このプロトコルは、ゼブラフィッシュ・テレンセファロン内の個々のエペンディモグリア細胞の標識を可能にし、長期モニタリングを可能にし、細胞自律的な方法で特定の経路を操作することを可能にする。この技術の主な利点は、単一細胞標識を迅速かつ効率的な方法で行うだけでなく、遺伝子編集およびシグナル伝達経路操作を細胞自律的に行うことができる点である。この方法により、細胞の剥離、上皮恒常性の維持、細胞分裂の対称性など、細胞生物学の基本的な問題を調査することができます。
まず、針を引く装置を使用して、ガラスの毛細血管を準備します。マイクロローダーのヒントを使用して、調製したガラスキャピラリーを10マイクロリットルのプラスミド溶液で満たします。次に、注射装置のメニュー変更毛細管」を押して、針を針ホルダーに積み込むことができます。
次に、注射装置を毛細管の変更から注入モードに切り替えます。次に、4倍の倍率で実体顕微鏡を用い、フィンデン鉗子とし、毛細血管の先端のみを切断する。その後、フットペダルに圧力をかけ、プラスミド溶液が妨げなく針から簡単に出て行くことを確認します。
針の準備ができたら、ゼブラフィッシュを畜産タンクから麻酔液の容器に移します。そして、エラの動きが治まるまで数分待ちます。鎮静した魚の後ろ側を天体顕微鏡の下で濡らしたスポンジの上に押し上げ、40ミリメートルの刃先と0.5ミリメートルの厚さのステンレス鋼の解剖マイクロナイフを使用して、眼圧テクタムの境界のすぐ隣にあるテレンセバロンの後部にある魚の頭蓋骨に小さな穴を慎重に作成します。
必要に応じて魚を傾け、穴を通して毛細血管の先端の浸透を容易にするために、正しい角度で頭蓋骨に向けてガラスの毛細血管の先端を向けます。次に、毛細管の先端を細孔に慎重に挿入し、末端細胞層を通して、テレンスファルクタル心室に到達するまで、約10秒間フットペダルに圧力をかけて約1マイクロリットルのプラスミド溶液を送達する。分娩の成功は、心室全体に緑色の液体の広がりを観察することによって確認することができる。
少量の超音波ゲルで魚のテレンスファルンをカバーします。プラスミド注入動物のエレクトロポレーションの場合、射出セットアップからスポンジを取り出し、電気チップの内側を超音波ゲルに浸します。電極の間に魚の頭部を配置し、正極を頭部の腹側に、負極を後側に置く。
次に、魚の体をスポンジに保持しながら、電極をテレンセバロンに対して穏やかに正確に押し付け、フットペダルで電流を管理し、5つのパルスがすべて終了するまで電極を所定の位置に保持します。エレクトロポレーションが成功した場合、単一のエペンディモーリアル細胞に標識されたプラスミドは、非プラスミド標識されたエペンディモーリアル細胞の中で観察され得る。エレクトロポレーションプロセスの効率に応じて、より多くのまたはより少ない数のエペンディモリアル細胞が標識され得る。
それにもかかわらず、実証されたプロトコルは、以前に公開されたプロトコルよりも多くのラベル付きセルを生成します。標識された細胞の最も高い密度は、注入されたプラスミド液体が半球間に分配する方法のために、主に両方の半球の内側の心室側に出現する傾向があることに注意してください。このビデオでは、ゼブラフィッシュのテレンセファロンの1つの半球が3Dで提示され、ラジオプロセスを有するエピデンディモリア細胞が側面から観察されるとマゼンタにある。
核を標識する別のプラスミドとの共エレクトロポレーションを通して、エペンディモグリア細胞の細胞分裂が観察される。エレクトロポレーションが失敗すると、非常に低い数または標識されたエペンディモリア細胞が生じなくなる。しかし、後末の細胞は、標識される可能性が最も高い。
彼らの相腫は立方体においてより大きく、彼らは、エペンディモリア細胞層の側面図から明らかなように、ラジオ細長いプロセスを持っていません。tdTomato-mem標識細胞は、最も可能性の高いエペンディマル細胞であり、これはエペンディモリアの層の上に位置する。これに対し、個々のエペンドミオグリア細胞にプラスミドを発現するtdTomato-memを導入すると、初期細胞標識に加えてtdTomato-mem発現が生じる。
覚えておくべき最も重要なことは、毛細血管の先端だけを切断し、液体が心室全体に広がるように注入しながら、上層を貫通することです。この技術は、生体内イメージングを通じて単一のエペンディモリア細胞の長期的なモニタリングを可能にし、したがって、脳再生ならびにその広大な生体内遺伝的リンクにおけるその役割を確立する。
