著者らは、ゼブラフィッシュの彼らのケアとメンテナンスのためにゼブラフィッシュの研究スタッフがFreimannライフサイエンスセンター、センターに感謝します。

1。再懸濁し、モルホリノ<ol><li>約3 mM溶液を作るためにヌクレアーゼ·フリー水100μlのにフルオレセイン-タグモルホリノ300 nMの希釈します。モルホリノソリューションは、複数のパラフィン封止マイクロチューブに分注し、室温で保存され、光源から離れています。 </li><li>正確なモルホリノ濃度を決定するために、0.1 N HClを95μlにモルホリノ溶液（または水空白など）の5μlを希釈する。水ブランクと265 nmでの分光光度計のベースラインを設定してから、希釈モルホリノソリューションのリーディングを決定します。 ng /μLの濃度を決定するために、その決定される定数で、希釈因子によるモルホリノ吸光度を乗算します。モルホリノ定数は次のように計算されますモルホリノ定数モルホリノX 1000/molarの吸光度=分子量。 モルホリノの分子量とモル吸光度 &quot;を見つけることができます製品に付属のオリゴのプロパティ &quot;シートが。mMの濃度を決定するために分子量によって、ng /μLの。モルホリノを希釈し、必要に応じて、作業濃度に、通常は1.2 mmで、モルホリノ濃度を分割します。 </li></ol> 2。フィンの切断<ol><li> Tricaineまたは水槽の水の1.0 mg / mlの2 - フェノキシエタノールのいずれかで大人のゼブラフィッシュを麻酔。 </li><li>第一lepidotrichial分岐点に近接し、滅菌メスまたはカミソリ刃を用いてフィンを切断。これは、各動物の同じ遠/近の場所（例えば7セグメント骨フィンガードルから遠位）で行われる必要があります。重要：動物の後方/前方平面に完全に垂直に切断することを確認してください。斜めカットは、フィンの背側と腹側の半分の不均一なフィンの突起になります。 </li><li>タンクに魚を返します。我々は一般的に33で魚を維持°C再生率を増加させる。 W、実験デザインに応じてモルホリノを導入する前に開始するためにフィン再生のためのAIT 0から2日後に切断（DPA）。代替アプローチは、下記のディスカッションで議論されています。 </li></ol> 3。モルホリノ注入<ol><li>前のモルホリノを注入するの日は、注入プレート（ 図2）を作る。マイクロインジェクションの手順のために魚を安定化させるだけでなく、次のいずれかの端にノッチをカットすることを確認します。 </li><li> DPA 2に、マイクロインジェクション装​​置及びモルホリノ溶液を調製。 </li><li> 5分間、適切な濃度（1.2 mMの始まることをお勧めします）と65°Cの水浴中で場所にフルオレセイン-タグモルホリノ希釈します。 </li><li>ニードルプラーを用いたマイクロインジェクション用ガラス針を引き抜きます。 </li><li>モルホリノがで針をロードする（注：お使いの針は、針が最初にロードする、または最初の先端を切るかどうかを判断しますあなたのバックフィルまたはフロントロードするかどうかによって異なります）。 </li><li>で、針の先端をカットオフn個の角。 </li><li>注射当たりモルホリノの約5 NLのバブルを注入するために、マイクロインジェクションシステムの指示に従ってください。モルホリノの大きなボリュームには、組織を混乱させる可能性があります。 </li><li>注入プレートの魚と場所を麻酔。すべての余分な液体と適切な場所に東洋の針を、骨の線（ 図3）だけ遠位を削除します。モルホリノ注射（特異的試薬の表を参照）に適した顕微鏡とマイクロインジェクション装置を用いて、 図3に示すように、後部に前方からフィンにモルホリノを注入します。注入時にロールアップする後部から前部の原因にフィン組織を注入し、非常に困難です。 </li><li>それぞれの骨の線にちょうど遠位再生組織（ 図3の&quot;1&quot;とマークされた）にそっと針を挿入して、芽（ 図3の&quot;2&quot;とマークされた）に配置されるまで、遠位に押します。バスを介して針を押してしないように注意してくださいタイヤのフィン。針が正しくロー​​カライズされている場合、（つまり1時間をクリックします）モルホリノを注入します。 1.2 mMとなるように、フルオレセイン-タグモルホリノソリューションは、さらに通常の光条件下で、黄緑色に表示されます。それぞれの注射で、モルホリノ液の黄色の &quot;パフ&quot;が可視化することができ、これは、芽に注射をローカライズするのに役立ちます。モルホリノ液の約75 NL（10-15クリック）は、骨の線ごとに注入する必要があります。一時停止〜クリックの間に1秒。私たちは、エレクトロポレーション専用コントロールとして腹を使用して、背側を注入します。あるいは、一つはフィンの腹側半分に制御モルホリノを使用して、この手順全体を繰り返すことができます。 </li></ol> 4。モルホリノのエレクトロポレーション<ol><li>直ちにモルホリノの注入後に、マイクロインジェクション装​​置から注入プレートを取り外します。魚が水没するまで、麻酔液でも注入プレートをご記入ください。エレクトロポレーションは、水行の下に実行されます。 </li> &lt;LI&gt; 3 mm径の白金板をピンセット電極（CUY 650-P3ピンセット、テック·インターナショナル）は、フィンの半分程度にパルスを局在化する。フィン組織に電極に触れないよう注意してください。電極がフィンの組織に触れていないことを確認するには、その背側の魚を回転させるとストレートエレクトロポレーションのための正中線を見下ろす。 </li><li>背と腹の両方をエレクトロポCUY21方形波エレクトロ（テック·インターナショナル株式会社）を使用して、フィンの側面（非特定のエレクトロポレーションの効果を制御する）。に形成されている可能性のある気泡を除去するために、各エレクトロポレーション後の湿ったキムワイプで電極を拭いてください。それらが削除されていない場合は、ミニ電荷が蓄積され、電極に向かって組織を誘致れる。エレクトロポレーションパラメータは、パルス間の1秒の一時停止と15 Vで、10個の連続した​​50ミリ秒のパルスに設定する必要があります。 </li><li> nに確認しながら、フィンをスライドガラスまたはペトリ皿に魚を置き、すぐに画像背側/腹側方向をOTE。このイメージは、次の日に再生分析のために使用されます。タンクに魚を返します。 </li></ol> 5。分析<ol><li>式の中でノックダウンされた標的タンパク質は、適切なフィンの再生に必要な場合は、フィンの背側と腹側の半分の間に劇的な違いが明らかでなければなりません1日後にエレクトロポレーション（ 図5B）。 </li><li> DPA 3では、それぞれの魚のひれの別の写真を撮ると、対応する2 DPAの画像（ 図5B）でこのイメージを一致させます。動物の間にフィンの色素沈着パターンの自然な変動は、あなたが正しく、個々の魚を識別することができます。 </li><li> NIH Imageを使用して、両方の背側と腹側の半分（ 図5B）の2 DPAと3 DPAエリアをトレースします。 </li><li> （ -背2dpa背3dpa）/（3dpa腹。 -背腹対の使用％の面積は次式を決定するには<html>腹2dpa）X 100 =％の面積</li></ol> 6。代表的な結果<ol><li>我々は常にDPA 3でフィンの伸長のためのアッセイ、または24 HPE（時間後にエレクトロポレーション）。この時点では、フルオレセイン-タグモルホリノはフィンの背側半分（ 補足図1および図6A）で存在しなければならない。それはいくつかの切断のレベルにまで、後続するのは正常です。 </li><li>コントロールmorpholinos（ 図6B）を注入し、エレクトロポレーションフィンの背腹両面に違いはありません。 </li><li>実験的なモルホリノはフィンの伸長に不可欠なタンパク質をターゲットにしている場合、背側と腹側との間の劇的な違いは、（ 図6C）観察されるべきである。 </li><li>電極は、エレクトロポレーション中にフィンに触れた場合、組織は茶色（ほとんど外観に焼け）や壊死を表示されます。 </li></ol>&quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。フィンの再生時に発生する各種イベントの模式図。各イベントの基礎となる時間が時間後に切断で与えられる（HPA）と33のタンクの温度に対応してい℃に<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> 図2。A.アガロースから作られ、モルホリノのマイクロインジェクションの間に魚を保持するための小さな井戸を含んでいる注入プレートの模式図。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> 図3。モルホリノインジェクションの模式図。A.は場所ノッチの魚の頭と皿の中で魚が魚が安定した滞在を助けるだけでなく、外のカット。B.低倍率では、針を配置しているので、それはフィンの再生組織が ​​近くにあります。C. </strongは&gt;高倍率では、各骨のフィン線（各芽内）から遠位モルホリノを注入します。針が骨の線（1）〜だけ遠位組織を入力して、芽（2）の場所に継続すべきである。注：回路図にある緑色の円が唯一の注射の場所を表示することになっています。モルホリノは、簡単に各注射後黄色/緑色の &quot;パフ&quot;として視覚化することができます。回路図に示すように、しかし、これは保持されません。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> 図4。フィンエレクトロポレーションの模式図。A.以下のマイクロインジェクション、麻酔の完全なペトリ皿に魚を置き、背側と腹側の両方の半分をエレクトロポ。B.はフィン組織には手を触れないようにしてください。電極は、組織から〜1ミリメートルを配置する必要があります。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt;図5フィンの伸長阻害を計算するために使用される方法の回路図。A.は直ちにモルホリノ注入とエレクトロポレーションの前または後に、DPA 2でそれぞれの魚のひれの写真を撮る。背側（緑）とNIH Imageを用いたフィンの腹側（青）の半分、（黒破線）の両方の再生組織をトレースします。B.は、DPA 3では、各フィンの別の写真を撮影して、再度背腹の領域をトレースするNIH Imageを用いて再生する。C.は、背腹両方持てる3 DPAでの合計再生から2 DPAでの再生の面積を減算します。背対腹再成長のパーセントの面積を式を用いて計算することができます：（（D 3dpa - D DPA 2）/（V 3dpa - V 2dpa））X 100。 ％阻害= 100 - パーセントエリア。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> 図6期待の例成果。フィンの背側半分にフルオレセイン-タグ制御モルホリノ、24時間後にエレクトロポレーション（HPE）を示すA.蛍光画像。背側半分に制御モルホリノを注入し、エレクトロポレーションされたフィンのB.明視野像。イメージは、フィンの背側と腹側の半分の両方の同じ再生、背側半分に実験的なモルホリノを注入し、エレクトロポレーションされたフィンの24 HPE℃ で明視野像を示す。イメージは、注入/背側の再生の阻害を示す。行は、モルホリノ注入、エレクトロ〜2 DPA、直前に再生量を示しています。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> 図7は創傷治癒や芽の形成に関与する標的タンパク質への代替注入、エレクトロポレーション手順の模式図。A.は、モルホリノを注入フィンの背側半分の各骨のフィン線の間に。B.は、通常どおりモルホリノをエレクトロポ。C.は、注射部位に（〜1骨質のセグメント）すぐに近フィンを切断。D.フルオレセインタグ付きモルホリノを観察することができる24 HPEでの創傷上皮と芽インチ<img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> 図8。傷上皮と芽の形成を対象とする技術を使用します。直前に切断に制御モルホリノを注入し、エレクトロポレートした24 hPaでフィンのA.明視野像。パネルA.注に示すように、フィンのB.蛍光画像フィンの注入された背側半分には、再生組織におけるモルホリノの良い摂取を示している。 C - パネルに示すように、フィンの背側半分のC &quot;高倍率AとBの注射部位は、多くの場合、まだ表示されている（矢頭）しかし、多くの標的細胞は、創傷の上皮芽の形成（矢印）に参加するために移行しています。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> 図9。芽。A.蛍光と背側と腹側半分の両方で注入し、モルホリノでエレクトロフィンを示す明視野はめ込み画像を形成するために移行する細胞を標的とする技術を使用します。フィンは、2つの平面で切断されました。背側半分は腹側半分は注射部位から遠位の9月10日骨のセグメントをカットされた場所として、注射部位のすぐ遠位切断した。B.は 24 hPaで、蛍光と明視野はめ込み画像は、モルホリノ背側に移行したことを示す（1）を再生成ではなく、腹側を再生成、（2）切断部位のすぐ近位のみ細胞が芽の形成に関与することを示しています。白い矢印の2つのセットは、それぞれの切断のレベルを表示する飛行機。パネルは、それぞれ、フィンの背側と腹側の半分の高倍率のビューを表示する画像の右端に1と2をマーク。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">補足図1。</a>注入と制御モルホリノでエレクトロフィンの芽の位置に対応する領域の焦点Z-スタックのビデオ。画像は24 HPEで撮影された。単一のフルオレセイン分子を可視化することができないので、すべてではないモルホリノの可視化や定量化することができます。ただし、これらのイメージは、個々の点状のドットから、蛍光モルホリノの完全な全体の細胞に、細胞内で可視化することができる吸収の度合いのいくつかのアイデアを与える。静止画では、方向が示されています。スケールバー：25ミクロンである。

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我々は、開示することは何もありません。

ここでは、成体ゼブラフィッシュのヒレ再生時に興味のある条件付きでノックダウンのタンパク質への強力な機能喪失のアプローチを説明します。この手法は、回生フィン伸長16、20-22の間にギャップ結合遺伝子、シグナル伝達受容体、転写因子、およびマイクロRNAを研究するために使用されています。 我々は、この技術はまた技術を適応することによって創傷治癒と芽の形成に必要な遺伝子を研究するために使用できることを期待しています。例えば、我々は注入し、前に切断します（ 図7）フィンの背側半分に骨の鰭の間の空間に制御モルホリノをエレクトロポレーション。次に、射出面に直ちに遠位フィンを切断。 24 HPAは、再生のこれらの初期段階で細胞もターグできることを示し、モルホリノ標的細胞が傷上皮と芽（ 図8）の両方を形成するために、遠位に移行したことを観察しeted。 テクニックはいくつか注目すべき制限があります。例えば、フルオレセインタグからの蛍光は、それが不可能な細胞内に存在するモルホリノの量と特定の細胞の表現型（すなわち、細胞増殖）と相関することができる免疫組織化学について、次の固定および処理を保持していません。前のグループは、フィンの組織23にDNAの正常なエレクトロポレーションを報告しましたが、加えて、我々は、一貫して再生尾びれにプラスミドのエレクトロポレーションを達成することができませんでした。最後に、我々はモルホリノだけ新しい細胞型の分化に関与する遺伝子をテストするために、現在の形でこのテクニックを使用して禁止している〜48時間後にエレクトロ21日に有効であることを指摘している。手順の追加のテストおよび修正は、これらの現在の限界を克服することができます。 また、この手法が使用される可能性がある基本的な組織からの芽への細胞遊走に関与するタンパク質をテストすることができます。たとえば、我々は、注入され、切断する前にフィンの両側（ 図7参照）に制御モルホリノをエレクトロポレーション。次に、射出面に直ちに遠位フィンの背側半分を切断し、我々ははるかに遠位に腹びれを切断。 24 hPaで、背側モルホリノ-陽性細胞は注射部位から覆う傷上皮と芽に移行しました。しかし、それは腹側（ 図9）のケースではなかった。これは、切断面を貫く唯一の細胞は再生応答に関与するという考えをサポートしています。これらのデータはまた、細胞移動に必要であることが仮説を立てたタンパク質は、この手法を使ってテストすることが示唆された。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> CUY21-EDITまたはCUY21-SC方形波エレクトロ</td><td>テックインターナショナル</td><td> CUY21EDITまたはCUY21SC </td><td>両方のユニットは、このプロトコルのために働く</td></tr><tr><td> 3 mm径のパドル電極</td><td>テックインターナショナル</td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td>モルホリノ</td><td> GeneTools、LLC </td><td></td><td>モルホリノは、目的のタンパク質にカスタム設計する必要があります</td></tr><tr><td> 2 - フェノキシエタノール</td><td>シグマ</td><td> 77861-1L </td><td>麻酔、手順については、魚系の水で希釈1:1000、安楽死のために1:500 </td></tr><tr><td>マイクロinjectiポンプの</td><td>世界の精密機器</td><td> PV830空気圧PicoPump </td><td>多くの異なるマイクロインジェクションシステムが使用することができる。 </td></tr><tr><td>マイクロマニピュレータ</td><td>世界の精密機器</td><td> MMJR </td><td>右利き（左利きのためのMMJL） </td></tr><tr><td>マイクロ注射針、外径1.0ミリメートル</td><td>世界の精密機器</td><td> 1B100F-4 </td><td>これらは、針に引き込まホウケイ酸ガラス毛細管であり、 </td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>世界の精密機器</td><td> 5430-ALL </td><td>ピコノズルキット、はめ込み1.0ミリメートルピペットガスケットに確認してください</td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>サッター</td><td> P-97 </td><td>他のマイクロピペット/針引き手でも動作するはずです</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ、ニコン、ツァイスの</td><td>数はメーカーによって異なります</td><td> 20X光学を持つ任意の実体顕微鏡とマニピュレーターを操作する能力</td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

urodelesと硬骨魚の特定の種がその組織を再生成することができます。ゼブラフィッシュは、このような心1、網膜2脊髄3、視神経4、感覚有毛細胞5、フィン6として、成体組織の自発的な再生を研究するために広く使われているモデルとなっています。 ゼブラフィッシュフィンを簡単に付加形成に複数の段階を研究するために操作される比較的単純な付属品です。創傷治癒、芽の形成、およびフィンの伸長：古典的には、フィンの再生は、3つの異なる段階で特徴付けられた。フィンの一部を切断するした後、周囲の上皮は増殖および創傷を介して移行されます。 33℃で、このプロセスは、6,7（HPA、 図1B）6時間後に切断以内に発生します。別の系統から、次の、基礎となる細胞（例：骨、血、グリア、線維芽細胞）の増殖芽を形成するために細胞周期を再入力し、Wを覆う表皮は（ 図1D）8 を増殖し続けてhile。芽の基部の細胞が新たな組織（ 図1E）8 を形成するために、それぞれの系統に再分化するように副産物が発生します。切断のレベルに応じて、完全な再生は月に一週間で完了します。 Wntシグナル、HOX、FGF、MSX、レチノイン酸、SHH、ノッチ、BMP、およびアクチビン-β遺伝子を含む遺伝子ファミリー、多数の式は、フィンの再生9-16特定の段階でアップレギュレートされています。しかし、再生時にこれらの遺伝子とその符号化されたタンパク質の役割は、タンパク質に特異的な阻害剤が13存在しない限り、野生型タンパク質または支配を、温度感受性変異体が存在するか、またはトランスジェニック動物（いずれかを過剰発現し、評価することは困難であった陰性蛋白質）は7,12を生成されました。我々develoPED迅速かつ容易にフィン再生中の任意の遺伝子の機能をテストするための逆遺伝学的手法。 モルフォリノオリゴヌクレオチドは、広くゼブラフィッシュ、 アフリカツメガエル 、ニワトリ、マウス開発17から19の間に特定のタンパク質の損失を勉強するために使用されます。ブロックはpre-mRNAのスプライシングやmRNAの翻訳のいずれかに相補的なRNA配列を持つMorpholinosの塩基対。我々は効率的に標的タンパク質のノックダウン式に再生ゼブラフィッシュフィンにフルオレセイン-タグセンスmorpholinosを導入する方法について説明します。モルホリノは再生ゼブラフィッシュテールフィンの各芽にマイクロ注入し、周囲の細胞にエレクトロポレーションされています。フルオレセインは、モルホリノをエレクトロポし、フィン組織のモルホリノを可視化するために電荷を提供します。 このプロトコルは、回生フィンの伸長中に特定のタンパク質の役割を調べるために、条件付きタンパク質のノックダウンを可能にします。 Discussioでnは、我々は、このアプローチは、創傷治癒や芽の形成と同様に、芽の形成時の細胞移動の潜在的なマーカーの間に特定のタンパク質の役割を研究するために適応させることができる方法について説明します。

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

我々は条件付きで大人のゼブラフィッシュヒレ再生時の標的タンパク質の発現をノックダウンする方法を説明します。この手法は、マイクロ注入と創傷治癒、芽の形成、再生伸長を含むフィン再生の様々な段階におけるタンパク質の役割をテストすることができ、フィン組織にアンチセンスオリゴヌクレオチドmorpholinosをelectroporatingが含まれます。

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

in-vivo-electroporation-morpholinos-into-regenerating-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.8K ビュー.  University of Notre Dame. 我々は条件付きで大人のゼブラフィッシュヒレ再生時の標的タンパク質の発現をノックダウンする方法を説明します。この手法は、マイクロ注入と創傷治癒、芽の形成、再生伸長を含むフィン再生の様々な段階におけるタンパク質の役割をテストすることができ、フィン組織にアンチセンスオリゴヌクレオチドmorpholinosをelectroporatingが含まれます。

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...