この作品は、バーゼル大学、生物医学科、スイス国立科学財団（31003A-116624）によってサポートされていました。

1。器官小脳スライス培養をセットアップする小脳スライス培養を静的インキュベーション法10を用いて、生後8日目P（8）仔マウスから調製される。私たちの研究室では、B6CF1マウスを使用しています。いくつかの実験では、トランスジェニックマウスは、プルキンエ細胞で選択的にEGFPを発現するために使用された。スライス培養物の調製は、6仔マウスのくずのためにマウス子犬、すなわち3時間ごとに約30分かかります。すべての手順は、滅菌手術器械を持つ層流ベンチで無菌条件下で行われる。 <ol><li> P8の仔マウスの小脳は実体顕微鏡を用いて氷冷調製培地（グルタ1:100含むMEM（Gibco社製商品番号11012）は、pH 7.3）中に脳から解剖されています。 </li><li>小脳はマッキルウェーン組織チョッパーを用いて矢状方向に350μmの厚さのスライスにカットされます。 </li><li>スライスは、ミリポア細胞培養インサート（approx.6スライスに配置されている挿入、ミリポアPICM03050当たりs）と0.75ミリリットルウェルあたりのインキュベーション培地（48.35ミリリットル、MEM、25ミリリットルイーグル培地、25ミリリットルウマ血清、1ミリリットルグルタ私、滅菌10％グルコース、0.65 mlで6ウェルプレート中でインキュベートされる37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下で溶液、pH 7.3）℃すべての組織培養試薬は、Gibco、Invitrogen社からのものであった。 </li><li>薬理学的治療は、通常、培地に所望の濃度で薬剤を追加することにより、in vitroでの3日間（DIV3）で開始されます。ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）および（RS）-3,5 - ジヒドロキシ（DHPG）はTocris、英国からのものであった。多くの薬は、原液を調製するためのDMSOまたはエタノールの使用を必要とするので（例えばPMA）の世話を培養培地に添加し、溶媒の合計量（ウェルあたり7.5μl）の1％を超えないように注意する必要があります。薬は、培地ごとに2 回または3日目の変化と一緒に更新されます。 </li></ol> 2。固定とImmunos器官小脳スライス培養の寧小脳の重要な利点は、抗体が特異的にかつ明るく校長小脳ニューロン、すなわちプルキンエ細胞と顆粒細胞を染色することが可能であることです。プルキンエ細胞の樹枝状形態は、抗カルビンジンD28Kを用いた免疫染色によって明らかにすることができる。 <ol><li>文化の定着のために、培地を除去し、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中冷4％パラホルムアルデヒド3mlをよく膜に付着した小脳スライスでMillicell挿入物を含むにつき慎重に追加されます。次に、培養物を固定液を除去し、培養物はリン酸緩衝液ですすぎ、一晩固定されています。 </li><li>以下の抗体を免疫染色に使用されます：選択してプルキンエ細胞とモノクローナル抗NeuNを可視化するための1:1000でウサギ抗カルビンジンD-28K（Swant、ベリンツォーナ、スイス）（ケミコン、Millipore）を1:500に選択的granuを可視化するためのル·セル12。ウサギ抗GFPはアブカム、英国からのものであった。蛍光二次抗体Alexaのは、Molecular Probes、Invitrogen社からのものであった。 </li><li>培養物は、0.1 Mリン酸緩衝液（ブロッキング溶液）で3％正常ヤギ血清+0.3％トライトンX100を追加することで、透過処理とブロックされます。抗カルビンジンD28Kと抗NeuNをブロッキング溶液で希釈し、培養物をわずかに攪拌下で一晩4℃の抗体を含むブロッキング溶液でインキュベートする。全ての希釈は、％（v / v）のように示されており、トリトンX100、ピペッティングを容易にするために、10％の原液から取られます。 </li><li>培養物を、0.1 Mリン酸緩衝液で3回リンスしてから、適切な二次抗体、例えばヤギ抗ウサギアレクサ568およびヤギ抗マウスアレクサ488とインキュベートすると、+0.1％トライトンX100で2時間0.1Mリン酸緩衝液で1:500に希釈室温。次に、培養物を0.1Mリン酸緩衝液で3回洗浄する。 </li><li>染色された切片を培養物から除去されよく絵筆ととSuperfrostプラスガラススライド上にマウントされており、適切な取り付け媒体、例えばMOWIOLで封入。文化は今落射蛍光装置との定期的な顕微鏡や共焦点顕微鏡を使用して確認できます。 </li></ol> 3。器官スライス培養における個々のプルキンエ細胞の観察<ol><li>カルビンジンD28Kで免疫染色した後、プルキンエ細胞の完全な細胞質が明るく樹状突起と軸索を含む染色される。プルキンエ細胞層のプルキンエ細胞の高密度配置のために、ほとんどのプルキンエ細胞の樹状アーバーは、それが困難な1個々のセルの完全なあずまやを勉強することがオーバーラップしています。しかし、準備プロセス中にいくつかのプルキンエ細胞の細胞死が原因で、多くの文化で、一部の地域では、プルキンエ細胞の減少した密度で存在している。そのような地域では、他のCと重ならない完全な樹状あずまやとプルキンエ細胞を見つけることが可能ですells。これらの細胞は、樹状アーバはゴルジ染色に匹敵する品質で表示および分析することができます。小脳プルキンエ細胞はカルビンジンD28Kを表現する唯一の細胞型であるため、細胞はまた、プルキンエ細胞として同定されています。 </li><li>代替方法はB6由来培養を使用することです。FVB-TG（Pcp2-EGFP）146.244Yuza / Jマウス（ここPcp2-EGFPマウスと呼ばれる、ジャクソン研究所から入手可能）は、プルキンエ細胞特異的L7プロモーター11の下でEGFPを発現する。プルキンエ細胞を生きたような切片培養におけるEGFPの発現によって可視化することができる。それは時間をかけて、単一細胞の樹枝状形態をフォローすることも可能です。あるいは、固定後、EGFP発現プルキンエ細胞は抗GFP抗体を用いて免疫染色することができます。どちらの方法でも、器官培養ではプルキンエ細胞の樹状突起、細胞体と軸索を染色するのに適しています。 Pcp2-EGFPマウスのL7プロモーターはすべてのプルキンエ細胞で発現し、vがありますされていないため、マウス（Kapfhammer、データは示さず）との間のプルキンエ細胞を発現の頻度でariationsは、これらのマウス由来の文化は、簡単に他のプルキンエ細胞の樹状突起の木と重なって樹木を持ってプルキンエ細胞を可視化し、測定するために作るスライス。樹木をオーバーラップさせて、隣接するプルキンエ細胞がGFPを発現する（ 図1A、B）がいないとき、そのような樹の木は、個別に表示することができます。 </li></ol> 4。プルキンエ細胞の樹状ツリーのサイズと分岐点の測定<ol><li>樹状突起の大きさ。木は他の細胞と重複されていない場合はプルキンエ細胞の蛍光標識で指定された細胞の樹状突起の大きさを容易に測定することができます。カルビンジン免疫染色のラベルすべてのプルキンエ細胞なので、非重複樹木と細胞を同定することは困難である。この場合Pcp2-EGFPの使用は十分プルキンエ細胞の識別を簡単にすることをお勧めします非重複樹木とsである。非重複樹状突起とのプルキンエ細胞が同定されれば、20倍レンズを使用して表示され、画像は、デジタルカメラで記録されます。この画像は、画像解析プログラムを用いて解析することができます。我々は、モード（ 図2A）を測定することで、魔法の杖ツールを使用して、マウスのシングルクリックでセルの樹状突起の輪郭を描くことができますイメージプロプラスを使用しています。次に、プログラムは、樹状突起で覆われた領域を計算して、MS Excelにエクスポートします。データの統計解析は、GraphPad Prismソフトウェア（下記参照）を使って行われます。 </li><li>分岐点の数。プルキンエ細胞樹状突起の分岐点の高度に分岐したと微細形態学のために手動でカウントする必要があります。プルキンエ細胞の20倍の画像ファイルは、Adobe Photoshopを使用して画面の大部分を覆うように拡大表示されます。その後、すべての分岐点を数え、明るいドット（ 図2B）が付いています。 </li></ol> 培養期間中にプルキンエ細胞の樹状ツリーの開発を監視 プルキンエ細胞に特異的にEGFPを発現するPcp2-EGFPマウス由来の器官切片培養は、培養中の数日間の間に個々の細胞の形態を検討することができます。この方法では培養期間中に樹状突起の成長と発展はうまく文書化することができます。リビング同定プルキンエ細胞が10倍を目的とした培養期間中のすべての2 番目または3日目を撮影した。この低消費電力の目標は蛍光灯の照明に起因する細胞への光毒性のダメージを回避し、最小化するために選ばれました。 図3は、生活文化で撮影プルキンエ細胞の2つの例を示します。最初のセルは、 インビトロ （ 図3、AC） で 7日まで、in vitroでの2日前から続いていた。ことは明らかであるdendritiこの期間中にこのセルのc​​のツリーには、いくつかの新しい枝を成長さや大きさが拡大します。二番目の例では、プルキンエ細胞は 、in vitro で 4から11日間（ 図3、DF）から続いていた。 DIV4に存在小さな樹の木は、この期間中に大幅に拡大します。どちらの例でも、培養期間の終わりに存在するプルキンエ細胞の樹状突起のほとんどは確かに文化の中で成長しましたことを示している。 プルキンエ細胞の樹状ツリーの開発はPKCかmGluR1刺激によって抑制される 器官小脳スライス培養を11日間培養した。文化が固定されるまで、in vitroでの2日目から開始して、文化の一部をPMA（50 nM）を、PKCまたはDHPG（10μM）、mGluR1アゴニストを刺 ​​激ホルボールエステルのいずれかで処理した。両方の化合物は、プルキンエ細胞の樹状突起の成長7,8,9、5を阻害したり、制限することが以前に示されている。未処理の対照でスライスプルキンエ細胞は抗GFP（ 図4D）を用いた免疫染色により、抗カルビンジン免疫染色（ 図4A）またはEGFP発現プルキンエ細胞と培養液のいずれかで可視化した典型的な大規模かつ高度に分岐した樹状突起を開発しました。 PMAで処理した培養では樹状突起の形態が大いに変化した。樹状突起は肥厚登場し、ほんの短い側枝を持っていた。多くのプルキンエ細胞は、対照培養物とは異なり、1つの一次樹状突起は、細胞体から発せられると、もはやユニポーラなかったが、2つあるいはそれ以上の一次樹状突起（ 図4B、E）を開発しました。樹状突起で覆われて領土は著しく（下記参照）を削減しました。同様の状況がDHPG処理培養物中に存在していた。プルキンエ細胞の樹状突起が大幅にサイズが縮小され、分岐が著しく（ 図4C、F）は減少した。しかし、いくつかのqualitatもあったアイブの違いは、PMA処理した培養物と比較した。そこに樹枝状のない肥厚がありませんでしたが、一次樹状突起は、シグナリングイベントは似ていますが、まったく同じではないかもしれませんPMAとDHPG処理したプルキンエ細胞で起こっていることを示唆している（ 図4C、F）は、多くの非常に短い二次樹状突起を運んだ。 上記のように定量的に評価するプルキンエ細胞樹状突起の大きさや分岐点の定量的評価は 、プルキンエ細胞の樹状ツリーとプルキンエ細胞当たりの分岐点の数の大きさを測定する。少なくとも3つの独立した実験の結果は、一緒にプールし、20セルの最小値は、分析する必要がありますされています。対照実験のために樹の木々に覆われた面積の平均を求め、100％として設定し、他の実験の値はそれに応じてパーセント値として表現さ​​れています。データの統計解析は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して行われます。我々にはありませんので決定されたすべての値がガウス分布の一部であることを前提として、我々は、測定値のような分布を仮定しない統計的検定を使用しています。統計的有意性のために複数の条件やテストを比較するために、我々はをGraphPad Prismでダンのポストテストで実装され、例えば、としてランクベースの統計のための事後テストのための適切な手順に続いてKruskal-Wallis検定を使用しています。結果は通常、棒グラフとして表示しております。このような統計的評価の例を図5に示されている。樹状突起の大きさを分析した（ 図5A）とプルキンエ細胞あたりの分岐点（ 図5B）の数の両方が制御条件とDHPGまたはPMA治療の間に明確な違いを示しています。両方のパラメータは、Kruskal-Wallis検定によるp &lt;0.001の有意に異なっていた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> ふぃぎゅRE 1。プルキンエ細胞のEGFP標識。 Pcp2-EGFPマウスではないすべてのプルキンエ細胞がEGFP。したがって、一部のプルキンエ細胞の樹状突起の木が（正、に示すようにEGFPチャンネルに負の示す抗カルビンジン染色で、彼らは急行EGFP（におけるEGFPチャネル）と樹木が重なっている隣接するプルキンエ細胞にはないときに個別に表示することができますBの赤のチャネル）。スケールバー=50μmである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> 図2。プルキンエ細胞の樹状パラメータの測定。（）。樹状突起の大きさは、簡単に画像解析ソフトウェアイメージProでマウスのシングルクリックでプルキンエ細胞の輪郭をトレースに加えて、魔法の杖ツールを用いて測定することができる。魔法の杖ツールは細胞体と樹状突起の枝すべてを含む全体の樹状突起が完全に線で囲っていることなどのために使用されます。 （B）である。分岐点の数は、カップですプルキンエ細胞の画像を手動でnted。すべての分岐点は、黄色のドットが付いています。スケールバー=50μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> 図3モニタリングプルキンエ細胞の樹状ツリーの開発。識別プルキンエ細胞は、樹状突起の成長を監視するために繰り返し撮影した。 （AC）：DIV7まで試験管 （DIV）の2日目からの成長と発展プルキンエ細胞の樹状突起。この培養期間中の樹状突起の持続的な成長と分岐があります。 （DF）：プルキンエ細胞の樹状突起がDIV11までDIV4から成長と発展。樹状突起は、この培養期間中に大幅に拡大します。スケールバー=50μmである。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> 図4。プルキンエ細胞の樹状ツリーの開発はPKCかmGluR1 stimulatiによって阻害される上の（）、（D）。よく発達した樹状ツリーで処理されていないコントロール細胞。 （B）、（E）：PMA処理デンドライトの9日後肥厚表示され、樹状突起が強く大きさが小さくなる。細胞は、しばしば、その偏光を失い、バイポーラ（E）になります。 （C）、（F）：DHPG治療の9日後に樹状突起を大幅にサイズが小さくなる。 PMA処理とは異なり、多くの非常に微細で短い側枝は、プライマリとセカンダリの樹状突起上に存在している。細胞は、しばしば、その偏光を失い、バイポーラ（F）になります。 （F - D）にPcp2-EGFPマウス由来の培養物中の - （C）とEGFPの発現によってプルキンエ細胞は、中の抗カルビンジン免疫染色により可視化した。スケールバー=50μmである。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> 図5。プルキンエ細胞の樹状ツリーのサイズと分岐。定量測定をの定量的な評価を見ると、樹状突起の大きさ（上部のバーグラフ）とnumbe両方分岐点（下の棒グラフ）のrは大きくPMAまたはDHPG治療後に減少しています。処理された培養物から制御樹の木とプルキンエ細胞の樹状ツリー間の相違は、p &lt;0.001と有意であった。

<ol>
	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

動物実験は、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して実施された、スイス当局が検討し、許可された。著者らは、開示することは何もない。

方法は器官小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞樹状突起の発達を研究するためにかつ定量的に樹状突起の大きさや樹状分岐点の数を測定することにより、プルキンエ細胞の樹状突起の拡大を評価することを可能にするここで提示。もちろん、プルキンエ細胞の樹状突起のより広範かつ洗練された定量的な分析は、総樹枝の長さを決定するSholl分析を実行したり、樹状突起のフラクタル?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>組織培養インサート</td><td>ミリポア</td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> PICMORG50インサートは低いリムを持ち、顕微鏡でライブ文化の閲覧を許可</td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス1 </td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td>基底Medumイーグル</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td> Gibco社、Invitrogen社</td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td>ホルボール12 - myristaTE 13 - アセテート（PMA） </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> （RS）-3,5 - ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG） </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗カルビンジンD-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td>抗NeuN、クローンA60 </td><td>ケミコン、ミリポア</td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗GFP </td><td>アブカム</td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

彼らは矢状面で厳密に指向していて、小型げっ歯類で生後3期間で主に開発して印象的な樹の木を持っているので、プルキンエ細胞は、樹状突起発達を研究するための魅力的なモデル系である。さらに、いくつかの抗体が選択的かつ集中的に抗カルビンジンD28Kは、最も広く使用されている状態で、すべてのプロセスを含むプルキンエ細胞を標識が利用可能である。生きた細胞内で樹状突起の閲覧については、プルキンエ細胞11に選択的にEGFPを発現するマウスはジャクソンラボを介して利用できます。プルキンエ細胞の樹状ツリーの樹拡大のほとんどが実際に培養期間4中に行われているため器官小脳スライス培養細胞はプルキンエ細胞の樹状突起の開発を容易に実験的な操作を可能にする。我々はここでorganotypiで栽培プルキンエ細胞の樹状形態を表示および分析するための短い、確実かつ簡便なプロトコルを提示C小脳スライス培養。多くの目的のために、プルキンエ細胞の樹状ツリーの定量的な評価が望ましい。私たちは迅速かつ容易に抗カルビンジンステンド小脳スライス培養から決定することができる2つのパラメータ、樹状突起の大きさと分岐点の番号、に焦点を絞ります。これらの2つのパラメータは、プルキンエ細胞の樹状ツリーの変化の信頼性と敏感な指標を得ることができます。プロテインキナーゼC（PKC）活性PMAおよび代謝型グルタミン酸受容体1（mGluR1）と治療法の例を用いて、我々は樹状突起発達の違いを可視化し、定量的に評価される方法を示しています。豊富な樹木の存在の組み合わせ、選択的かつ強烈な免疫染色​​法、樹枝状のメカニズムを明らかにするためのプルキンエ細胞を作る強力なモデルシステムプルキンエ細胞特異的にEGFP発現と樹枝状成長とマウスモデルの期間をカバーする器官切片培養発展。

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

私たちは、器官小脳スライス培養で増殖させ、個々のプルキンエ細胞の樹状突起の形態を表示して、定量的にロバにすることを可能にするプロトコルを提示。このプロトコルは、プルキンエ細胞の樹状突起の発達のメカニズムに関する研究を推進することを意図している。

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.4K ビュー.  University of Basel. 私たちは、器官小脳スライス培養で増殖させ、個々のプルキンエ細胞の樹状突起の形態を表示して、定量的にロバにすることを可能にするプロトコルを提示。このプロトコルは、プルキンエ細胞の樹状突起の発達のメカニズムに関する研究を推進することを意図している。

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

神経科学

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

器官小脳文化：アポトーシス課題と検出

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.