵母転写抑制因子MATα213だった、UPSの14、および多くの高度に保存されたコンポーネントは、最初に同定されたか（ 例えば 15-26）酵母特徴。この汎用性と遺伝的に扱いやすいモデル生物で行われた発見は、ユビキチン媒介分解の保存されたメカニズムに重要な洞察を提供し続ける可能性が高い。 認識とほとんどのUPSの基質の分解は、複数のタンパク質の協調行動が必要です。したがって、与えられた不安定なタンパク質の調節された劣化を特徴付ける重要な目標は、タンパク質分解のための遺伝的要件を決定することです。哺乳動物または酵母細胞におけるタンパク質分解を監視するための古典的なアプローチ（ 例えば 、パルスチェイスとシクロヘキシミドチェイス実験27）は、面倒で時間がかかる。方法のこれらのタイプのタンパク質分解を検出するための高感度の手段を提供するが、それらは、タンパク質分解または大規模screeniの迅速な分析には適していないタンパク質分解を防ぐ突然変異についてngの。ここでは、不安定なタンパク質の分解のための遺伝的要件の迅速な同定のための酵母増殖に基​​づくアッセイが提示されている。 タンパク質分解を分析するための酵母の増殖に基づく方法では、対象（または劣化信号）の不安定なタンパク質は、特定の状況下での酵母の増殖に必要とされるタンパク質を、インフレームで融合されている。結果は、関心のある不安定なタンパク質のタンパク質分解の遺伝的要件を決定するための強力なツールとして機能することができる人工的な基質である。好都合なことに、最も一般的に使用される実験室酵母株は、特定のアミノ酸または窒素含有塩基（ 例えば、20,28-30）の生合成に関与する代謝酵素をコードする遺伝子における変異のパネルを保有する。これらの酵素は、合成酵素が参加する中で、外因的に提供代謝物の非存在下での細胞増殖のために必須である。このような代謝酵素は、従って、それらが融合されるため、不安定なタンパク質の分解のための増殖に基づくレポーターとして機能することができる。タンパク質分解を防ぐ変異が劣化レポーターを有する細胞が選択的条件下で成長することができますので、タンパク質分解のための遺伝的要件は容易に解明することができます。 増殖の利点は、特定の変異が、目的のタンパク質の存在量を増加させる間接的な指標である。しかし、直接生化学分析は、変異が増加したタンパク質のレベルを介してではなく、間接的または人為的な原因を経由して成長を可能することを確認する必要がある。タンパク質存在量における変異の効果を行い、特定の変異を保有しない細胞における定常状態タンパク質レベルのウェスタンブロット分析によって確認することができる。適した形態の酵母タンパク質（水酸化ナトリウムおよびサンプル緩衝液を用いて酵母細胞の逐次インキュベーション）の迅速かつ効率的に抽出するための方法ウェスタンブロッティングによる分析のためにも31を提示する。一緒に、これらの実験は、タンパク質分解の候補調節因子の迅速な同定を容易にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

安定化されたタンパク質分解は、事実上すべての細胞機能のために重要である。真核生物のタンパク質分解のための分子機構と遺伝的要件について知られていることの多くは、最初は出芽酵母に設立されました。タンパク質分解の古典の分析は、生化学的なパルスチェイスとシクロヘキシミドチェイスの方法論に依存してきた。これらの技術は、タンパク質の分解を観察するための高感度の方法を提供するが、それらは、面倒で時間がかかり、低スループットである。これらのアプローチは、タンパク質の分解を防ぐ変異についての迅速なまたは大規模なスクリーニングに適していない。ここでは、タンパク質分解のための遺伝的要件の容易な同定のための酵母の増殖に基づくアッセイが記載されている。このアッセイでは、特定の選択条件下で増殖に必要なレポーター酵素は不安定なタンパク質に融合される。細胞の内因性レポーター酵素を欠いているが、融合タンパク質を発現するセレ下で成長することができ融合タンパク質が安定化されるだけctive条件（ すなわちタンパク質分解が損なわれている場合）。ここに記載の増殖アッセイにおいて、野生型および融合タンパク質をコードするプラスミドを有する変異体酵母細胞の段階希釈物を選択的および非選択培地上にスポットされる。選択条件下で成長が所定の変異による分解障害と一致する。増加したタンパク質存在量は、生化学的に確認すべきである。電気泳動及びウエスタンブロッティングに適した形態の酵母タンパク質の迅速な抽出のための方法も示されている。生化学分析のためのタンパク質抽出のための単純なプロトコルと組み合わせたタンパク質の安定性のための成長ベースの読み出しは、タンパク質分解のための遺伝的要件の迅速な同定を容易にします。これらの技術は、短命の種々のタンパク質の分解を監視するように適合させることができる。示した例では、ヒスチジン生合成に必要とされるのHis3酵素は、融合したそれが異常に小胞体トランスロコンに係合後にDeg1に-Sec62。Deg1 -Sec62は分解の標的とされている。 Deg1 -Sec62-のHis3を保有する細胞は、タンパク質が安定した時に選択的条件下で増殖することができた。

この方法論を説明するために、のHis3酵素はモデル小胞体（ER）関連分解のカルボキシ末端に融合されている（ERAD）基板、Deg1 -Sec62（ 図2A）Deg1 -Sec62-のHis3を作成する（ 図3） 。Deg1 -Sec62はロコンとの永続的な、異常な関連付けを次のターゲットとしているERAD基質の新規クラスの創立メンバーを表し、ER膜32-34間でタンパク質を移動するため?...

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Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.6K ビュー.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で

増殖に基づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で